Name: In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer oncogene transformatie evalueren in humane mammaire epitheelcellen met 3D-cultuur en ankeronafhankelijke groeiassays. Deze methode biedt eenvoudige tools voor gedetailleerde celbiologische analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het AG-laboratorium wordt gefinancierd door de Spaanse Raad voor nucleaire veiligheid. T.A. en A.G. zijn lid van een door Generalitat de Catalunya erkende onderzoeksgroep (2017-SGR-503). MT heeft een contract gefinancierd door de Wetenschappelijke Stichting Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. G.F. contract wordt gefinancierd door een subsidie van Cellex Foundation.

Menselijke monsters gebruikt in de volgende experimenten werden verkregen uit vermindering mammoplasties uitgevoerd bij Clínica Pilar Sant Jordi (Barcelona) onder standaard procedure toestemming. Alle procedures worden uitgevoerd in een klasse II Biological Safety Cabinet, tenzij anders vermeld.
1. In vitro cultuur van menselijke borstpitheelcellen en groeicurve plot opbouw
<ol><li>
In vitro cultuur van borst primaire epitheelcellen (BPC's): cel doorgeven OPMERKING: Voor BPEC afleiding en celcultuur volgen instructies beschreven door Ince et al., 20076.<ol>
<li>Gemiddelde voorbereiding.<ol>
<li>Supplement WIT basaal gedefinieerd medium met P of T supplementen, verstrekt door de fabrikant, afhankelijk van de vraag of primaire of getransformeerde BBC's zijn gekweekt.</li>
			<li>Voeg choleratoxine toe aan het bijgevulde WIT-medium tot een uiteindelijke concentratie van 100 ng/mL voor primaire of 25 ng/mL voor getransformeerde BBC's. LET OP: Cholera toxine is fataal bij inslikken. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen. Vermijd de afgifte ervan aan het milieu.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Celcultuur onderhoud en passaging. OPMERKING: Houd er bij de volgende stappen rekening mee dat cellen groeien in een T25-kolf. Niettemin kunnen volumes worden aangepast aan andere celkweekformaten, waarbij de evenredigheid in termen van oppervlakte behouden blijft.<ol>
<li>Controleer de cel samenvloeiing elke dag. Wanneer de cultuur is 90% confluent, uit te voeren cel passaging.</li>
			<li>Verkrijg 1x PBS, 3x trypsine, medium en een 15 mL conische buis met 2 ml Foetale Runderserum (FBS) voor elke kolf.</li>
			<li>Haal het medium uit de kolf en bewaar het in de 15 mL conische buis met FBS.</li>
			<li>Spoel cellen af met 1x PBS.</li>
			<li>Maak cellen los van het oppervlak door 1 mL van 3x trypsine toe te voegen. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.</li>
			<li>Controleer of de cellen zijn losgemaakt. Breng krachtig schudden als de cellen niet volledig los.</li>
			<li>Activeer trypsine door het gereserveerde medium aangevuld met FBS toe te voegen.</li>
			<li>Oogst de cellulaire suspensie en plaats deze in de 15 mL conische buis.</li>
			<li>Centrifuge op 500 x g gedurende 5 min, elimineren van de supernatant, en resuspend de pelleted cellen door flicking de onderkant van de buis met een vinger.</li>
			<li>Voeg 1-2 mL verse media toe aan de pellet en meet de celconcentratie met behulp van een automatische celteller of een hemocytometer. Deze gegevens zullen later worden gebruikt om de bevolkingsverdubbelingen te berekenen en de groeicurve te trekken. Zaad 12.000 cellen/cm2 (bijvoorbeeld 300.000 cellen voor een T25-kolf) in gemodificeerde celkweekoppervlakkolven (zie Tabel van materialen). OPMERKING: Verdun de celsuspensieoplossing als de concentratie te hoog is om een goede kwantificering te garanderen.</li>
			<li>Voeg medium toe aan een eindvolume van 5 mL en broed de cellen uit bij 37 °C en 5% CO2 atmosfeer.</li>
			<li>Vervang het celkweekmedium om de 48 uur.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Populatieverdubbelingsberekening en gegevensvisualisatie
	<ol>
<li>Met behulp van gegevens van het aantal cellen dat in stap 1.1.2.10 is verkregen, past u de volgende formule toe om de geaccumuleerde populatieverdubbeling (PD)-waarden te verkrijgen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ01.jpg"> Wanneer PDi het aantal populatieverdubbelingen aangeeft dat de cellen tot de vorige subcultuur hebben bereikt (het verwijst naar de PD die zich op de vorige subcultuur heeft verzameld), is Nh het aantal geoogste cellen en Ns is het aantal gezaaide cellen.</li>
