Name: Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Leer multiplex fluorescentie in situ hybridisatie combineren met immunohistochemie op verse of vaste muizenhersenen. Deze methode visualiseert RNA en eiwit tegelijkertijd voor onderzoek naar neuronale populaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Australian Research Council Discovery Project-subsidie DP180101890 en Rebecca L Cooper Medical Research Foundation-projectsubsidie PG2018110

Een samenvatting van de stappen van de voorbewerking van het weefsel is te vinden in figuur 1. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Care and Ethics Committee van de University of New South Wales in overeenstemming met de richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van dieren voor wetenschappelijke doeleinden (Australian National Health and Medical Research Council).
1. Monstervoorbereiding van vers ingevroren hersenweefsel
<ol><li>Transcardiale perfusie<ol><li>Bereid gehepariniseerde (2500 E/L) 0,1 M fosfaatbuffer (PB), pH 7,5. Maak droogijs ethanol slurry door droogijs te mengen met ethanol. Dit heeft een temperatuur van ongeveer −72 °C en wordt gebruikt voor het onmiddellijk invriezen van het geoogste weefsel.</li>
		<li>Euthanaseer volwassen C57BL/6 en Phox2b-GFP11 (Mouse Genome Informatics database ID MGI:5776545) muizen door te verdoven met natriumpentobarbital (70 mg/kg, i.p.), met behulp van een naaldmeter van 27,5 inch. LET OP: Pentobarbital is een barbituraat. Het is acuut giftig in hoge doses en kan de dood veroorzaken door ademstilstand. Raadpleeg voor gebruik de plaatselijke richtlijnen voor gezondheidszorg, juridische en materiële veiligheid.</li>
		<li>Leg het hart bloot en kanunnik de linker hartkamer met een optreknaald (23 inch gauge). Voer transcardiale perfusie uit met gehepariniseerde 0,1 M PB totdat het bloed is verdwenen (2-3 minuten) met een stroomsnelheid van 11-13 ml/min. Bepaal de bloedzuivering door de verkleuring van de lever en de uitvloeiing vanuit het rechter atriumte controleren 12.</li>
		<li>Isoleer de hersenen van de schedelholte, sluit ze onmiddellijk in Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) in een cryomal of aluminiumfolie in en plaats ze op het droogijs-ethanolbad. Bewaar het ingevroren ingebedde weefsel maximaal 3 maanden in een luchtdichte verpakking bij - 80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Delen van vers ingevroren weefsel<ol><li>Stel de cryostaattemperatuur in op -20 °C. Laat het in OCT ingebedde weefsel en een cryostaathouder ~30 minuten in de cryostaat om evenwicht met de nieuwe temperatuur mogelijk te maken. NOTITIE: Houd het weefsel te allen tijde bevroren; transporteer het weefsel van de vriezer van -80 °C naar de cryostaat op droogijs.</li>
		<li>Bevestig het weefsel aan de voorgekoelde cryostaathouder met behulp van een OCT-verbinding. In dit protocol werden weefselblokken op de klauwplaat in het coronale vlak gemonteerd. NOTITIE: Snijd overtollige OCT uit het weefsel met een scheermesje om de hoeveelheid OCT die door de cryostaat wordt gesneden en vervolgens op het glasglaasje wordt overgebracht, tot een minimum te beperken.</li>
		<li>Snijd coronale secties van 14 μm dik en monteer ze op geladen glasmicroscopieglaasjes.<ol><li>Verwarm de geleiders tot kamertemperatuur voordat u de secties monteert. Nadat de sectie is gemonteerd, bewaart u de objectglaasjes in een glaasjesdoos in de cryostaat.</li>
			<li>Als er meer dan één sectie op één objectglaasje moet worden gemonteerd, verwarm dan het gebied voor het tweede glaasje door een vinger gedurende 5-10 seconden aan de andere kant van het glaasje te plaatsen om de hechting van het gedeelte aan het glaasje te bevorderen. Een koud weefselgedeelte hecht zich niet aan een koud glaasje. De secties moeten plat aan de dia's hechten; Door te vouwen vallen ze tijdens het wassen van de geleiders.</li>
			<li>Als er scheuren in de secties worden opgemerkt, verhoog dan de cryostaattemperatuur met 1-5 °C om dit te voorkomen. Het is vooral belangrijk om weefselsecties dicht bij elkaar op hetzelfde objectglaasje te plaatsen. Dit voorkomt verspilling van FISH-sondes en reagentia tijdens de test.</li>
		</ol></li>
		<li>Bewaar weefselcoupes die op objectglaasjes zijn gemonteerd maximaal 6 maanden in een luchtdichte verpakking bij -80 °C. NOTITIE: Houd de secties te allen tijde bevroren en vermijd vriesdooicycli om afbraak van RNA te voorkomen. Transporteer de glaasjesdoos van binnenuit de cryostaat naar de vriezer van -80 °C op droogijs.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixatie van vers ingevroren weefsel<ol><li>Bereid op de dag dat de FISH-sondetest moet worden uitgevoerd 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M PB, pH 7,5 (4% PFA-oplossing). Filtreer door filtreerpapier (klasse 1: 11 μm, tabel met materialen) in een Buchner-trechter of kroesfilter te halen. LET OP: PFA is schadelijk en giftig bij contact met de huid of inademing. Alle procedures met PFA-oplossing moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. Afval van PFA-oplossingen moet zorgvuldig worden verwijderd volgens de institutionele veiligheidsprotocollen.</li>
		<li>Koel de 4% PFA-oplossing af tot 4 °C. Transporteer het op de dia gemonteerde weefsel uit de vriezer van -80 °C in droogijs en dompel het onmiddellijk gedurende 15 minuten onder in het voorgekoelde fixeermiddel. OPMERKING: Het is belangrijk dat deze fixatiestap niet langer duurt dan 15 minuten, omdat overfixatie zal resulteren in niet-specifieke achtergrondmarkering.</li>
	</ol></li>
	<li>Uitdroging van vers ingevroren weefsel<ol><li>Dehydrateer weefselsecties door de objectglaasjes onder te dompelen in graduele concentraties ethanol. In een Coplin-pot eerst onderdompelen in 50%, dan 70% en tenslotte absolute ethanol, elk gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Herhaal de laatste absolute ethanolincubatie een tweede keer.</li>
