Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen
25 juni 2021
Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.
Dit protocol combineert fluorescentie-RNAscoop in situ hybridisatie en immunohistochemie met behulp van vers ingevroren of gefixeerde hersenpreparaten. Deze techniek maakt flexibiliteit mogelijk door een combinatie van zeer gevoelige in situ hybridisatie en immunohistochemische methoden te demonstreren voor ruimtelijke visualisatie van RNA- en eiwitdoelen in hetzelfde weefselmonster. Deze methode is toepasbaar voor multiplex-labeling in hersenweefselsecties, wat helpt bij het onderzoek naar ruimtelijke organisatie en functionele betekenis van mRNA en eiwitten binnen heterogene neuronale populaties in de neurowetenschappen.
Dit protocol richt zich voornamelijk op verwerkingsstappen voor vers ingevroren weefsel en paraformaldehyde gefixeerd weefsel. Om te beginnen met het doorsnijden van het vers ingevroren hersenweefsel, bevestigt u het op de voorgekoelde cryostaathouder en snijdt u 14 micrometer dikke coronale secties. Monteer de sectie op een geladen glazen microscopieglaasje.
Breng de gemonteerde dia over in een diadoos. Transporteer de doos vervolgens naar de vriezer van min 80 graden Celsius op droogijs. Filtreer voor weefselfixatie de bereide paraformaldehyde-oplossing.
Koel het af tot 4 graden Celsius. Breng het gemonteerde glaasje uit de min 80 graden Celsius vriezer op droogijs en dompel het onmiddellijk 15 minuten onder in de voorgekoelde paraformaldehyde-oplossing, Voer uitdroging uit van vers ingevroren weefsel om ervoor te zorgen dat het glasglaasje volledig droog is. Na het verwijderen van de hersenen uit een transcardieel profusie vaste houder, snijdt u met behulp van een vibrerende microtoom 30 micrometer dikke weefselsecties af.
Bewaar de gesneden secties in een cryoprotectieve oplossing. Breng op de dag van de FISH-test het vrij zwevende gedeelte over in een celkweekplaat met 12 putjes die 0,1 molaire PBS bevat en schud het met 90 tot 100 RPM op een roterende platformschudder om cryoprotectant af te wassen. Monteer het gedeelte vervolgens met een penseel plat op een glasmicroscopieglaasje om losraken tijdens het wassen te voorkomen en laat het minimaal twee uur aan de lucht drogen.
Teken met behulp van een hydrofobe barrièrepen een hydrofobe barrière rond de sectie om de FISH-reagentia te bevatten. Na voorbewerking wordt het weefsel geïncubeerd in een protease-oplossing en gedurende twee uur gehybridiseerd met RNAscope-sondes volgens de richtlijnen van de fabrikant. Vervolgens worden sequentiële amplificatiestappen en fluorescentie-immunohistochemie uitgevoerd.
Begin met het voorbereiden van een bevochtigde, met licht beschermde kamer voor het incuberen van objectglaasjes. Verwarm in een waterbad 50X wasbuffer en sondes tot 40 graden Celsius gedurende 10 minuten. Eenmaal afgekoeld tot kamertemperatuur, bereidt u een liter 1X wasbuffer uit de 50X voorraadconcentratie.
Bereid het sondemengsel voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voeg voor proteïnasebehandeling proteïnase 3 toe aan het weefselgedeelte en incubeer het gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Om de proteïnase af te wassen, dompelt u het objectglaasje voorzichtig onder in 0,1 molaar PBS bij kamertemperatuur, zodat de sectie niet losraakt.
Voeg voor hybridisatie het sondemengsel toe aan het weefselgedeelte. Plaats het in de bevochtigde voorverwarmde kamer. Incubeer het vervolgens twee uur bij 40 graden Celsius.
Spoel het tissuegedeelte met wasbuffer twee keer gedurende twee minuten. Voeg voor signaalversterking met behulp van een druppelflesje een versterkingsoplossing toe om het weefselgedeelte te bedekken en te incuberen zoals beschreven in de tekst. Voeg de blokkerende oplossing toe aan het weefselgedeelte en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen.
Beweeg met de schuif om de overtollige blokkeerbuffer na incubatie te verwijderen. Incubeer nu de sectie met primaire antilichamen 's nachts bij 4 graden Celsius. Was de glijbaan de volgende dag drie keer met 1X TBS.
Voeg het secundaire antilichaam toe en incubeer de secties gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Bestudeer het objectglaasje onder een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een camera. Verkrijg representatieve afbeeldingen met een vergroting van 20 keer en sla ze op als TIF-bestanden.