		<li>Gegevens vertegenwoordigen voor een specifiek tijdsinterval met behulp van een XY-grafiek waarin het aantal dagen in cultuur(x-as)en de geaccumuleerde PD(y-as)worden weergegeven.</li>
		<li>Krijg de best passende lijn en de passende vergelijking: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ02.jpg"> OPMERKING: Een verhoogde helling (b) betekent een verhoogd proliferatiepercentage.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Driedimensionale (3D) cultuur in keldermembraanmatrix en immunofluorescente eiwitdetectie
<ol><li>3D-cultuur in keldermembraanmatrix LET OP: Dit protocol is aangepast van Debnath et al., 200310 en is geoptimaliseerd voor 24 putplaten (zie Tabel van Materialen).<ol>
<li>Bereid het materiaal een dag voor het experiment: pre-chill kelder membraan matrix 's nachts bij 4 °C en laat pipet tips, microcentrifuge buizen, en goed platen afkoelen in de vriezer. LET OP: De matrix moet op -20 °C worden bewaard voor langdurige opslag. Maak aliquots om te voorkomen dat meerdere vries-dooi cycli.</li>
		<li>Plaats op de dag van het experiment voorgekoeld materiaal op ijs.</li>
		<li>Spoel putten met koude steriele 1x PBS om de oppervlaktespanning te verminderen.</li>
		<li>Bedek de bodem van elke put met 100 μL keldermembraanmatrix. LET OP: Doe de matrix langzaam af en verspreid deze over de put; het is van cruciaal belang om bellenvorming in de onderste laag te voorkomen om de groei van de monolaagcelkweek af te wenden.</li>
		<li>Plaats de plaat in de couveuse, op 37 °C, om de matrixlaag te laten stollen. LET OP: Het duurt meestal ongeveer 20 minuten om te stollen.</li>
		<li>Probeer cellen ondertussen zoals eerder uitgelegd in stap 1.1. Centrifugeren de cellen op 500 x g gedurende 5 min en resuspend in medium. Bereid een 400.000 cellen / mL suspensie en voorzichtig uiteen elke cel klomp door pipetten.</li>
		<li>Bereid het medium met 8% keldermembraanmatrix en meng 1:1 (v/v) met cellulaire suspensie om een 200.000 cellen/mL-oplossing in 4% matrix te verkrijgen. OPMERKING: Bereken de hoeveelheid medium die nodig is om matrix onnodig afval te voorkomen.</li>
		<li>Plaats 500 μL celsuspensie in matrixoplossing bovenop de reeds gestolde matrixlaag om een totale hoeveelheid van 100.000 cellen in medium met 4% keldermembraanmatrix te zaaien.</li>
		<li>Incubeercellen bij 37 °C gedurende een paar minuten en voeg vervolgens 500 μL van het medium toe met 4% keldermembraanmatrix. Incubeer de cellen bij 37 °C in een couveuse met 5% CO2 gedurende 14 dagen. Gezaaide cellen zullen groeperen en zich vermenigvuldigen om de acini-achtigestructuren te ontstaan. OPMERKING: Celmotiliteit en aggregatie kunnen worden gecontroleerd door time-lapse tijdens het 3D-vormingsproces. Gebruik software voor beeldanalyse (bijvoorbeeld Fiji/ImageJ of Imaris) om deze gebeurtenissen te evalueren. Het aantal en de grootte van de acini zijn afhankelijk van het aggregatieproces en de proliferatiesnelheid en kunnen variëren tussen celtypen. Pas de keldermembraanmatrixconcentratie en gezaaide cellen aan om de gewenste 3D-structuren te verkrijgen.</li>
		<li>Voeg 500 μL van het medium toe met 4% keldermembraanmatrix 2-3 keer per week. OPMERKING: Voorkom verstoring van de lagen die de plaat voorzichtig dragen tijdens manipulatie.</li>
		<li>Indien gewenst kunnen het aantal en de grootte van acini worden gemeten tijdens de cultuurperiode. Om dit te doen, neem willekeurige foto's op verschillende tijdstippen na het zaaien met behulp van een fase contrast of DIC omgekeerde microscoop. Gebruik beeldanalysesoftware om de diameter van 100-200 3D-structuren te meten.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunostaining LET OP: Steriele omstandigheden zijn niet vereist tijdens dit deel van het protocol.<ol>
<li>Verwijder het cultuurmedium.</li>
		<li>Scheur de kelder membraan matrix met behulp van een p200 pipet tip met het einde afgesneden. Plaats ~50 μL uitgesplitste matrix bovenop een glazen schuif en smeer deze in een gebied van 1-2 cm2.</li>
