Name: Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Leer hoe u adipose voorlopercellen isoleert uit muis epididymale vetweefsels met FACS voor single-cell RNA-sequencing. Deze methode garandeert hoge viabiliteit en zuiverheid voor gevoelige downstream analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen de Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility voor hulp bij FACS-sortering.

Alle proefprocedures voor dieren werden uitgevoerd onder goedkeuring van de Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Oplossingsvoorbereiding 
<ol><li>Bereid collagenase 2% (w/v) oplossing door collagenase II 2 g in 100 ml Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) op te lossen. Aliquot 200 μL per stuk voor elk gebruik.</li>
	<li>Bereid neutralisatiemedium voor door 84 ml F-12 medium, 15 ml paardenserum en 1 ml penicilline/streptomycine te mengen.</li>
	<li>Bereid flowcytometriebuffer voor door 500 mg runderserumalbumine (BSA) en 400 μL 0,5 M EDTA op te lossen in 100 ml van Dulbecco's fosfaatbuffered zoutoplossing (DPBS).</li>
</ol>2. Dissectie van epididymale vetkussen en weefseldissociatie
<ol><li>Euthanaseer op humane wijze (isofluraan/cervicale dislocatie) één mannelijke muis. In dit protocol werd een vier maanden oude FVB-muis gebruikt.</li>
	<li>Breng 70% ethanol aan op de buik en stel de onderbuikholte bloot met een schone schaar en tang.</li>
	<li>Zoek epididymaal vetkussen (proximaal/bevestigd aan teelballen). Houd de verbinding tussen teelballen en epididymale vetkussen met stompe tang en trek voorzichtig om de epididymale vet pad te bevrijden.</li>
	<li>Verwijder teelballen door te snijden met een schaar en incubeer epididymaal vetkussen in 5 ml HBSS aangevuld met 3% BSA in een conische buis van 50 ml bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Centrifugeren bij 150 x g gedurende 7 min bij 4 °C.</li>
	<li>Neem drijvende epididymale vet pad uit de 50 ml conische buis en fijngehakt het weefsel met behulp van schone schaar.</li>
	<li>Voeg 200 μL collagenase 2% oplossing toe aan 3,8 ml HBSS in een 13 ml kweekbuis. Voeg het gehaktweefsel toe en incub in een roterende incubator bij 5 tpm gedurende 1 uur bij 37 °C. In plaats van een roterende incubator kan celkweekincubator bij 37 °C als alternatief worden gebruikt bij incidentele agitaties.</li>
	<li>Breng de volledige inhoud over in een conische buis van 50 ml en voeg 10 ml neutralisatiemedium toe. Meng voorzichtig door de buis 2-3 keer om te keren.</li>
	<li>Bereid nog een conische buis van 50 ml met een celzeef van 70 μm. Filtreer het verteerd weefsel in de nieuwe buis met behulp van de celzeef.</li>
	<li>Breng de doorstroming over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C op 350 x g.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de supernatant en resuspend celkorrels met 5 ml DPBS. Centrifugeren bij 350 x g gedurende 10 min bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg 50 μL flowcytometriebuffer toe. Meng goed door zachtjes te pipetten en houd cellen op ijs. Vanwege het volume van de celpellets en de kleine hoeveelheid restsupernatant zal het totale volume cellen in de stromingscytometriebuffer groter zijn dan 50 μL (ongeveer 100 μL).</li>
