Name: Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: een gedetailleerde methodologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Leer de droogwortelrot-ziekteassays in kikkererwten met de vloeipapier- en ziekepottechniek. Deze methoden onderzoeken de interactie met Rhizoctonia bataticola en helpen bij het screenen van genotypen op tolerantie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projecten in het M.S.K lab worden ondersteund door het National Institute of Plant Genome Research kernfinanciering. VI erkent DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Wij danken studenten in opleiding, Miss Rishika, de heer Jayachendrayan, en Miss Durgadevi voor technische hulp tijdens video-opnamen en de heer Sandeep Dixit, Miss Anjali en Dr. Avanish Rai voor het kritisch beoordelen van ruwe gegevens en de manuscriptbestanden. We danken Mr Rahim H Tarafdar en Mr. Sunder Solanki voor hun hulp in het laboratorium. Wij erkennen DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) en NIPGR Library voor het verstrekken van toegang tot e-resources en NIPGR Plant Growth Facility voor de groei van planten ondersteuning / ruimte.

1. Isolatie van R. bataticola en opslag
<ol><li>Details van de kikkererwtengenype en DRR symptomen<ol>
<li>Gebruik kikkererwtenplanten (genotype, JG 62) die over het algemeen typische DRR-symptomen vertonen, zoals droge, broze primaire wortel zonder laterale wortels en microsclerotie onder de schors en in de pith1,3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inzameling en wassen<ol>
<li>Ontwortel planten met symptomen zoals droog strokleurig blad en broze primaire wortel met microsclerotie onder de opperhuidlaag. Tijdens het ontwortelen, een groot deel van de wortels zal blijven in de bodem als de geïnfecteerde wortels zijn broos. Verwijder het grove grondpuin dat aan de wortel is bevestigd. Snijd de wortels apart en verzamel ze in papieren enveloppen (27,5 cm x 12 cm) met het juiste etiket en leg ze in een monsterophaaldoos.</li>
		<li>Na het transport van monsters naar het laboratorium, plaats de wortels in een bekerglas van 200 mL en bedek met gaas (Nylon gaas met de poriegrootte van 3 mm diameter) en was de wortels grondig met stromend leidingwater om aanhangende bodemdeeltjes te verwijderen.</li>
		<li>Gebruik omgekeerd osmose (RO) water om eenmaal aan het einde te spoelen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oppervlaktesterilisatie<ol>
<li>Breek de wortels in vier stukken met elk 2 cm lengte met een scalpelmes en doe ze in een schone beker van 200 mL.</li>
		<li>Monteer autoclaved RO water, 2% NaOCl, weggooien pot, en autoclaved blotting papier (5 cm2) in de laminaire flow kamer.</li>
		<li>Was de wortels met 50 mL autoclaved RO water driemaal en vervolgens met 50 mL van 2% NaOCl gedurende 10 minuten. Was de wortels met 50 mL RO-water drie keer opnieuw om de NaOCl te verwijderen.</li>
		<li>Dep droog de wortels door het plaatsen van de wortels op autoclaved blotting papier en laat tot de wortels zijn gedroogd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Media en incubatie<ol>
<li>Verwijder de randen van de wortels met een gesteriliseerd scalpelblad. Splits de wortels met behulp van het blad en gebruik de gesteriliseerde tangen om ze op een aardappel dextrose agar (PDA) media Petri plaat met streptomycine sulfaat (50 mg L-1) en ampicilline (50 mg L-1).</li>
		<li>Sluit de plaat, verzegel met parafilm en broed in een couveuse bij 28 °C gedurende twee dagen in het donker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hyphal tip methode<ol>
<li>Breng de platen na twee dagen incubatie in de laminaire stroomkamer. Snijd het puntje van de hyphal groei8 onder een stereomicroscoop (Leica EZ4 educatieve stereomicroscoop) en breng deze over in een verse PDA-plaat met streptomycinesulfaat en ampicilline.</li>
		<li>Incubeer de platen in de couveuse tien dagen in het donker bij 28 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opslag en onderhoud van R. bataticola schimmelinoculum<ol>
<li>Maak PDA schuine in reageerbuizen en breng een schimmelagar plug van een tien dagen oude cultuurplaat met behulp van de vlam gesteriliseerde inenting lus. Sluit de reageerbuisd af met parafilm.</li>
		<li>Broed de schuine kanten tien dagen in het donker op 28 °C.</li>
		<li>Sluit de dop opnieuw af met parafilm en bewaar deze op 4 °C in de koelkast voor toekomstig gebruik.</li>
		<li>Subcultuur om de zes maanden om de schimmel te behouden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Behoud van virulentie<ol>
<li>Infecteer de planten met pure schimmel entculum bereid zoals vermeld in de zieke pot techniek3. Isoleer dezelfde schimmel van de geïnfecteerde planten (Koch's postulaten)9 en gebruik voor verdere experimenten. OPMERKING: In deze studie werd een veld geïsoleerde stam van de schimmel gebruikt (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Blotting papier techniek
OPMERKING: De blotting papier techniek omvat de voorbereiding van vloeibare schimmel entmateriaal, zaailing voorbereiding, en ziekte beoordeling.
<ol><li>Bereiding van vloeibare R. bataticola enoculum OPMERKING: Vloeibare R. bataticola schimmelintmateriaal bevat zowel mycelia als microsclerotie. Beide structuren fungeren als primaire entmateriaal.<ol>
<li>Bereid 500 mL PDB media in een 1.000 mL kolf en autoclave het op 121 pond voor 15 min.</li>