		<li>Laat de dia's aan de lucht drogen en schets de groep secties met behulp van een hydrofobe barrièrepen, waarbij u ervoor zorgt dat het binnengebied tot een minimum wordt beperkt. NOTITIE: Zorg ervoor dat het glasplaatje volledig droog is voordat u de hydrofobe barrière trekt. De hydrofobe barrière moet de weefselsecties volledig zonder openingen omringen en moet droog zijn voordat deze verder wordt verwerkt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Monstervoorbereiding van gefixeerd ingevroren hersenweefsel
<ol><li>Transcardiale perfusie fixatie<ol><li>Euthanaseer muizen door te verdoven met natriumpentobarbital (70 mg/kg, i.p.) gevolgd door transcardiale perfusie, eerst met 0,1 M PB en vervolgens met 4% PFA-oplossing. Fixeer met 10 minuten perfusie op 11-13 ml/min.</li>
		<li>Isoleer de hersenen van de schedelholte na perfusiefixatie en dompel ze een nacht onder in 4% PFA-oplossing bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Weefseldoorsnede van vast weefsel<ol><li>Spoel de hersenen met een fijne pincet af met een steriele 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voordat u de meningeale lagen verwijdert, met behulp van een ontleedmicroscoop.</li>
		<li>Snijd de hersenen nauwkeurig in blokken (scheid de hersenstam van de voorhersenen voorafgaand aan de vibratomesectie) met behulp van een hersenmatrix (Tabel met materialen). Snijd in het bijzonder de hersenstam caudaal door bij de piramidale decussatie en ontleed het cerebellum. Snijd op dezelfde manier de voorhersenen onmiddellijk rostraal naar het optische chiasma.</li>
		<li>Zet het weefsel vast op een vibrerende microtoomboorkop met cyanoacrylaat en veranker het in 2% agar-oplossing.</li>
		<li>Snijd 30 μm dikke weefselsecties met behulp van een vibrerende microtoom en bewaar gesneden secties in cryoprotectieve oplossing (30% RNasevrije sucrose, 30% ethyleenglycol, 1% polyvinylpyrrolidon (PVP-40), in 0,1 M PB, pH 7,4). Weefselcoupes kunnen maximaal 6 maanden in cryoprotectant bij -20 °C worden bewaard.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van vaste secties voorafgaand aan FISH<ol><li>Was op de dag van FISH vrij zwevende secties drie keer, gedurende 10 minuten per wasbeurt, om de cryoprotectieve oplossing te verwijderen. Om te wassen, plaatst u secties in 0,1 M PBS in een celkweekplaat met 12 putjes en schudt u ze op een roterende platformschudder (90 - 100 tpm).</li>
		<li>Gebruik na het wassen een penseel om secties op glasmicroscopieglaasjes te monteren en laat ze minimaal 2 uur aan de lucht drogen. NOTITIE: De secties moeten plat op de dia's hechten, omdat ze bij uitgesproken plooien tijdens het wassen losraken.</li>
		<li>Teken met behulp van een hydrofobe barrièrepen een barrière rond de secties om de FISH-reagentia te beperken tot de secties. Nogmaals, het is belangrijk om het interne gebied van de omtrek die met de barrièrepen is getekend te minimaliseren. MOGELIJK BREEKPUNT: De secties kunnen 's nachts bij kamertemperatuur worden bewaard om de volgende dag door te gaan met de test.</li>
	</ol></li>
</ol>3. FISH-test
OPMERKING: De rest van het protocol is van toepassing op zowel vers ingevroren als vast ingevroren weefsel.
<ol><li>Bereid de reagentia en instrumenten voor op hybridisatie- en amplificatiestappen.<ol><li>Stel een tafelincubator en een waterbad in op 40 °C.</li>
		<li>Bereid een bevochtigde, tegen licht beschermde kamer voor voor het incuberen van objectglaasjes. Bevochtiging voorkomt uitdroging van tissues - dia's bevinden zich veilig boven een vochtig reservoir. Idealiter is de kamer gemaakt van stevig polystyreen, het is lichtdicht en luchtdicht om een verzadigde waterdampatmosfeer te behouden. Het sluiten van de kamer is afhankelijk van minimale wrijving om beweging te voorkomen. We gebruikten een glaasjesdoos bekleed met natte laboratoriumdoekjes (Table of Materials) aan de onderkant. Plaats de glaasjesbak in de broedstoof om deze voor te verwarmen tot 40 °C.</li>
		<li>Verwarm de 50x Wash Buffer (materiaaltabel) en sondes gedurende 10 minuten tot 40 °C met behulp van het waterbad en laat afkoelen tot kamertemperatuur.</li>
		<li>Bereid 1 L van 1x Wash Buffer van de 50x voorraadconcentratie.</li>
		<li>Bereid het sondemengsel voor (materiaaltabel): de C1-sonde is klaar voor gebruik bij voorraadconcentratie, terwijl C2- en C3-sondes worden verzonden als een concentratie van 50x en moeten worden verdund met het verdunningsmiddel dat in de set is meegeleverd. OPMERKING: Sondemengsels kunnen maximaal 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.</li>
	</ol></li>
	<li>Protease behandeling<ol><li>Incubeer secties met Protease III (Tabel met materialen) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. OPMERKING: Zorg ervoor dat Protease III en incubatiereagentia in stroomafwaartse processen (sondemengsel, amplificatieoplossingen, blokkeerbuffer en antilichaamsera) de secties volledig bedekken. Een pipetpunt kan worden gebruikt om het reagens op de sectie te verspreiden om het hele gebied binnen de hydrofobe barrière te bedekken.</li>