In de huidige studie werden de weefselkwaliteit, integriteit en de afwezigheid van bacteriële besmetting bevestigd door de afwezigheid van DAPI-etikettering. Etikettering van positieve controlesondes gericht op ubiquitine C, peptidylprolyl isomerase B en RNA-polymerase IIA-mRNA bevestigde de RNA-integriteit. In vers ingevroren preparaten om GalR1 mRNA-positieve neuronen binnen de NTS te onderscheiden, werden aanvullende neurochemische markers gebruikt.
De membraangebonden vesiculaire transporter was duidelijk gelabeld. Cytoplasmatische eiwitten zoals tyrosinehydroxylase en GFP die tot expressie worden gebracht onder controle van de PHOX2B-promotor werden daarentegen vaag waargenomen en beschreven als vlokkig omdat ze geen duidelijke omtrek hebben. GalR1 FISH-sondelabeling van cytoplasmatisch GalR1-mRNA was punctaat en duidelijk waargenomen.
Om te bevestigen dat de kwaliteit van de immunohistochemie afhangt van de subcellulaire lokalisatie van eiwitten, werden verschillende nucleaire en cytoplasmatische eiwitten parallel met FISH in dezelfde weefselsecties gelabeld. De cytoplasmatische PHOX2B GFP had een vlokkig uiterlijk. Terwijl het nucleaire PHOX2B-eiwitsignaal duidelijk was, wat een hogere kwaliteit immunolabeling bevestigde in combinatie met FISH.
Wanneer uitgevoerd op vaste bevroren secties in combinatie met FISH, was immunohistochemie betrouwbaar, ongeacht de subcellulaire lokalisatie. GlyT2 mRNA-positieve neuronen bevonden zich ventraal ten opzichte van de NTS en niet binnen de NTS. GlyT2-mRNA-positieve en PHOX2B-mRNA-positieve neuronen colocaliseerden niet.
Een subpopulatie van PHOX2B-mRNA-positieve NTS-neuronen was tyrosinehydroxylase immunoreactief en geen enkele bevatte GlyT2-mRNA. RNAscope maakt visualisatie en analyse mogelijk van RNA-distributie met een resolutie van één molecuul in cellen en weefsels. Het maakt onderzoek mogelijk naar nieuwe RNA-soorten, ziektemechanismen, genexpressiepatronen, neurondiversiteit en cellulaire interacties.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) op vers bevroren en gefixeerde secties van de muizenhersenen. De techniek maakt het mogelijk om RNA- en proteinedoelen gelijktijdig ruimtelijk te visualiseren, wat bijdraagt aan het onderzoek naar neuronale populaties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Moleculaire biologie
- Immunohistochemie
Achtergrond
- De studie onderzoekt de ruimtelijke organisatie van mRNA en eiwitten in heterogene neuronale populaties.
- Door FISH en IHC te combineren is multiplex labeling in hersenweefselcoupes mogelijk.
- Het doel is om het begrip van genexpressie en eiwitlokalisatie binnen de hersenen te verbeteren.
- Het protocol is toepasbaar op zowel vers-gevroren als met paraformaldehyde gefixeerde weefsels.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare en flexibele methode voor de simultane detectie van RNA en eiwitten te demonstreren.
- Om het onderzoek naar de mRNA-distributie en eiwitlokalisatie in neuronale cellen te verbeteren.
- Om de kwaliteit van immunohistochemische labeling te valideren in combinatie met FISH.
Gebruikte methoden
- Versbevroren en met paraformaldehyde gefixeerde hersensecties werden als hoofdplatform gebruikt.
- Het biologische model bestond uit muizenhersenweefsel, met de focus op RNA- en eiwitsignalen in neuronen.
- De methode omvat kritieke stappen zoals sectieeren, fixatie, hybridisatie en signaalversterking.
- Gedetailleerde incubatie- en wasprotocollen werden gevolgd om duidelijke resultaten te garanderen.
Belangrijkste resultaten
- Positieve controle-probes bevestigden de integriteit van het RNA, terwijl er variërende graden van signaalhelderheid bij eiwitten werden waargenomen.
- De studie demonstreerde het vermogen om onderscheid te maken tussen cytoplasmatische en nucleaire signalen in neuronen.
- Er werd melding gemaakt van aanwijzingen voor verschillende neuronale populaties en hun RNA/eiwitexpressies.
- De combinatie van FISH en IHC bleek betrouwbaar voor het visualiseren van meerdere targets binnen dezelfde coupes.
Conclusies
- Het protocol maakt geavanceerde exploratie van neuronale diversiteit en interactie binnen hersenweefsel mogelijk.
- Deze studie biedt een kader voor toekomstige onderzoeken naar neuronale mechanismen en potentiële ziektemodellen.