		<li>Nadat de media is afgekoeld, inentuleer de bouillon met een lus vol schimmelagar plug uit een schimmelschuincultuur en incubaal vijf dagen in een shaker bij 180 rpm in het donker.</li>
		<li>Monteer een autoclaved glas of plastic trechter (10 cm), een liter conische kolf, en twee lagen gaas (10 cm2 grootte) (Nylon gaas met de porie grootte van 3 mm diameter) op de tafel. Filter de schimmelsycecelia en microsclerotia met behulp van het gaas. Dep droog de schimmel in autoclaved blotting papier.</li>
		<li>Weeg 100 g mycelia voor 50% entmateriaal en houd op kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van kikkererwtenplant<ol>
<li>Selecteer 50 gezonde zaden (in deze studie werd het DRR-vatbare genotype JG 62 gebruikt), plaats ze in een bekerglas van 100 mL en bedek ze met een gaas.</li>
		<li>Was de zaden eerst met leidingwater om bodemafval te verwijderen.</li>
		<li>Neem het bekerglas met zaden in de laminaire stroomkamer en was ze met gesteriliseerd 50 mL RO water driemaal gedurende 1 min per wasbeurt.</li>
		<li>Steriliseer de zaden met 50 mL van 2% waterige NaOCl gedurende 2 minuten met continu schudden en was de zaden met 50 mL gesteriliseerd water vijf keer gedurende 1 min per stuk.</li>
		<li>Vul een polytheenzak (47,5 cm x 25 cm) met Soilrite (een mengsel van uitgevouwen perliet van tuinbouwkwaliteit, Iers veenmos en geëxfolieerd vermiculiet in gelijke verhouding d.w.z., 1/3:1/3:1/3), zeug de oppervlakte-gesteriliseerde 50 zaden twee cm diep, en bewaar in een groeikamer/ruimte met 28 °C ± 2 °C temperatuur, 16 uur fotoperiode met een lichtintensiteit van 150 μmol m−2 s−1, en relatieve vochtigheid van 70%. Geef ze water met RO-water en ontwortel de planten acht dagen na het zaaien.</li>
		<li>Was de wortels in leidingwater om de Soilrite deeltjes te verwijderen. Spoel de wortels af met gesteriliseerd RO-water en bewaar ze in het RO-water in een bekerglas van 1000 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van blotting papier in trays<ol>
<li>Neem een blotting papier en snijd ze in stukken (30 cm × 23 cm) in voldoende aantallen om de replicaties te voldoen.</li>
		<li>Pak de vellen in autoclavable polytheen zak en autoclave ze op 121 pond gedurende 15 minuten en bewaar het in een hete lucht oven voor het drogen.</li>
		<li>Vouw elke blotting papier vel in de helft.</li>
		<li>Leg het papier op een schone, met een geest afgeveegde plastic lade, zoals aangegeven in figuur 2i-iv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Planteninenting door onder te dompelen<ol>
<li>Los 100 g schimmelenoculum op in 200 mL autoclaved RO water in een bekerglas van 200 mL om 50% entmateriaal te verkrijgen.</li>
		<li>Dompel de plantenwortels in het voorbereide entmateriaal gedurende 1 min met intermitterende op- en neerbeweging om een uniforme bevestiging van schimmelenoculum te garanderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het plaatsen van de planten in het blotting papier<ol>
<li>Maak de onderkant van het blottingpapier op de lade nat met steriel RO-water. Plaats de planten op het papier op een manier waar alleen de wortels zijn bedekt door het papier, en scheuten worden weggelaten.</li>
		<li>Sluit het door het vouwen van de bovenkant van het blotting papier en nat het hele papier om voldoende water te bieden aan de groei van planten te ondersteunen.</li>
		<li>Geef de lade één keer per dag water en houd de trays op 28 °C. Observeer de symptomen zoals necrose, wortelrot en bladverkleuring dagelijks.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Zieke pottechniek
OPMERKING: De zieke pot techniek omvat de voorbereiding van virulente entmateriaal en een zieke pot, onderhoud van vochtgehalte, en de beoordeling van de symptomen van de ziekte.
<ol><li>Bereiding van substraat<ol>
<li>Neem een kg van alle commercieel verkrijgde kikkererwtenzaden. Verwijder geïnfecteerde zaden (zaden met schimmelgroei, infectievlekken en insectenschade). Plaats ze in 5 L plastic bekerglas en wassen met kraanwater grondig 3-4 keer om grote puin te verwijderen.</li>
		<li>Was de zaden driemaal met 2 L RO water en week de 1 kg zaden in een 5 L beker met drie maal meer water voor vijf uur.</li>
		<li>Zodra de zaden het water indrongen, opnieuw wassen ze met RO water driemaal om het zaad te verwijderen straalt.</li>
		<li>Verwijder het water volledig en verpak de zaden in jamflessen (300 mL, 12 cm hoog, 6 cm diameter en 155 g gewicht) tot ongeveer 1/4e capaciteit (100 g per jamfles) en sluit de flessen met doppen. Pak tien jamflessen in een autoclalavable plastic zak (48 cm x 30 cm) autoclave tweemaal op 121 pond gedurende 15 min continu.</li>
		<li>Droog de zaden bij 40 °C 's nachts in een oven om de waterdruppels in de fles te verwijderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van de zieke cultuur<ol>
<li>Schakel de BSL-2-niveau laminaire stroomkamer in. Veeg de vloer grondig af met 70% ethanol en zet UV 15 minuten aan. Houd vervolgens de zaden in de laminaire stroomkamer.</li>
		<li>Neem de vers geïsoleerde R. bataticola-cultuur van 10 dagen oud (deel 1). Neem vervolgens drie schimmelagarpluggen (4 mm diameter) met behulp van een steriele pipetpunt of kurkboor en stop ze aseptisch in jamflessen. Bedek de flessen met doppen en verzegel met parafilm.</li>
		<li>Schud de flessen om de schimmelschijf gelijkmatig te mengen met de kikkererwtenzaden.</li>