		<li>Laat het monster volledig drogen bij kamertemperatuur of gebruik een verwarmingsplaat bij 37 °C om het proces te versnellen. Fix monsters met methanol:aceton (1:1, v/v) op -20 °C gedurende 30 min. OPMERKING: Fluorescerend signaal van eerdere markers, zoals die van fluorescerende eiwitten uitgedrukt door de cellen, zal worden gewist. LET OP: Methanol is ontvlambaar, giftig bij inademing, ingeslikt of in geval van contact met de huid. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een rookkap.</li>
		<li>Gooi de fixatieoplossing weg en verwijder het eventuele overtollige risico door de schuif op filterpapier te plaatsen. LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Eenmaal droog kunnen dia's enkele maanden bij -20 °C worden bewaard.</li>
		<li>Blokkeer monsters epitopes met 5% normaal geitenserum en 0,1% triton-X-100 in 1x PBS (blokkeeroplossing) voor 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Bereid ondertussen antilichamen voor door primaire of secundaire antilichamen te verdunnen bij de gewenste concentratie in blokkeringsoplossing. OPMERKING: De concentratie van antilichamen moet nauwkeurig worden aangepast, afhankelijk van het celtype en de referentie van het antilichaam. Als leidraad kunnen primaire anti-Cytokeratine 14- en anti-Claudin-IV-antilichamen (zie Tabel van materialen)worden gebruikt om cellen van luminale en myopitheliale afstammingen in BPEC te identificeren. De aanbevolen concentratie van werkoplossing is 1:100 voor deze primaire antilichamen en 1:500 voor anti-muis- en anti-konijn secundaire antilichamen (zie tabel met materialen).</li>
		<li>Voeg 30 μL primaire antilichamen werkoplossing toe en bedek deze met een strook laboratoriumverpakkingsfolie om verdamping te voorkomen. Incubeer 's nachts bij 4 °C in een vochtige kamer.</li>
		<li>Was drie keer met 1x PBS voor 1 uur per stuk.</li>
		<li>Herhaal stap 2.2.7 voor secundaire antilichamen. Incubatie moet worden uitgevoerd in het donker.</li>
		<li>Was met 1x PBS voor 2 uur. OPMERKING: Pas de concentratie van antilichamen, incubatietijd en washardheid aan om de signaal-ruisverhouding voor specifieke monsters te verbeteren.</li>
		<li>Verwijder de resterende PBS en, eenmaal droog, counterstain met DAPI op 0,25 μg/mL verdund in antifade montagemedium. Bedek dia's met een coverslip door het te laten bezinken zonder druk uit te oefenen. Verzegel met nagellak. LET OP: Monsters kunnen enkele weken bij 4 °C worden bewaard. Voor langdurige opslag, houd ze op -20 °C.</li>
		<li>Analyseer fluorescerende signaalverdeling voor elke acinus met behulp van een confocale microscoop. OPMERKING: De confocale microscoopconfiguratie moet nauwkeurig worden bepaald, afhankelijk van de gebruikte apparatuur en de antilichamen die op het monster worden aangebracht. Als een gids, met de apparatuur en reagentia beschreven in de tabel van materialen, gebruik maken van een 40x doelstelling en de volgende laser en detector instellingen: voor DAPI gebruik excitatie met een 405 laser (3%-5%), detectie met een PMT detector (800V, Offset: -9) en een spectrale band van 410 nm tot 500 nm; voor A488 (Claudin-IV) gebruik excitatie met een 488 laser (7%-10%), detectie met een PMT detector (800V, Offset: -20) en een spectrale band van 490 nm tot 550 nm; en voor Cy3 (Cytokeratin 14) gebruik excitatie met een 555 laser (2%-10%), detectie met een PMT detector (800V, Offset: -35) en een spectrale band van 560 nm tot 600 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Anchorage-onafhankelijke test, MTT-kleuring en automatische koloniekwantificering
<ol><li>Anchorage-onafhankelijke test: agar en cellulaire vering beplating OPMERKING: Protocol is aangepast van Borowicz et al., 201411 om experimenten in BPC's uit te voeren.<ol>
<li>Bereid een 1,2% agar-oplossing verdund in ultrazuiver water in een steriele fles. Autoclave de oplossing en onderhoud het op 42 °C tijdens het experiment. De agar-oplossing kan bij 4 °C worden opgeslagen; verwarm de agar-oplossing indien nodig totdat deze weer vloeibaar is. LET OP: Gebruik hittebestendige handschoenen om te voorkomen dat branden na autoclave. LET OP: Vanaf nu moeten steriele omstandigheden worden gehandhaafd.</li>