		<li>Was de glaasjes twee keer met 0,1 M PBS, telkens gedurende 2 minuten, in een grote plastic vierkante petrischaal. Hier werd een vierkante bioassayschaal van 245 mm x 245 mm gebruikt (Tabel met materialen). Houd de schaal aan één kant vast en kantel deze 3-5 keer voorzichtig. Veeg na het wassen overtollig 0.1 M PBS van het objectglaasje en voeg onmiddellijk het volgende reagens toe. Laat weefselsecties niet opdrogen. NOTITIE: Tijdens elke wasbeurt worden de objectglaasjes ondergedompeld in oplossing bij kamertemperatuur. Dit is de workflow voor alle volgende wasstappen. De vaste secties van 30 μm dik komen gemakkelijker los van de geleiders dan secties met een dikte van 14 μm, wees voorzichtig tijdens het wassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Hybridisatie en amplificatie<ol><li>Plaats na het afwassen van de protease-oplossing de objectglaasjes in de bevochtigde, voorverwarmde kamer. Incubeer secties met sondemengsel (Tabel met materialen) gedurende 2 uur bij 40 °C in een benchtop incubator. NOTITIE: Zorg ervoor dat er ten minste 2 secties zijn gereserveerd voor positieve en negatieve controlesondes om de kwaliteit van het monster-RNA en de optimale permeabilisatie te beoordelen. Positieve controlesondes richten zich op genen voor het huishouden; hier waren dit een cocktail van RNA's gericht op ubiquitine C (UBC; hoge overvloed), peptidylpropylisomerase B (PPIB; matige overvloed) en RNA-polymerase 2a (POLR2A; lage overvloed). Negatieve controlesondes richten zich op het bacteriële 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinaatreductase (DapB)-gen, dat normaal afwezig is in hersenmonsters van muizen. Een positief DapB-signaal duidt op een niet-specifiek signaal en/of bacteriële besmetting van het monster.</li>
		<li>Na hybridisatie met het sondemengsel bestaan de signaalversterkingsstappen uit incubatie met Amp 1-FL (30 minuten), vervolgens met Amp 2-FL (15 minuten), gevolgd door Amp 3-FL (30 minuten) en tenslotte Amp 4-FL (15 minuten) - elk bij 40 °C. Gebruik de meegeleverde druppelflesjes om weefselsecties af te dekken met een amplificatieoplossing. Ga verder met de IHC-test na de laatste versterkingsstap.</li>
		<li>Spoel de objectglaasjes tweemaal af met Wash Buffer gedurende 2 minuten tussen de hybridisatie van de sonde en elke versterkingsstap.</li>
	</ol></li>
</ol>4. IHC-test
<ol><li>IHC-blokkeringsstap<ol><li>Om niet-specifieke binding van antilichamen te voorkomen, incubeer de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een blokkeringsoplossing met 10% normaal paardenserum, 0,3% Tween20 in 1x TBSm (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% merthiolaat) na de FISH-test. Bereid primaire antilichamen in een verdunningsbuffer met 1x TBSm, 5% normaal paardenserum en 0,1% Tween20. Leveranciers van primaire antilichamen worden vermeld in de materiaaltabel.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunohistochemie<ol><li>Verwijder overtollige blokkeerbuffer door op het glaasje te tikken en incubeer secties met primaire antilichamen gedurende een nacht bij 4 °C.</li>
		<li>Was de glaasjes 3 keer (elk 5 minuten) met 1x TBSm en incubeer met secundair antilichaam in verdunningsmiddel met 1x TBSm, 1% normaal paardenserum en 0,1% Tween20 gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Secundaire antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld in de materiaaltabel.</li>
		<li>Was de glaasjes 3 keer met 1x TBSm (elk 5 minuten) voordat u ze onder het dekglaasje gooit met montagemedium met of zonder DAPI (Tabel met materialen).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Beeldvorming
<ol><li>Onderzoek immunokleuring onder een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een camera (zie de materiaaltabel voor details). Verkrijg representatieve afbeeldingen met een vergroting van 20x en sla ze op als TIFF-bestanden.</li>
	<li>Exporteer representatieve afbeeldingen naar beeldverwerkingssoftware (Tabel met materialen) voor aanpassing van de helderheid/contrast om de helderheid te vergroten en de waarheidsgetrouwe weergave weer te geven.</li>
</ol>6. OPTIONEEL: Kwantitatieve analyse van doeltranscripties
OPMERKING: Dit is een artikel over methoden en er worden geen kwantitatieve resultaten verstrekt. De hier gepresenteerde kwantificeringsmethode is afkomstig van Dereli et al.10. okt.
<ol><li>Verkrijg beelden van de interessegebieden zoals uitgelegd in 5.1 en pas dezelfde microscoop- en camera-instellingen (zoals belichtingstijd en lichtintensiteit) toe op alle beelden van dezelfde fluorofoor.</li>
	<li>Plot de neuronale profielen met behulp van beeldanalysesoftware (Tabel met materialen).</li>
	<li>Lijn de secties uit met betrekking tot het Bregma-niveau volgens een stereotactische hersenatlas13.</li>
	<li>Pas dezelfde helderheid en hetzelfde contrast toe op alle afbeeldingen van dezelfde fluorofoor. Beschouw alleen de neuronen met DAPI-gekleurde kernen.</li>
	<li>Tel handmatig het aantal mRNA-, eiwitexpressie-, mRNA/mRNA-, eiwit/eiwit- en mRNA/eiwit-co-expressiecellen binnen het interessegebied.</li>
	<li>Om vertekening in de experimentele resultaten te verminderen, moet u de persoon die de experimentele resultaten kwantificeert, blind maken voor de experimentele groepen.</li>
	<li>Pas Abercrombie-correctie14 toe op het totale aantal cellen met behulp van de volgende Abercombie-vergelijking: Gecorrigeerd celgetal = handmatig celgetal x sectiedikte / (sectiedikte + kerngrootte) Voor secties met een dikte van 14 μm wordt bijvoorbeeld de gemiddelde kernbreedte berekend op 7,7 ± 0,3 μm en de gemiddelde sectiedikte is 14 ± 1 μm op basis van respectievelijk 30 cellen en 10 secties bij 5 dieren10. Volgens de Abercrombie-vergelijking zou het gecorrigeerde aantal cellen handmatig zijn aantal cellen x 14/(14+7,7).