</ol>3. Antilichaametikettering en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS)
<ol><li>Breng na het goed mengen van de cellen met zachte pipetting 54 μL van de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,7 ml. Voeg 6 μL FcR-blokkerend reagens toe en meng goed door zachtjes te pipetten. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bewaar eventuele overgebleven cellen na het innemen van 54 μL en bewaar ze in het ijs om te gebruiken als een onbevlekte controle in stap 3.5 en stap 3.6.</li>
	<li>Bereid tijdens de incubatie in stap 3.1 een antilichaamcocktail door 11 μL elk anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC en anti-CD45-FITC-antilichamen in een microcentrifugebuis te combineren. Meng goed door zacht pipetten en houd op ijs beschermd tegen licht.</li>
	<li>Voeg na incubatie met FcR-blokkerend reagens gedurende 10 minuten 40 μL van de antilichaamcocktail toe en meng goed door zacht pipetten. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Voeg 500 μL flowcytometriebuffer aangevuld met 1 μg/ml DAPI toe aan de bevlekte cellen. Meng goed door cellen zachtjes te pipetten en te filteren met behulp van een 5 ml reageerbuis met cell zeef snap cap. Houd cellen in het ijs.</li>
	<li>Voeg in stap 3.1 500 μL flowcytometriebuffer toe aan de resterende cellen en meng goed door zacht te pipetten. Filter cellen met behulp van een 5 ml reageerbuis met cell zeef snap cap. Houd deze cellen in het ijs en gebruik als een niet-vastgehouden controle in de volgende stap.</li>
	<li>Breng de bevlekte cellen en de niet-opgeslagen controle naar het FACS-analyse- of sorteerinstrument.<ol>
<li>Identificeer en isoleer de APC+/FITC-/DAPI- populatie met gating strategieën weergegeven in figuur 1. Deze cellen vertegenwoordigen levensvatbare Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- cellen. Puin en celaggregaten raken uitgeput met behulp van voorwaartse (FSC) en side scatter (SSC) plots. Vervolgens wordt DAPI- populatie omheind, gevolgd door gating van APC+/ FITC- populatie. Niet-duurzame controles moeten worden gebruikt om te helpen bij het vaststellen van gatingparameters.</li>
		<li>Verzamel de cellen in 500 μL flowcytometriebuffer in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. In de toekomst moeten alle procedures onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd om een besmetting tot een minimum te beperken. Ongeveer 50.000 – 100.000 cellen worden verzameld uit één muis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tel cellen met behulp van een hemocytometer om de levensvatbaarheid van cellen te evalueren. Aangezien celaggregaten verdere downstreamanalyses kunnen verstoren, wordt de aanwezigheid van celaggregaten ook geëvalueerd om een minimale aanwezigheid (<5% van het levensvatbare celnummer) van deze aggregaten te garanderen.</li>
</ol>