		<li>Bereid een 0,6% agar-oplossing door 1:1 (v/v) volledig voorverwarmd medium te mengen met 1,2% agar-oplossing. Handhaven op 42 °C om voortijdige verharding te voorkomen. LET OP: Medium kan eerder dubbel worden aangevuld om een volledig aangevulde 0,6% agar + medium oplossing te verkrijgen eenmaal gemengd.</li>
		<li>Bedek de onderkant van een 35 mm goed met 1,5 mL van 0,6% agar in medium oplossing en laat het stollen bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de bodem van de plaat volledig is afgedekt vóór agar stolling, anders kunnen cellen zich aan de plaat hechten en in monolaag groeien. OPMERKING: Aanhangende en niet-aanhangende oppervlakteplaten kunnen worden gebruikt.</li>
		<li>Ondertussen proberen cellen te stoppen en, eenmaal centrifuged en opnieuw op te stellen in medium, bereiden een 50.000 cellen / ml oplossing en zachtjes desaggen een cel klomp door herhaaldelijk pipetteren.</li>
		<li>Bereid een 0,3% agar + celsuspensie in het medium voor bij een uiteindelijke concentratie van 25.000 cellen/mL. OPMERKING: Optimale celconcentratie kan verschillen tussen celtypen. Probeer verschillende concentraties totdat geïndividualiseerde kolonies worden gevormd.<ol>
<li>Plaats een 40 μm zeeffilter bovenop een steriele buis van 50 mL en filter de 50.000 cellen/mL-oplossing waardoor het in de bodem van de buis kan vallen.</li>
			<li>Haal het filter uit de steriele buis van 50 mL, kantel de celhoudende buis naar een hoek van 45° en laat hetzelfde volume van 0,6% agar + medium oplossing door de binnenwand van de buis gieten. Hierdoor kan de agar-oplossing net genoeg afkoelen om de cellen niet te beschadigen en de voortijdige verharding ervan te voorkomen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Homogenize het mengsel en deponeren 1 mL van 0,3% agar + cel suspensie in het medium (met 25.000 cellen) op de top van de eerder gestolde bodem agar laag.</li>
		<li>Visualiseer gezaaide cellen met behulp van een omgekeerde microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen worden geïndividualiseerd. Anders moet het experiment worden herhaald.</li>
		<li>Wacht tot de agarlaag volledig gestold is en voeg vervolgens voorzichtig 1 mL van het verse medium toe aan de bovenkant zonder de delicate agarlagen eronder te verstoren.</li>
		<li>Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 3 weken in een couveuse. OPMERKING: De tijd die nodig is voor kolonievorming kan variëren tussen verschillende celtypen, maar meestal zijn 3 weken voldoende.</li>
		<li>Wissel twee keer per week van medium. Om dit te doen, voorzichtig kantelen van de plaat naar je toe, aanzuigen medium in de onderste hoek, en voeg 1 mL van vers medium. OPMERKING: Raak de agarlagen niet aan omdat ze gemakkelijk loskomen van de plaat.</li>
	</ol></li>
	<li>MTT-kleuring
	<ol>
<li>Bereid de thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) voorraadoplossing op 6 mg/mL in ultrazuiver water in een steriele fles en filteroplossing met 0,2 μm filters. Deze MTT-oplossing kan maximaal 6 maanden bij -20 °C worden bewaard. LET OP: MTT kan irritatie veroorzaken en wordt verdacht van het veroorzaken van genetische afwijkingen. Gebruik een veiligheidsbril, handschoenen en een ademhalingsfilter. OPMERKING: Vermijd herhaalde vriesdooicycli.</li>
		<li>Bereid een werkoplossing van MTT op 1 mg/mL door de voorraadoplossing te verdunnen met steriel ultrazuiver water.</li>
		<li>Zodra de kolonievormingsperiode is afgelopen, verwijder het medium van de plaat en voeg 1 mL van 1 mg/mL MTT toe aan elke put.</li>
		<li>Incubeer voor 24 uur in de couveuse. Verwijder de MTT-oplossing door deze voorzichtig te aspireren. Platen kunnen enkele weken bij 4 °C worden bewaard. OPMERKING: Vermijd blootstelling aan licht om niet-specifieke kristalvorming te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Koloniekwantificering
	<ol>
<li>Verkrijg beelden van elke plaat met behulp van een omgekeerde microscoop. Pas de vergroting aan om het maximale gezichtsveld te verkrijgen met minder afbeeldingen en nog steeds in staat om kleine kolonies te detecteren (meestal 4x of 10x doelstellingen). OPMERKING: Zorg ervoor dat afbeeldingen een homogene achtergrond vertonen. Er is geen fasecontrast of differentieel interferentiecontrast vereist, omdat niet-gekleurde kolonies niet zullen worden gekwantificeerd.</li>