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61709/61709fig01.jpg"> Figuur 1: Parallelle workflow van weefselvoorbewerkingsstappen voor zowel vers ingevroren als paraformaldehyde-gefixeerd weefsel. Verwerkingsstappen voor vers ingevroren weefsel worden weergegeven in de rood omlijnde vakken, terwijl die voor paraformaldehyde (PFA) vast weefsel worden weergegeven in de blauw omlijnde vakken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61709/61709fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61709/61709fig02.jpg"> Figuur 2: Samenvatting van de gecombineerde procedure voor de FISH-sonde en de immunohistochemie. Na de voorbewerking van het weefsel wordt het op het objectglaasje gemonteerde weefsel omcirkeld met behulp van een hydrofobe barrièrepen, zoals te zien is in het eerste frame, en geïncubeerd in een protease-oplossing bij kamertemperatuur. Na wasbeurten wordt het weefsel gedurende 2 uur overgebracht naar een benchtop-incubator voor hybridisatie vóór opeenvolgende versterkingsstappen. Het in situ hybridisatiesysteem maakt gebruik van een gepatenteerd 'Z-sonde'-ontwerp, voorversterkers en versterkers zoals te zien is in frames 3-66. Zodra het weefsel een FISH-sondeverwerking heeft ondergaan, wordt het gewassen voordat het wordt geblokkeerd met normaal paardenserum. De primaire incubatie van antilichamen wordt 's nachts bij 4 °C uitgevoerd om de antilichaam-antigeenbinding te maximaliseren. De secundaire incubatie van antilichamen (2 uur) werd uitgevoerd bij kamertemperatuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61709/61709fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<ol><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Annese, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+dual+ISH-IHC+technology+to+study+angiogenesis+in+diffuse+large+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas.</a> Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).</li>
<li>Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+in+vivo+gene+expression+during+collective+cell+migration+using+an+integrated+RNAscope%2C+immunohistochemistry+and+tissue+clearing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method.</a> Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).</li>
<li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, 55(2014).</li>
<li>Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+and+cell-specific+confirmation+of+RNA+and+protein+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).</li>
<li>Kersigo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RNAscope+whole+mount+approach+that+can+be+combined+with+immunofluorescence+to+quantify+differential+distribution+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA.</a> Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).</li>
<li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PLoS One. 10 (3), 0120120(2015).</li>
<li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).</li>
<li>Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+and+immunofluorescence+imaging+for+detection+of+cytokine+expression+in+microglia%2Fmacrophage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells.</a> Bio-Protocol. 7 (22), (2017).</li>
<li>Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+respiratory-related+brain+regions+to+long-term+hypercapnia%3A+focus+on+neuropeptides+in+the+RTN%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1343(2019).</li>
<li>Lazarenko, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+sensitivity+and+ultrastructure+of+the+retrotrapezoid+nucleus+in+Phox2b-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. (2004).</li>
<li>Abercrombie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+nuclear+population+from+microtome+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Records%22%5BJournal%5D)">Estimation of nuclear population from microtome sections.</a> Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).</li>
<li>Kerr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+knock-in+mice+expressing+fluorescently+tagged+galanin+receptors+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).</li>
<li>Kachidian, P., Pickel, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+tyrosine+hydroxylase+in+neuronal+targets+and+efferents+of+the+area+postrema+in+the+nucleus+tractus+solitarii+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).</li>
<li>Stornetta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Phox2b+by+brainstem+neurons+involved+in+chemosensory+integration+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat.</a> Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).</li>
<li>Gilmor, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+putative+vesicular+acetylcholine+transporter+in+rat+brain+and+localization+in+cholinergic+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).</li>
<li>Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+neuropeptides+derived+from+a+common+precursor+are+differentially+packaged+and+transported%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported.</a> Cell. 54 (6), 813-822 (1988).</li>
<li>Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+tyrosine-hydroxylase+immunocytochemistry+in+paraffin+sections+using+pretreatment+with+proteolytic-enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).</li>
<li>Biancardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+excitatory%2C+inhibitory%2C+and+modulatory+afferent+projections+to+the+anatomically+defined+active+expiratory+oscillator+in+adult+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).</li>
<li>Matthews, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+in+the+brainstem%3A+an+excitatory+disynaptic+pathway+for+control+of+whisking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+methods+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li>
<li>Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%3A+an+enhancement+method+for+immunohistochemical+staining+based+on+microwave+oven+heating+of+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).</li>
<li>Yamashita, S., Katsumata, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+in+immunohistochemistry%3A+mechanisms+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).</li>
<li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval%3A+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li>
<li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+mechanisms+and+application+to+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li>
</ol>