<ol><li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li>
<li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obesity+in+man%3A+cellular+character+of+the+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li>
<li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li>
<li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment%3A+going+back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li>
<li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li>
<li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li>
<li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li>
<li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219(2020).</li>
<li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057(2018).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li>
<li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Single cell RNA sequencing (scRNA-seq) wint snel aan tractie als een krachtig hulpmiddel om tegelijkertijd diverse celpopulaties op het niveau van één cel te bestuderen. Vanwege de hoge kosten in verband met monstervoorbereiding en sequencing met hoge doorvoer, is het noodzakelijk om cellulaire ingangen (hoge levensvatbaarheid en zuiverheid) te optimaliseren om de kans op experimenteel succes te vergroten. Sommige celvoorbereidingsprotocollen zijn gebaseerd op verwijdering van dode cellen en puin met behulp van wasbeurte...

Vetweefsel speelt een belangrijke rol in het energiemetabolisme. Overtollige energie wordt opgeslagen in de vorm van lipiden en vetweefsel kan aanzienlijk worden uitgebreid of ingetrokken, afhankelijk van de voedingstoestand en de energetische vraag. Uitbreiding van vetweefsel kan het gevolg zijn van een toename van de adipocytengrootte (hypertrofie) en/of van een toename van het aantal adipocyten (hyperplasie); het laatste proces strak gereguleerd door proliferatie en differentiatie van adipose voorlopercellen1,2. Tijdens obesitas breidt vetweefsel zich overmatig uit en ontwikkelt weefseldisfunctie – waaronder hypoxie, ontsteking en insulineresistentie – vaak3,4. Deze complicaties zijn risicofactoren voor veel chronische ziekten, waaronder hypertensie, diabetes, hart- en vaatziekten, beroerte en kanker5. Daarom zijn het beperken van ongecontroleerde uitzetting van vetweefsel en het beperken van vetweefselpathologieën topprioriteiten voor biomedisch onderzoek. Tijdens de uitzetting van vetweefsel verspreiden en differentiëren ingezeten vetweefsel-afgeleide stamcellen (ASC's) zich en differentiëren ze opeenvolgend in preadipocyten (geëngageerde voorlopercellen) en vervolgens in volwassen adipocyten6. Recente eencellige RNA-sequencing (scRNA-seq) studies tonen aan dat deze adipose progenitor cell (APC) populaties (ASC 's en preadipocyten) aanzienlijke moleculaire en functionele heterogeniteitvertonen 7,8,9,10,11,12. Asc's vertonen bijvoorbeeld een verminderde adipogene differentiatiecapaciteit, terwijl ze ook hogere proliferatie- en uitbreidingsmogelijkheden vertonen in vergelijking met preadipocyten7. Verdere moleculaire verschillen worden gerapporteerd binnen ASC- en preadipocytenpopulaties, hoewel de functionele relevantie van deze verschillen onduidelijk blijft7. Samen benadrukken deze gegevens de complexiteit van de adipose-voorlopercelpool en onderstrepen ze de noodzaak om tools te ontwikkelen en te standaardiseren om deze kritieke celpopulaties beter te begrijpen en te manipuleren.
Dit protocol beschrijft de isolatie van Sca1 met een hoge levensvatbaarheid+ adiposevoorlopercelpopulaties van muisepdidymale vetkussens die geschikt zijn voor gevoelige downstreamanalyses, waaronder eencellige studies (scRNA-sequencing) en celkweek. Isolatie en dissociatie van epididymale vetkussens werd uitgevoerd zoals eerder beschreven7,13 met kleine wijzigingen die de levensvatbaarheid van geïsoleerde APC's verbeteren. Kortom, gescheiden cellen van epididymale vetkussens zijn gekleurd met antilichamen tegen Sca1, een marker voor zowel ASC's als preadipocyten6,7en andere afstammingsmarkers (Lin): Ter119 (erythroidcellen), CD31 (endotheelcellen) en CD45 (leukocyten). Levensvatbare Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- cellen worden vervolgens gesorteerd op fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). Belangrijk is dat dit protocol werd gevalideerd door succesvolle isolatie en analyse van levensvatbare Sca1+/Lin- vetvoorlopercellen gerapporteerd in een recente eencellige RNA-sequencingstudie die functioneel heterogene subpopulaties binnen ASC's en preadipocyten7identificeerde .

<table><tbody><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>13 mL culture tube</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>5 mL test tube with cell strainer snap cap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 µm cell strainer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-FITC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-FITC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1-APC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119-FITC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>FcR blocking reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks’ balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesitas en metabole stoornissen zoals diabetes, hartaandoeningen en kanker worden allemaal geassocieerd met dramatische aanpassing van vetweefsel. Weefsel-ingezeten adipose voorlopercellen (APC's) spelen een sleutelrol in vetweefsel homeostase en kunnen bijdragen aan de weefselpathologie. Het toenemende gebruik van eencellige analysetechnologieën – waaronder eencellige RNA-sequencing en enkelcellige proteomics – transformeert het stam/voorlopercelveld door een ongekende oplossing van individuele celexpressieveranderingen mogelijk te maken in de context van populatie- of weefselbrede veranderingen. In dit artikel bieden we gedetailleerde protocollen om epididymaal vetweefsel van muizen te ontleden, enkele van vetweefsel afgeleide cellen te isoleren en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) uit te voeren om te verrijken voor levensvatbare Sca1+/ CD31-/ CD45-/ Ter119- APC's. Deze protocollen stellen onderzoekers in staat om hoogwaardige APC's voor te bereiden die geschikt zijn voor downstream-analyses zoals eencellige RNA-sequencing.