		<li>Incubeer de flessen 15 dagen in het donker bij 30 °C.</li>
		<li>Neem jamflessen met zwarte schimmelgroei(figuur 4iii)en breng de zieke cultuur (zaden met microsclerotia) over van jamflessen naar een glazen petriplaat met steriele tangen. Droog ze twee dagen op kamertemperatuur in een glazen petrischaal.</li>
		<li>Poeder de schimmelmassa met een vijzel en stamper en bewaar het poeder op 4 °C.</li>
		<li>Autoclave Soilrite twee keer op 121 pond voor 15 min.</li>
		<li>Droog de autoclaved Soilrite mix onder een parasol.</li>
		<li>Meng het schimmelpoeder met Soilrite op 50% w/w, vul de potten met het mengsel en bewaar ze een dag op kamertemperatuur.</li>
		<li>Zaai een oppervlakte-gesteriliseerd DRR-vatbaar kikkererwtenzaad per pot (10 cm ronde potten) (Tabel van materialen)en handhaven van een vochtgehalte van 80% veldcapaciteit (FC).</li>
		<li>Observeer de symptomen zoals necrose en wortelrot door de planten te ontwortelen na ontkieming.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beoordeling van de efficiëntie van zieke wiet OPMERKING: Planten vertonen gele bladsymptomen wanneer de wortels volledig verrot zijn.<ol>
<li>Ontwikkel een ziektescore op basis van de laesie (necrotische vlekken)(aanvullende figuur 2C)nummers en de ernst van wortelrot. Zieke potten met 90% plantensterfte kunnen verder worden gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genotype screening<ol>
<li>Bereid de zieke cultuur in grote hoeveelheden voor en meng het met gesteriliseerde Soilrite of veldbodem (5% w/w) in 30 cm hoge potten. Geef de potten water om het oppervlak nat te maken en laat ze zeven dagen ongestoord.</li>
		<li>Zaai één oppervlakte-gesteriliseerd zaad per 10 cm ronde pot en drie zaden per 30 cm ronde potten en geef ze voldoende water.</li>
		<li>Observeer de gele blad- en wortelrotsymptomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gecombineerde droogte en R. bataticola infectie<ol>
<li>Leg droogtestress op door de in Sinha et al. (2019) genoemde protocollen te volgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+root+rot+%28Rhizoctonia+bataticola+%28Taub.%29+Butler%29%3A+an+emerging+disease+of+chickpea+-+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Phytopathology+and+Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand.</a> Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).</li>
<li>Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135">http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135</a> (2016).</li>
<li>Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+drought+stress+on+simultaneously+occurring+pathogen+infection+in+field-grown+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea.</a> Scientific Reports. 9 (1), (2019).</li>
<li>Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chickpea+diseases%3A+resistance+screening+techniques%2C+information+bulletins+No.+10.+Patancheru%5BTitle%5D)+AND+%22Information+Bulletin+No.+10.+Patancheru%2C+A.P.%2C+India%3A+International+CroDS+Research+Institute+for+the+Semi-Arid+Tropics%22%5BJournal%5D)">Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru.</a> Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).</li>
<li>Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sources+of+multiple+disease+resistance+in+mini-core+collection+of+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea.</a> Plant Disease. , (2006).</li>
<li>Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+combined+abiotic+and+biotic+stresses+on+plant+growth+and+avenues+for+crop+improvement+by+exploiting+physio-morphological+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li>
<li>Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpho-physiological+traits+and+molecular+intricacies+associated+with+tolerance+to+combined+drought+and+pathogen+stress+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologies+of+Crop+Improvement%2C+Volume+3%3A+Genomic+Approaches%22%5BJournal%5D)">Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants.</a> Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).</li>
<li>Jensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+methods+for+fungal+brood+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Apicultural+Research%22%5BJournal%5D)">Standard methods for fungal brood disease research.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).</li>
<li>Agrios, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+G+%22Plant+Pathology%3A+Fifth+Edition%22">Plant Pathology: Fifth Edition</a>. , 9780080473(2004).</li>
<li>Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+germination+of+fungal+sclerotia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Survival and germination of fungal sclerotia.</a> Annual Review of Phytopathology. , (1971).</li>
<li>Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagamma%2C+G+%22Screening+of+chickpea+genotypes+against+dry+root+rot+caused+by+Macrophomina+phaseolina+%28tassi%29+goid%22">Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid</a>. 10 (4), 1795-1800 (2015).</li>
<li>Infantino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+techniques+and+sources+of+resistance+to+root+diseases+in+cool+season+food+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes.</a> Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).</li>
<li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423(2020).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