In de neurowetenschappen worden FISH en IHC routinematig gebruikt om de ruimtelijke organisatie en functionele betekenis van mRNA of eiwitten binnen neuronale subpopulaties te onderzoeken. Het protocol dat in deze studie wordt beschreven, vergroot de capaciteit voor gelijktijdige detectie van mRNA's en eiwitten in hersensecties. Onze gecombineerde multiplex FISH-IHC-test maakte fenotypische identificatie mogelijk van verschillende neuronale subpopulaties in de NTS in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersenpreparaten....

Eiwitten en mRNA's die neurochemisch subpopulaties van neuronen definiëren, worden gewoonlijk geïdentificeerd met een combinatie van respectievelijk immunohistochemie (IHC) en/of in situ hybridisatie (ISH). Het combineren van ISH met IHC-technieken vergemakkelijkt de karakterisering van colokalisatiepatronen die uniek zijn voor functionele neuronen (neurochemische codering) door de multiplex-labelcapaciteit te maximaliseren.
Fluorescerende ISH (FISH)-methoden, waaronder RNAscope, hebben een hogere gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met eerdere RNA-detectiemethoden zoals radioactief ISH en niet-radioactief chromogeen ISH. FISH maakt visualisatie mogelijk van enkelvoudige mRNA-transcripten als puntvormige gekleurde vlekken1. Bovendien maakt de RNAscope-assay het mogelijk om een groter aantal RNA-doelen tegelijk te labelen, met behulp van verschillende fluorofoortags. Ondanks deze voordelen kunnen technische beperkingen van invloed zijn op het aantal fluoroforen/chromogenen dat in een enkel experiment kan worden gebruikt. Deze omvatten de beschikbaarheid van microscoopfiltersets; dergelijke overwegingen worden nog verergerd wanneer neurochemische identificatie gebruik maakt van gecombineerde FISH en IHC, in vergelijking met het gebruik van elke techniek afzonderlijk, aangezien inherente stappen die optimaal zijn voor de ene methode schadelijk kunnen zijn voor de andere.
Eerdere toepassing van FISH in combinatie met IHC heeft de expressie van specifieke cellulaire doelwitten aangetoond in menselijke B-cellymfomen2, kuikenembryo's3, zebravisembryo's4, muizennetvlies5 en binnenoorcellen van muizen6. In deze onderzoeken was de weefselvoorbereiding ofwel in formaline gefixeerde paraffine ingebed (FFPE)2,3,5 ofwel verse hele montage 4,6. Andere studies pasten chromogene RNAscope toe op vaste preparaten van muizen en rattenhersenen 7,8,9. In het bijzonder Baleriola et al.8 beschreef twee verschillende weefselpreparaten voor gecombineerde ISH-IHC; vaste hersensecties van muizen en FFPE-hersensecties van mensen. In een recente publicatie combineerden we FISH en fluorescerende IHC op vers ingevroren secties, om tegelijkertijd mRNA met een lage abundantie (galaninereceptor 1, GalR1), mRNA met een hoge abundantie (glycinetransporter 2, GlyT2) en vesiculaire acetylcholinetransporter (vAChT) proteïne10 in de reticulaire formatie van de hersenstam te visualiseren.
De kern van het solitaire kanaal (NTS) is een belangrijk hersengebied dat betrokken is bij de autonome functie. Deze heterogene populatie van neuronen bevindt zich in de achterhersenen en ontvangt en integreert een groot aantal autonome signalen, waaronder signalen die de ademhaling reguleren. De NTS herbergt verschillende neuronale populaties, die fenotypisch kunnen worden gekenmerkt door het expressiepatroon van mRNA-doelen, waaronder GalR1 en GlyT2 en eiwitmarkers voor het enzym tyrosinehydroxylase (TH) en de transcriptiefactor Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
De eigenaar van RNAscope beveelt vers ingevroren weefselpreparaten aan, maar weefsel dat is voorbereid door transcardiale perfusiefixatie van hele dieren, samen met cryoprotectie op lange termijn (opslag bij -20 °C) van vaste ingevroren weefselsecties, is gebruikelijk in veel laboratoria. Daarom hebben we geprobeerd protocollen op te stellen voor FISH in combinatie met IHC met behulp van vers ingevroren en gefixeerde ingevroren weefselpreparaten. Hier voorzien we in vers ingevroren en gefixeerde ingevroren hersensecties: (1) een protocol voor gecombineerde FISH en fluorescerende IHC (2) een beschrijving van de kwaliteit van de geproduceerde mRNA- en eiwitetikettering bij gebruik van elk preparaat (3) een beschrijving van de expressie van GalR1 en GlyT2 in de NTS.
Onze studie toonde aan dat, in combinatie met RNAscope-methodologie, het IHC-succes varieerde in vers ingevroren en gefixeerde diepvriespreparaten en afhankelijk was van lokalisatie van de doeleiwitten in de cel. In onze handen was het labelen van membraangebonden eiwitten altijd succesvol. IHC voor cytoplasmatisch eiwit daarentegen vereiste probleemoplossing, zelfs in gevallen waarin het cytoplasmatische eiwit tot overexpressie werd gebracht in een transgeen dier (Phox2b-GFP)11. Ten slotte, terwijl GalR1 tot expressie wordt gebracht in niet-catecholaminerge neuronen in de NTS, is GlyT2-expressie afwezig in de NTS.