Vier maanden oude mannelijke FVB-muizen werden gebruikt in dit experiment. Na uitsluiting van puin en doubletten met behulp van FSC/SSC-percelen werden levensvatbare cellen (DAPI- populatie) afgesloten, gevolgd door de selectie van APC+/FITC- populatie (figuur 1). DAPI-, APC- en FITC-poorten werden getekend op basis van de niet-vastgehouden controle. Gatingstrategieën zijn weergegeven in figuur 1.
Na 1...

We presenteren een eenvoudige methode om zeer levensvatbare adipose voorlopercellen te isoleren van epididymale vetkussens van muizen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.

Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Dit protocol maakt het mogelijk om hoogwaardige vetvoorlopercellen te isoleren uit epididymaal vetweefsel van muizen voor gevoelige downstream-analyse. Deze techniek levert zeer levensvatbare vetvoorlopercellen op en is gevalideerd in een recente single-cell RNA-sequencing studie. Nadat de mannelijke muis is geëuthanaseerd, lokaliseer de epididymale vetkussen en trek er voorzichtig aan met stompe pincetten om het te delegeren.Gebruik een schaar om de testikels te verwijderen en incubeer het epididymalen vetkussen in vijf milliliter HBSS aangevuld met 3%BSA in een 50 milliliter conische buis gedurende 15 minuten. Na de incubatie, centrifugeer de buis bij 150 x g gedurende zeven minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het drijvende epididymale vetkussen uit de conische buis en hak het fijn met schone schaar.Voeg 200 milliliter van 2% collageenase-oplossing toe aan 3,8 milliliter HBSS in een 13 milliliter kweekbuis. Voeg vervolgens het gehakte weefsel toe en incubeer het in een roterende incubator bij vijf RPM gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Breng de hele inhoud over in een 50 milliliter conische buis en voeg 10 milliliter neutralisatiemedium toe.Meng voorzichtig door de buis twee tot drie keer te kantelen. Bereid een andere 50 milliliter conische buis voor, voorzien van een 70 micrometer celstrainer en filter het verteerde weefsel in de nieuwe buis. Breng de doorstroming over in een 15 milliliter buis en centrifugeer bij 350 x g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer het celbezinksel met vijf milliliter DPBS. Centrifugeer vervolgens de buis nogmaals gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg 50 microliter flowcytometriebuffer toe.Meng de cellen door voorzichtig te pipetteren en bewaar ze op ijs. Het totale volume van de cellen in de flowcytometriebuffer zal ongeveer 100 microliter zijn. Na het mengen van de cellen, breng 54 microliter van de cellensuspensie over in een 1,7 milliliter microcentrifugebuis.Voeg zes microliter FCR-blokkeringsreagens toe en pipetteer voorzichtig om te mengen. Bewaar vervolgens de buis gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Bewaar eventuele overgebleven cellen op ijs voor gebruik als ongekleurde controle.Tijdens de incubatie, bereid een antilichaamcocktail voor door 11 microliter van elk van de anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC en anti-CD45-FITC antilichamen in een microcentrifugebuis te combineren. Pipetteer voorzichtig de mengsel en bewaar het op ijs beschermd tegen licht. Na de incubatie met FCR-blokkeringsreagens, voeg 40 microliter van de antilichaamcocktail toe en meng goed met voorzichtig pipetteren.Incubeer de cellen gedurende nog eens 10 minuten bij vier graden Celsius. Voeg 500 microliter flowcytometriebuffer aangevuld met één microgram per milliliter DAPI toe aan de gekleurde cellen. Meng goed en filter de cellen met behulp van een vijf milliliter testbuis met een celstrainer snap cap.Bewaar vervolgens de cellen op ijs. Voeg 500 microliter flowcytometriebuffer toe aan de ongekleurde cellen en meng door voorzichtig te pipetteren. Gebruik een vijf milliliter testbuis met een celstrainer snap cap om de cellen te filteren en bewaar ze op ijs.Vervoer de gekleurde cellen en ongekleurde controle naar het FACS-analyse- of sorteerinstrument. Identificeer en isoleer de APC-positieve, FITC-negatieve, DAPI-negatieve populatie met behulp van de in de tekst gedefinieerde gatingstrategieën. Gebruik de ongekleurde controles om de gatingparameters in te stellen.Na uitsluiting van puin en dubbele cellen met behulp van FSC-SSC plots, werden levensvatbare cellen gesorteerd, gevolgd door de selectie van de APC-positieve, FITC-negatieve populatie. DAPI, APC en FITC gates werden getekend op basis van de ongekleurde controle. De volgende resultaten tonen de isolatie van vetvoorlopercellen van vier maanden oude mannelijke FVB-muizen.Na één uur sorteren, werd de kwaliteit van de isolatie kwantitatief geëvalueerd door flowcytometrieanalyse, die aantoonde dat de cellen een hoge levensvatbaarheid en zuiverheid behielden. Gevoelige downstream-analyse kan na dit protocol worden uitgevoerd, zoals single-cell RNA-sequencing, kwantitatieve real-time PCR en flowcytometrie. Dit zal een verdere karakterisering van de vetvoorlopercellen mogelijk maken.Vetvoorlopercellen zijn heterogene populaties die verdere single-cell studies vereisen. Deze methode maakt het mogelijk om de cellen te isoleren die geschikt zijn voor single-cell studies.