De blotting papier techniek biedt een eenvoudige aanpak voor het scherm kikkererwten genotypen onder laboratoriumomstandigheden. Dip-inenting maakt het onderzoeken van interactie op tijdelijke basis mogelijk met eenvoudige controle over entmateriaalbelasting(aanvullende figuur 1)en vergemakkelijkt in vitro screening. Bovendien kunnen zelfs jonge zaailingen worden gebruikt. Vijf dagen oude schimmelcultuur (Figuur 1B) kan voldoende inentmateriaal opleveren om de planten te inf...

Droge wortelrot (DRR) is een van de economisch belangrijke ziekten bij kikkererwten1,2. Het is een wortel-specifieke ziekte veroorzaakt door Rhizoctonia bataticola (teleomorf, Macrophomina phaseolina). Geïnfecteerde planten missen laterale wortels en bezitten broze taproots en geel gebladerte1,3. DRR onder droogte stress is gemeld als een opkomende bedreiging voor kikkererwten teelt1,2,3. Bovendien wordt gemeld dat de drr-incidentie onder droogtestress onder veldomstandigheden1,2,3wordt verergerd . DRR komt vaker voor in regengebieden dan in geïrrigeerde velden4. Het gebruik van resistente rassen is de manier om de ziekte te overwinnen en fungicide gebruik te omzeilen1,13. Omdat kikkererwtenkiem kiemplasma beschikbaar over de hele wereld herbergt genetische variatie voor de eigenschap5, de screening en identificatie van resistente / vatbare genotypes zijn van cruciaal belang voor moleculaire veredeling voor gewas verbetering.
Robuuste, eenvoudige en kosteneffectieve ziektetesten zijn essentieel om r. bataticola-infectiepatronen in kikkererwten te onderzoeken. De primaire ziektetest die wordt gebruikt om de reactie van kikkererwtengenypes op R. bataticola-infectie waar te nemen, is de blotting papiertechniek1,4. Het is een eenvoudige techniek en kan worden uitgevoerd met behulp van vloeibare schimmel inoculum, zaailingen met wortels, en steriele blotting papier. Deze techniek is echter niet maximaal gebruikt omdat er geen stap-voor-stap-protocol beschikbaar is in de literatuur.
Ondertussen, de zieke pot techniek omvat de voorbereiding van een potentiële zieke cultuur en het opleggen van droogte stress. Aangezien droogtestress drr-ziekteincidentie3verergert , is het van essentieel belang om de interactie tussen plant en ziekteverwekker onder droogtestress te bestuderen6,7. De zieke pot techniek biedt het platform voor een dergelijke gelijktijdige studie, het bevorderen van betere mogelijkheden voor kiemplasma screening en het begrijpen van de mechanistische basis van de interactie. Pathomorfologische veranderingen, zoals een toename van de wortellengte en vermindering van het laterale wortelaantal — inherent aan de DRR-ziekte — kunnen worden aangepakt met behulp van de zieke pottechniek1,3,7.
Hierin wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor blotting papier en zieke pottechnieken, die kunnen worden gebruikt om de interactie tussen kikkererwten en R. bataticola en het scherm van kikkererwtenkiemen te bestuderen. De details van de in de studie gebruikte materialen zijn vermeld in de tabel met materialen.