<table><tbody><tr><td>DIEREN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 muis</td><td>Australian BioResources, Moss Vale</td><td>MGI: 2159769</td><td></td></tr><tr><td>Phox2b-eGFP muis</td><td>Australian BioResources, Moss Vale</td><td>MGI: 5776545</td><td></td></tr><tr><td>REAGENTIA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylaat</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>Heparine-Natrium</td><td>Clifford Hallam Healthcare</td><td>1070760</td><td>Raadpleeg lokale dierenarts of apotheek.</td></tr><tr><td>Lethabarb (Natrium Pentabarbitol) Euthanasie Injectie</td><td>Virbac (Australia) Pty Ltd</td><td>N/A</td><td>Raadpleeg een dierenarts voor lokale farmaceutische voorschriften betreffende Natrium Pentabarbitol</td></tr><tr><td>Moleculair kwaliteit agarose poeder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5077</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound, 118mL</td><td>Scigen Ltd</td><td>4586</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, prilled, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon, gemiddelde mol wt 40.000&nbsp; (PVP-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Met of zonder DAPI</td></tr><tr><td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (tot 3-plex capaciteit)</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)</td><td>ADV320850</td><td>Bevat 50x Wash buffer en Protease III</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, voor moleculaire biologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>APPARATUUR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop incubator</td><td>Thermoline scientific micro incubator</td><td>Model: TEI-13G</td><td></td></tr><tr><td>Brain Matrix, Muis, 30g Volwassen, Coronaal, 1mm</td><td>Ted Pella</td><td>15050</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Aanzuignaald (23 inch gauge)</td><td>BD</td><td>0288U07</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobe Barrière Pen</td><td>Vector labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes</td><td>Kimberley Clark Professional</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51</td><td>Olympus</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp</td><td>Coleparmer Masterflex</td><td>L/S Series&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Retiga 2000R Digital Camera</td><td>QImaging</td><td>RET-2000R-F-CLR</td><td>kleurcamera</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Glas Slides (Wit)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating Microtome (Vibratome)</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Whatman kwalitatief filterpapier, Grade 1, 110 mm diameter</td><td>Merck</td><td>WHA1001110</td><td></td></tr><tr><td>SOFTWARES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW&nbsp;</td><td>Corel Corporation</td><td>Version 7</td><td></td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ Distribution)</td><td>Open Source/GNU General Public Licence (GPL)</td><td>N/A</td><td>ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ voor de volgende generatie wetenschappelijke beeldgegevens", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z&nbsp;&nbsp; en Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: een open-source platform voor biologische-beeldanalyse", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019&nbsp;</td></tr><tr><td>PRIMAIRE ANTILICHAMEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase Antilichaam</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB1542</td><td>Schapen polyklonaal (1:1000 verdunning), RRID: AB_90755</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase Antilichaam, clone LNC1</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB318</td><td>Muis monoklonaal (1:1000 verdunning), RRID: AB_2201528</td></tr><tr><td>Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ABN100</td><td>Geiten polyklonaal (1:1000 verdunning), RRID: AB_2630394</td></tr><tr><td>GFP Antilichaam</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-308</td><td>Konijn polyklonaal (1:1000 verdunning), RRID: AB_10003058</td></tr><tr><td>Phox2b Antilichaam (B-11)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-376997</td><td>Muis monoklonaal (1:1000 verdunning), RRID: AB_2813765</td></tr><tr><td>SECONDAIRE ANTILICHAMEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Konijn IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-545-152</td><td>Donkey anti-Konijn (1:400 verdunning), RRID: AB_2313584</td></tr><tr><td>AMCA AffiniPure Donkey Anti-Schapen IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-155-147</td><td>Donkey anti-Schapen (1:400 verdunning), RRID: AB_AB_2340725</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Geit IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td>Donkey anti-Geit (1:400 verdunning), RRID: AB_2340415</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Muis IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td>Donkey anti-Muis (1:400 verdunning), RRID: AB_2619678</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure

combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) is een moleculaire techniek die de aanwezigheid en ruimtelijke verdeling van specifieke RNA-transcripten in cellen identificeert. Neurochemische fenotypering van functioneel geïdentificeerde neuronen vereist meestal gelijktijdige labeling met meerdere antilichamen (gericht op eiwit) met behulp van immunohistochemie (IHC) en optimalisatie van in situ hybridisatie (gericht op RNA), in tandem. Een "neurochemische handtekening" om bepaalde neuronen te karakteriseren kan worden bereikt, maar complicerende factoren zijn onder meer de noodzaak om FISH- en IHC-doelen te verifiëren voordat de methoden worden gecombineerd, en het beperkte aantal RNA's en eiwitten dat tegelijkertijd binnen dezelfde weefselsectie kan worden aangevallen.
Hier beschrijven we een protocol, met behulp van zowel vers ingevroren als vaste muizenhersenpreparaten, dat meerdere mRNA's en eiwitten in hetzelfde hersengedeelte detecteert met behulp van RNAscope FISH, gevolgd door respectievelijk fluorescentie-immunokleuring. We gebruiken de gecombineerde methode om het expressiepatroon van mRNA's met een lage abundantie (bijv. galaninereceptor 1) en mRNA's met een hoge abundantie (bijv. glycinetransporter 2) te beschrijven in immunohistochemisch geïdentificeerde hersenstamkernen.
De belangrijkste overwegingen voor eiwitetikettering stroomafwaarts van de FISH-test gaan verder dan weefselvoorbereiding en optimalisatie van de etikettering van de FISH-sonde. We ontdekten bijvoorbeeld dat de binding van antilichamen en de specificiteit van de etikettering nadelig kunnen worden beïnvloed door de proteasestap binnen de FISH-sondetest. Proteasen katalyseren hydrolytische splitsing van peptidebindingen, waardoor het binnendringen van de FISH-sonde in cellen wordt vergemakkelijkt, maar ze kunnen ook het eiwit verteren waarop de daaropvolgende IHC-test zich richt, waardoor off-target binding ontstaat. De subcellulaire locatie van het beoogde eiwit is een andere factor die bijdraagt aan het succes van IHC na de FISH-sondetest. We zagen dat IHC-specificiteit behouden bleef wanneer het beoogde eiwit membraangebonden is, terwijl IHC-gericht op cytoplasmatisch eiwit uitgebreide probleemoplossing vereiste. Ten slotte vonden we het hanteren van op objectglaasjes gemonteerd vast bevroren weefsel een grotere uitdaging dan vers ingevroren weefsel, maar de IHC-kwaliteit was over het algemeen beter met vast bevroren weefsel, in combinatie met RNAscope.