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a technique for isolating and culturing fluorescently labeled neural crest-derived adipose-derived stem cells (ADSCs) from murine periaortic arch adipose tissue. Following isolation, the NCADSCs are detected, sorted using fluorescence-activated cell sorting, and subsequently cultured on a plate, promoting cell proliferation.

Isolating Adipose-Derived Stem Cells from Murine Periaortic Adipose Tissue

Hier worden een methode beschreven voor het isoleren van Adipocyte Progenitor Cell (APC) populaties uit Perivascular Adipose Tissue (PVAT) met behulp van Magnetisch-geactiveerde Cell Sorting (MCS). Deze methode zorgt voor een verhoogde isolatie van APC per gram vetweefsel in vergelijking met Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).

Uitbreiding en Adipogenese Inductie van Adipocyt Progenitors van Perivasculaire Adipose Weefsel Geïsoleerd door Magnetische Geactiveerde Cell Sorting

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.

Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

Dit protocol beschrijft de isolatie van muis preadipocyten uit onderhuids vet, hun differentiatie in volwassen adipocyten en de inductie van insulineresistentie. De werking van insuline wordt geëvalueerd door de fosforylering/activering van leden van de insulinesignaleringsroute door western blot. Deze methode maakt directe bepaling van insulineresistentie/gevoeligheid in primaire adipocyten mogelijk.

Gedifferentieerde muis adipocyten in primaire cultuur: een model van insulineresistentie

Preadipocyten worden geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen en gedifferentieerd tot cellen die lipidedruppeltjes accumuleren, moleculaire markers tot expressie brengen en de mitochondriale morfologie van volwassen bruine vetcellen vertonen. Deze cellen worden verder geanalyseerd door middel van immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Het vetweefsel is een uitstekende bron van mesenchymale stamcellen. Hier brengen we de stapsgewijze extractie, cultivatie en karakterisering van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) uit epididymaal vetweefsel van Zwitserse muizen.

Isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen

De grootte en kwetsbaarheid van rijpe vetcellen hebben de technieken en hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor hun studie en isolatie beperkt. Hier wordt een protocol beschreven voor de isolatie van rijpe muizenadipocyten, dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende vetdepots en muizendiëten.

Isolatie en kweek van primaire adipocyten van muizen van magere en zwaarlijvige muizen

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Leer hoe u adipose voorlopercellen isoleert uit muis epididymale vetweefsels met FACS voor single-cell RNA-sequencing. Deze methode garandeert hoge viabiliteit en zuiverheid voor gevoelige downstream analyses.

Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels

Meer video's verkennen