<table><tbody><tr><td>Fungus- Rhizoctonia bataticola</td><td>Pathogeen inoculum</td><td>Indian Type Culture Collection No. 8365</td><td>GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&amp;view=article&amp; id=1251&amp;Itemid=1370)</td></tr><tr><td>Soilrite mix</td><td>Grondmedium in het lab</td><td>Keltech Energies Limited, Bangalore, India</td><td>http://www.keltechenergies.com/</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Blotting papier om de plantengroei te ondersteunen</td><td>Himedia</td><td>http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374</td></tr><tr><td>Pot</td><td>Planten kweken</td><td>Potten van 10 en 30 cm grootte</td><td>Routinematig gebruikte kwekerijpotten, bijvoorbeeld, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html</td></tr><tr><td>Aardappel dextrose agar/bouillon</td><td>De schimmel cultiveren en onderhouden</td><td>Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>De schimmel cultiveren</td><td>LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator en shaker</td><td>http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131</td></tr><tr><td>Groeikamerbe</td><td>Planten kweken onder gecontroleerde omstandigheden</td><td>Model No. A1000, Conviron, Canada</td><td>https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber</td></tr><tr><td>Laminaire luchtstroom</td><td>Aseptische oefeningen uitvoeren</td><td>Telstar, Bio II advance, Klasse II kast, EN-12469-2000</td><td>https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html</td></tr><tr><td>Gaas</td><td>Het schimmelmycelium filteren</td><td>Nylon muggengaas</td><td>Gaas met poriëndiameter van 0,6-1 mm</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Media en kikkererwten zaden autoclaveren</td><td>Autoclaaf</td><td>http://www.scientificsystems.in/autoclave</td></tr><tr><td>Microscopen</td><td>De infectie en het schimmelmycelium visualiseren</td><td>SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopen, Leica EZ4 educatief stereomicroscoop</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i</td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Schimmel en chemicaliën wegen</td><td>Sartorius elektronische weegschaal, BSA 4202S-CW</td><td>https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances</td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Schimmelkleuring</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&amp;region=IN</td></tr><tr><td>Anilienblauw</td><td>Schimmelkleuring</td><td>Himedia</td><td>http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901</td></tr></tbody></table>