Hier schetsen we een methode voor het combineren van multiplex FISH met fluorescerende IHC om mRNA-expressie voor GalR1 en GlyT2 te lokaliseren met behulp van respectievelijk vers ingevroren en paraformaldehyde-gefixeerde weefsels in de NTS van de muis. Een pijplijn van de weefselbewerking, FISH- en IHC-procedures die in de methoden worden beschreven, wordt weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Tabel 1 geeft een samenvatting van de FISH-sonde- en...

Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.

Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Dit protocol combineert fluorescentie-RNAscoop in situ hybridisatie en immunohistochemie met behulp van vers ingevroren of gefixeerde hersenpreparaten. Deze techniek maakt flexibiliteit mogelijk door een combinatie van zeer gevoelige in situ hybridisatie en immunohistochemische methoden te demonstreren voor ruimtelijke visualisatie van RNA- en eiwitdoelen in hetzelfde weefselmonster. Deze methode is toepasbaar voor multiplex-labeling in hersenweefselsecties, wat helpt bij het onderzoek naar ruimtelijke organisatie en functionele betekenis van mRNA en eiwitten binnen heterogene neuronale populaties in de neurowetenschappen.Dit protocol richt zich voornamelijk op verwerkingsstappen voor vers ingevroren weefsel en paraformaldehyde gefixeerd weefsel. Om te beginnen met het doorsnijden van het vers ingevroren hersenweefsel, bevestigt u het op de voorgekoelde cryostaathouder en snijdt u 14 micrometer dikke coronale secties. Monteer de sectie op een geladen glazen microscopieglaasje.Breng de gemonteerde dia over in een diadoos. Transporteer de doos vervolgens naar de vriezer van min 80 graden Celsius op droogijs. Filtreer voor weefselfixatie de bereide paraformaldehyde-oplossing.Koel het af tot 4 graden Celsius. Breng het gemonteerde glaasje uit de min 80 graden Celsius vriezer op droogijs en dompel het onmiddellijk 15 minuten onder in de voorgekoelde paraformaldehyde-oplossing, Voer uitdroging uit van vers ingevroren weefsel om ervoor te zorgen dat het glasglaasje volledig droog is. Na het verwijderen van de hersenen uit een transcardieel profusie vaste houder, snijdt u met behulp van een vibrerende microtoom 30 micrometer dikke weefselsecties af.Bewaar de gesneden secties in een cryoprotectieve oplossing. Breng op de dag van de FISH-test het vrij zwevende gedeelte over in een celkweekplaat met 12 putjes die 0,1 molaire PBS bevat en schud het met 90 tot 100 RPM op een roterende platformschudder om cryoprotectant af te wassen. Monteer het gedeelte vervolgens met een penseel plat op een glasmicroscopieglaasje om losraken tijdens het wassen te voorkomen en laat het minimaal twee uur aan de lucht drogen.Teken met behulp van een hydrofobe barrièrepen een hydrofobe barrière rond de sectie om de FISH-reagentia te bevatten. Na voorbewerking wordt het weefsel geïncubeerd in een protease-oplossing en gedurende twee uur gehybridiseerd met RNAscope-sondes volgens de richtlijnen van de fabrikant. Vervolgens worden sequentiële amplificatiestappen en fluorescentie-immunohistochemie uitgevoerd.Begin met het voorbereiden van een bevochtigde, met licht beschermde kamer voor het incuberen van objectglaasjes. Verwarm in een waterbad 50X wasbuffer en sondes tot 40 graden Celsius gedurende 10 minuten. Eenmaal afgekoeld tot kamertemperatuur, bereidt u een liter 1X wasbuffer uit de 50X voorraadconcentratie.Bereid het sondemengsel voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voeg voor proteïnasebehandeling proteïnase 3 toe aan het weefselgedeelte en incubeer het gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Om de proteïnase af te wassen, dompelt u het objectglaasje voorzichtig onder in 0,1 molaar PBS bij kamertemperatuur, zodat de sectie niet losraakt.Voeg voor hybridisatie het sondemengsel toe aan het weefselgedeelte. Plaats het in de bevochtigde voorverwarmde kamer. Incubeer het vervolgens twee uur bij 40 graden Celsius.Spoel het tissuegedeelte met wasbuffer twee keer gedurende twee minuten. Voeg voor signaalversterking met behulp van een druppelflesje een versterkingsoplossing toe om het weefselgedeelte te bedekken en te incuberen zoals beschreven in de tekst. Voeg de blokkerende oplossing toe aan het weefselgedeelte en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen.Beweeg met de schuif om de overtollige blokkeerbuffer na incubatie te verwijderen. Incubeer nu de sectie met primaire antilichamen 's nachts bij 4 graden Celsius. Was de glijbaan de volgende dag drie keer met 1X TBS.Voeg het secundaire antilichaam toe en incubeer de secties gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Bestudeer het objectglaasje onder een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een camera. Verkrijg representatieve afbeeldingen met een vergroting van 20 keer en sla ze op als TIF-bestanden.In de huidige studie werden de weefselkwaliteit, integriteit en de afwezigheid van bacteriële besmetting bevestigd door de afwezigheid van DAPI-etikettering. Etikettering van positieve controlesondes gericht op ubiquitine C, peptidylprolyl isomerase B en RNA-polymerase IIA-mRNA bevestigde de RNA-integriteit. In vers ingevroren preparaten om GalR1 mRNA-positieve neuronen binnen de NTS te onderscheiden, werden aanvullende neurochemische markers gebruikt.De membraangebonden vesiculaire transporter was duidelijk gelabeld. Cytoplasmatische eiwitten zoals tyrosinehydroxylase en GFP die tot expressie worden gebracht onder controle van de PHOX2B-promotor werden daarentegen vaag waargenomen en beschreven als vlokkig omdat ze geen duidelijke omtrek hebben. GalR1 FISH-sondelabeling van cytoplasmatisch GalR1-mRNA was punctaat en duidelijk waargenomen.Om te bevestigen dat de kwaliteit van de immunohistochemie afhangt van de subcellulaire lokalisatie van eiwitten, werden verschillende nucleaire en cytoplasmatische eiwitten parallel met FISH in dezelfde weefselsecties gelabeld. De cytoplasmatische PHOX2B GFP had een vlokkig uiterlijk. Terwijl het nucleaire PHOX2B-eiwitsignaal duidelijk was, wat een hogere kwaliteit immunolabeling bevestigde in combinatie met FISH.Wanneer uitgevoerd op vaste bevroren secties in combinatie met FISH, was immunohistochemie betrouwbaar, ongeacht de subcellulaire lokalisatie. GlyT2 mRNA-positieve neuronen bevonden zich ventraal ten opzichte van de NTS en niet binnen de NTS. GlyT2-mRNA-positieve en PHOX2B-mRNA-positieve neuronen colocaliseerden niet.Een subpopulatie van PHOX2B-mRNA-positieve NTS-neuronen was tyrosinehydroxylase immunoreactief en geen enkele bevatte GlyT2-mRNA. RNAscope maakt visualisatie en analyse mogelijk van RNA-distributie met een resolutie van één molecuul in cellen en weefsels. Het maakt onderzoek mogelijk naar nieuwe RNA-soorten, ziektemechanismen, genexpressiepatronen, neurondiversiteit en cellulaire interacties.

combining-multiplex-fluorescence-situ-hybridization-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Wij beschrijven een protocol voor transcardiale perfusie van muizen, het verwijderen en doorsnijden van de hersenen, evenals immunoperoxidasekleuring, inbedding in hars en ultradunne doorsneden van de hersencoupjes. Na voltooiing van deze procedures is het immuungekleurde materiaal klaar voor onderzoek met transmissie-elektronenmicroscopie.

Voorbereiding van de muis hersenweefsel voor Immunoelectron Microscopie

Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

Een combinatie van verschillende technieken om het verzamelen van gegevens te maximaliseren van muis weefsel wordt gepresenteerd.

De combinatie van Lipophilic kleurstof, In situ Hybridisatie, immunohistochemie, en Histologie

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal...

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

Source: Baleriola, J., et. al., Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the detection of mRNA within cholinergic axons in fixed mouse hippocampal slices using fluorescent in situ hybridization and antibody staining. Fluorescence microscopy reveals the spatial localization of probe-tagged mRNAs and choline acetyltransferase in cholinergic neurons.

Immunostaining of Neurons in Mouse Brain Slices Following Fluorescence In Situ Hybridization

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor immunofluorescerende cokleuring van IBA1 en TMEM119, naast de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals perifere myeloïde celinfiltratie in muizen hersenweefsel.

Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

De vrij zwevende techniek stelt onderzoekers in staat om histologische kleuringen uit te voeren, waaronder immunohistochemie op vaste weefselsecties om biologische structuren, celtype en eiwitexpressie en lokalisatie te visualiseren. Dit is een efficiënte en betrouwbare histochemische techniek die nuttig kan zijn voor het onderzoeken van een groot aantal weefsels, zoals hersenen, hart en lever.

Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties

Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare aanpak voor histologische studies van muizenhersenen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming.

Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

Leer multiplex fluorescentie in situ hybridisatie combineren met immunohistochemie op verse of vaste muizenhersenen. Deze methode visualiseert RNA en eiwit tegelijkertijd voor onderzoek naar neuronale populaties.

Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen (Video) | JoVE Journal

Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

Meer video's verkennen