- De methode verrijkt ons begrip van moleculaire en cellulaire dynamiek in de neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Door multiplex FISH te combineren met fluorescentie-IHC kan biofarmaceutische R&D de ruimtelijke co-expressie van RNA- en eiwitdoelen binnen heterogene neuronale populaties ontrafelen, wat targetvalidatie en mechanische risicoreductie bij geneesmiddelenonderzoek in de neurowetenschappen ondersteunt. Deze aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen door moleculaire signaturen te koppelen aan cellulaire fenotypes, wat go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase informeert. De toepasbaarheid van de methode op vers-bevroren en gefixeerde weefsels biedt flexibiliteit in de workflow voor target-onderzoek in preklinische modellen.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door het in kaart brengen van mRNAs met een lage abundantie (bijv. galanine receptor 1) en transcripten met een hoge abundantie binnen immunohistochemisch gedefinieerde hersenkernen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door gelijktijdige RNA-proteïne labeling, waardoor target-engagement en padmodulatie in neuronale circuits worden verduidelijkt.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door neuronale subpopulaties te onderscheiden op basis van neurochemische signaturen, waardoor ambiguïteit bij de selectie van targets wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door de RNA-integriteit te bevestigen via positieve controleprobes (ubiquitine C, peptidylprolyl isomerase B, RNA polymerase IIA).
- Operationele waarde: Maakt assay-standaardisatie mogelijk door geoptimaliseerde protease-incubatie- en hybridisatiecondities, waardoor de reproduceerbaarheid bij vers-bevroren en gefixeerde weefselpreparaten wordt verbeterd.
- Schaalbaarheidswaarde: Ondersteunt hergebruik van het platform voor multiplex RNA-eiwitdetectie, wat bijdraagt aan een betrouwbare evaluatie van verbindingen in fenotypische screeningcampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert de afstemming van translationele biomarkers door de ruimtelijke organisatie van mRNA- en eiwitexpressie in ziekterelevante hersenstamkernen (bijv. NTS) te visualiseren.
- Operationele waarde: Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de IHC-kwaliteit na FISH te behouden, in het bijzonder voor membraangebonden targets.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt de besluitvorming door het gebrek aan colokalisatie tussen GlyT2 mRNA-positieve en PHOX2B mRNA-positieve neuronen aan te tonen, waardoor mechanistische modellen worden verfijnd.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van doelwitidentificatie tot lead-optimalisatie, waardoor ruimtelijke validatie van moleculaire targets in neuronale populaties mogelijk is voorafgaand aan fenotypische screening.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways door de RNA-distributie binnen immunohistochemisch geïdentificeerde neuronen vast te stellen, waardoor mechanistische ambiguïteit wordt verminderd.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde FISH-IHC-workflows, wat reproduceerbare ruimtelijke read-outs garandeert voor de evaluatie van verbinding-responsen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve ruimtelijke data via fluorescentiesignaaldetectie, waardoor vergelijking van RNA- en eiwitexpressieniveaus over verschillende experimentele condities mogelijk wordt.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door target-expressie in gefixeerde weefselpreparaten te valideren, wat ziekte-modellering op basis van biomarkers ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor ruimtelijke profilering binnen neurowetenschappelijke discovery-programma's, waardoor de investering in infrastructuur wordt gemaximaliseerd.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door directe visualisatie van RNA-proteïne co-expressie, waardoor fout-positieven bij targetvalidatie worden verminderd.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid via geoptimaliseerde protease- en hybridisatiestappen, waardoor variabiliteit bij multiplex-labeling wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicobeperking van targets mogelijk te maken via subcellulaire resolutie, wat uitval in een laat stadium door biologische mismatch vermindert.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door neuronale subpopulaties met verschillende RNA-proteïne profielen te identificeren, wat bijdraagt aan de selectie van indicaties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie, het hanteren van RNA-probes en antilichaamoptimalisatie om de signaalspecificiteit te beheersen.
- Afhankelijk van RNase-vrije omgevingen, cryostaat- of microtoom-sectie-instrumenten en fluorescentie-beeldingssystemen met passende filtersets.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft protease-incubatietijden en antilichaamvalidatieprotocollen om een consistente IHC-kwaliteit na FISH te garanderen.
- Vereist aanpassing op basis van de subcellulaire lokalisatie van eiwitten, aangezien cytoplasmatische targets uitgebreide troubleshooting kunnen vereisen, terwijl membraangebonden eiwitten behouden specificiteit vertonen.
- Beperkt door uitdagingen bij de weefselverwerking in gefixeerde-bevroren preparaten, hoewel de IHC-kwaliteit superieur is wanneer deze is geoptimaliseerd met RNAscope.