dry root rot disease assays in chickpea: een gedetailleerde methodologie

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Droge wortelrot (DRR) ziekte is een opkomende biotische stress bedreiging voor kikkererwten teelt over de hele wereld. Het wordt veroorzaakt door een door de bodem overgedragen schimmelpathogene ziekteverwekker Rhizoctonia bataticola. In de literatuur zijn uitgebreide en gedetailleerde stapsgewijze protocollen over ziektetesten schaars. Dit artikel bevat volledige details over de stappen die betrokken zijn bij het opzetten van een blotting papier techniek voor het snel screenen genotypen voor weerstand tegen DRR. De blotting papier techniek is eenvoudig en minder duur. Een andere methode, gebaseerd op de zieke pot benadering, is een nabootsing van natuurlijke infectie en kan worden toegepast op de interactie componenten-plant, ziekteverwekker, en omgeving-betrokken bij de ziekte driehoek te bestuderen.
Bovendien komt DRR in de natuur vooral voor in geregen kikkererwtenteeltgebieden, waar bodemvocht afneemt naarmate de gewasgroei vordert. Droogte stress is bekend dat kikkererwten planten predisponeren om drr ziekte. Pathomorfologische en moleculaire kennis van de interactie tussen plant en ziekteverwekker bij droogtestress kan de weg vrijmaken voor de identificatie van elite DRR-resistente rassen uit de kikkererwtenkiempool. Dit artikel biedt een stapsgewijze methodologie voor de bereiding van een zieke pot en de daaropvolgende ziektetest. Over het algemeen zal de hierin gepresenteerde informatie onderzoekers helpen bij het voorbereiden van R. bataticola schimmelinoculum, het handhaven van deze ziekteverwekker, het opzetten van de blotting papiertechniek, het voorbereiden van zieke cultuur en zieke pot, en het beoordelen van ziekteverwekkerinfectie in kikkererwtenplanten.

Deze studie was gericht op het aantonen van technieken zoals blotting papier en zieke pot technieken om pathomorfologische en moleculaire begrip van plant-pathogen interactie onder droogte stress te vergemakkelijken. Om dit te bereiken, planten vertonen DRR symptomen1,3,4 werden verzameld uit een kikkererwten veld, en de schimmel werd geïsoleerd met behulp van de hyphal tip methode8. R. bataticola</em...

Deze studie presenteert methodologieën om de pathomorfologische en moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan kikkererwten:Rhizoctonia bataticola-interactie. De blotting papier methode is nuttig om snel te bestuderen kikkererwten genotype reacties, terwijl de zieke pot-gebaseerde methode kan worden gebruikt om tegelijkertijd droogte en R. bataticola infectie en scherm voor tolerante genotypen op te leggen.

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: een gedetailleerde methodologie

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Het belangrijkste doel van deze studie is om een gedetailleerde methodologie van droge wortelrot ziekte testen aan te tonen, zoals blotting papier techniek en zieke pot techniek. Deze technieken zullen nuttig zijn om de interactie tussen kikkererwten plant en Rhizoctonia bataticola te bestuderen. Inzicht in de chickweed plant interactie met de schimmelpathogene Rhizoctonia bataticola is in de landbouw belangrijk.Hiervoor zijn veelzijdige en zeer reproduceerbare testen nodig. Hier worden twee testen gedemonstreerd die op grote schaal worden gebruikt in ons lab. Een van hen is blotting papier-based, en de andere is zieke pot-based test.Om de blotting papiertest uit te voeren, bereid Rhizoctonia bataticola schimmel inoculum door opschalen van schuine cultuur naar petri plaat en vervolgens vloeibare cultuur. Bereid kikkererwtenkwekerij door, zaaien zaden in een grote pot. Ontwortel ze en leg ze in het vloeibare entmateriaal en leg ze op blotting papier.Let op ziektesymptomen, namelijk necrose op de wortel, wortelrot en bladverkleuring acht dagen na inenting. Hier getoond is een notendop, de stappen in blotting papier techniek. Om de zieke pot test uit te voeren, inenting kikkererwten maaltijd met schimmel.Na incubatie bij 30 graden Celsius gedurende 15 dagen, zieke cultuur wordt verkregen. Poeder ze vervolgens en meng met potmix. Zaai zaden op controlepot en zieke pot.Let op de volgende dagen op symptomen, namelijk necrose op de wortel, wortelrot en bladverkleuring op de geïnfecteerde planten, 10 dagen na het zaaien. Zieke wiet kan worden opgeschaald en kan worden gebruikt voor grootschalige screenings. Hier getoond is een notendop van stappen in zieke pot techniek.Rhizoctonia bataticola is een zich ontwikkelende ziekteverwekker. Deze schimmel produceert hyphae en microsclerotie, die fungeren als primaire inuclum tijdens de plant infectie. De zuivere cultuur die door de isolative methode wordt toegepast wordt gebruikt voor de tests.Het belangrijkste punt voor deze succesvolle testen is een optimale inoculumbelasting. Demonstratie van de blotting papier techniek begint hier. Ter voorbereiding van vloeibare Rhizoctonia bataticola inoculum, Inentuleren de 500 ml bouillon met de schimmel agar plug uit drie dagen oude verse plaat cultuur en incubeer de kolf in een incubator op 28 graden Celsius gedurende vijf dagen.Filter de donkergrijze schimmelsycecelia uit met microsclerotie. Hang in autoclaved water en verwijder de media. Nogmaals, filter de mycelia en verwijder vocht door de mycelia een paar minuten te drogen.Hang 100 gram schimmelintmateriaal op in 200 ml autoclaved water in een jamfles en meng het goed. Ontwikkelen kikkererwten kwekerij door het zaaien van oppervlakte gesteriliseerde zaden in solerant. Ontwortel de planten acht dagen na het zaaien, was ze en spoel ze af met autoclaved RO. Neem een blotting papier en vouw het een keer en plaats de helft van het op de lade.Maak het nat met autoclaved water. Neem planten en duik in het entmateriaal gedurende 30 seconden met intermitterende op en neer beweging. Plaats de planten op een zodanige wijze dat wortels zijn bedekt in het blad en folia blijft uit.Vouw de andere helft en buig het papier. Voor controle, dip de planten in autoclaved water, houd de trays in een groeikamer voor acht dagen. Resultaten. Let op de symptomen zoals bladvernel, wortelrot, necrose in de wortel en vermindering van het laterale wortelgetal.Demonstratie van de zieke pot techniek begint hier. Neem een kilo commerciële kikkererwtenzaden. Was de zaden met kraanwater en was opnieuw met het RO-water.Week de zaden voor vijf uur. Nogmaals, was de zaden met RO water voeg 300 gram in een jam fles. Autoclave ze op 121 LVS voor 15 minuten twee keer continu.Breng de fles na het afkoelen door de laminaire stroom. Inenting van de flessen met drie schimmel agar stekkers ongeveer vier millimeter vierkante maten en schud het goed om goed te mengen. Wikkel de flessen en broed ze in een couveuse op 30 graden Celsius gedurende 15 dagen.Let op de flessen met donkere myceliale groei rond de kikkererwtenzaden en verwijder de zaden. Droog ze op kamertemperatuur en poeder ze. Meng Rhizoctonia bataticola poeder met solorite en houd ze op kamertemperatuur gedurende vijf dagen.Het oppervlak steriliseert de GT62-zaden en zaai ze op twee centimeter diepte. Resultaten. Let op de 90%-sterfte in zieke wiet. 10 dagen na het zaaien, let op de symptomen zoals necrose bij wortels en vermindering van lateraal wortelgetal en bladverkleuring in de volgende dagen.Zieke pot kan worden bereid in veldgrond ook. Droogte en Rhizoctonia bataticola infectie. Leg droogtestress op in de zieke pot door het water achter te houden.Hier worden de planten blootgesteld aan controle, droogte, ziekteverwekker, en gelijktijdige droogte en ziekteverwekker stress. Let op de symptomen, namelijk meer necrose, wortelrot en vermindering van het laterale wortelaantal, en wortellengte in gecombineerde stressbehandeling in vergelijking met de behandeling met alleen ziekteverwekkers. Conclusies. Blotting papier techniek kan worden uitgevoerd In Vitro voorwaarden.Zieke pottechniek kan worden uitgevoerd in In Vivo-omstandigheden. In zieke haven, abiotische stress, namelijk, droogte stress, kan worden opgelegd samen met de ziekteverwekker infectie. Met behulp van deze technieken kan men het ziekteverwekkerinfectiepatroon bestuderen.De meeste fysiologische veranderingen treden op tijdens de kikkererwt-Rhizoctonia bataticola-interactie en screenen ook de kikkererwtengenypes op weerstand. De blotting papiertest is zeer nuttig om kwaliteitsmonsters te genereren voor microscopie en moleculaire biologie studies. De zieke pottest, die de natuurlijke infectieomstandigheden nabootst, is van toepassing voor het screenen van kikkererwtenkiemen.

dry-root-rot-disease-assays-in-chickpea-a-detailed-methodology

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Kristalline cellulose is een belangrijk bestanddeel van de plantencelwand. De kwantificering ervan op cellulair niveau is echter technisch uitdagend. Hier beschrijven we het gebruik van gepolariseerd lichttechnologie en worteldoorsneden om informatie te verkrijgen over de samenstelling van de celwand met een spatie-temporelle resolutie.

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Het beschreven hydroponische cocultivatiesysteem ondersteunt intacte planten met metalen maasschermen en cocultivateert ze met bacteriën. Plantweefsel, bacteriën en gescheiden moleculen kunnen vervolgens afzonderlijk worden geoogst voor stroomafwaartse analyses, waarbij tegelijkertijd wordt toegelaten dat de moleculaire reacties van zowel plantaardige hosts als interactieve microben of microbiomen worden onderzocht.

Een hydroponisch co-cultuursysteem voor gelijktijdige en systematische analyse van plant- / microbe moleculaire interacties en signalering

Gepresenteerd is een protocol voor een plaat competitie test om te bepalen of een specifieke compost is waarschijnlijk bevatten bacteriën en schimmels die onderdrukken van de groei van Rhizoctonia solani.

Een plaat competitie Assay als een snelle voorafgaande beoordeling van de onderdrukking van de ziekte

Het beheren van Fusarium-verwelking van watermeloen vereist kennis van de aanwezige pathogene rassen. Hier beschrijven we de worteldip, aangetaste kernel seeding en gemodificeerde tray-dip inentingsmethoden om hun werkzaamheid aan te tonen bij rastypering van de pathogene schimmel Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Een contrast van drie inentingstechnieken die worden gebruikt om het ras van onbekend Fusarium oxysporum f.sp. te bepalen. niveum Isolaten

Dit protocol presenteert een gedetailleerde samenvatting van strategieën om plantenwortels te enten met bodemmicroben. Voor de schimmels Verticillium longisporum en Verticillium dahliae worden drie verschillende wortelinfectiesystemen beschreven. Mogelijke toepassingen en mogelijke downstream analyses worden belicht en voor- of nadelen worden per systeem besproken.

Inentingsstrategieën om plantenwortels te infecteren met door de bodem overgedragen micro-organismen

We gebruiken eenvoudige laboratoriumtools om de wortelsysteemarchitectuur (RSA) van Arabidopsis en Medicago te onderzoeken. De plantjes worden hydroponisch over gaas gekweekt en verspreid met behulp van een kunstkwast om de RSA te onthullen. Foto's worden gemaakt met behulp van scannen of een camera met hoge resolutie en vervolgens geanalyseerd met ImageJ om eigenschappen in kaart te brengen.

Een eenvoudig protocol voor het in kaart brengen van de eigenschappen van de plantwortelsysteemarchitectuur

Dit artikel beschrijft twee fenotyperingsmethoden zonder het gebruik van epidermale peelings om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling regelen. De eerste methode demonstreert hoe een stomataal fenotype kan worden geanalyseerd met behulp van een toluidineblauwe O-gekleurde plantenepidermis. De tweede methode beschrijft hoe stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteiten te volgen.

Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores

Hier beschrijven we een geavanceerd hulpmiddel dat is ontworpen voor het monitoren van de biosynthese van chlorofyl tijdens de vroege stadia van de de-etiolatie van Arabidopsis-zaailingen . De nieuwe methodologie biedt niet-invasieve real-time chlorofylfluorescentiebeeldvorming met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Niet-invasieve test voor bepaling van de kinetiek van chlorofylbiosynthese tijdens vroege stadia van de-etiolatie van Arabidopsis

Omgekeerde genetische benaderingen hebben bewezen zeer nuttig voor het bepalen van welke genen de basis liggen van resistentie tegen pathogenen in vector muggen. Deze video protocol illustreert een methode die wordt gebruikt door de Dimopoulos lab dsRNA injecteren in Anopheles gambiae muggen die de malariaparasiet haven. De techniek het manipuleren van de injectie installatie en het injecteren van dsRNA in de thorax wordt geïllustreerd.

Protocol voor RNAi Testen in volwassen muggen (A. gambiae)

Leer de droogwortelrot-ziekteassays in kikkererwten met de vloeipapier- en ziekepottechniek. Deze methoden onderzoeken de interactie met Rhizoctonia bataticola en helpen bij het screenen van genotypen op tolerantie.

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: een gedetailleerde methodologie

Meer video's verkennen