		<li>Upload afbeeldingen naar ImageJ/Fiji software12 om het aantal kolonies en het gebied van elke MTT-positieve kolonie te tellen. OPMERKING: Een script voor automatische kwantificering wordt verstrekt als een aanvullend bestand. Als u de code wilt uitvoeren, plakt u deze op de macro-editor(Plugins | Nieuwe | Macro) en volg de instructies.<ol>
<li>Een binair masker verkrijgen door de oorspronkelijke afbeelding te thresholderen(afbeelding | | aanpassen drempel) om goed afgebakende kolonies te verkrijgen (figuur 1). OPMERKING: 8- of 16-bits afbeeldingen zijn meestal vereist om deze stap uit te voeren. De methode "Minimumdrempel" wordt aanbevolen.</li>
			<li>Voer de Extended Particle Analyzer uit Biovoxxel plugin13 (Plugins | BioVoxxel | Extended Particle Analyzer) om MTT positieve kolonies te identificeren(figuur 2). Eerste leidende voorwaarden: Grootte (μm2) = 250–Oneindigheid; Degelijkheid = 0,75–1,00.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Schat de gemiddelde diameter (D) van elke waarde van het koloniegebied (A) volgens de formule: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ03.jpg">
</li>
		<li>Filterresultaten door het uitsluiten van lage proliferative kolonies (bijvoorbeeld lage diameter).<ol>
<li>Kies een minimum aantal divisies per week(m)dat in aanmerking moet worden genomen (bijv. 1).</li>
			<li>Schat de straal van een kolonie(R) met n cellen volgens de volgende formule: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ04.jpg"> Wanneer, r is de gemiddelde straal van individuele cellen in suspensie, n is het aantal cellen die een kolonie die leed m divisies elke week tijdens w weken in de cultuur. In exponentiële groei: n = 2(m*w). ρ is de verpakkingsefficiëntie. Merk op dat, in willekeurige beweging, de verpakkingsefficiëntie ~0,64 is en de dichtst mogelijke verpakkingsfractie voor identieke bollen 0,7414is.</li>
			<li>Gooi alle kolonies die een diameter lager dan 2R als hun cellen hebben niet bereikt het minimum aantal divisies beschouwd in stap 3.3.4.1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Stampfer, M. R., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+models+of+human+mammary+epithelial+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Culture models of human mammary epithelial cell transformation.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).</li>
<li>Schinzel, A. C., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+transformation+and+experimental+models+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%3A+A+Journal+and+Virtual+Library%22%5BJournal%5D)">Oncogenic transformation and experimental models of human cancer.</a> Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71(2008).</li>
<li>Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+process+of+human+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modeling the process of human tumorigenesis.</a> Nature Communications. 8 (1), 15422(2017).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Ince, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+different+human+breast+epithelial+cell+types+leads+to+distinct+tumor+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of different human breast epithelial cell types leads to distinct tumor phenotypes.</a> Cancer Cell. 12 (2), 160-170 (2007).</li>
<li>Repullés, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+malignant+transformation+of+preneoplastic+and+normal+breast+primary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced malignant transformation of preneoplastic and normal breast primary epithelial cells.</a> Molecular Cancer Research. , 1-13 (2019).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), San Diego, California. 256-268 (2003).</li>
<li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soft+agar+colony+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The soft agar colony formation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brocher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BioVoxxel+Image+Processing+and+Analysis+Toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22European+BioImage+Analysis+Symposium%22%5BJournal%5D)">The BioVoxxel Image Processing and Analysis Toolbox.</a> European BioImage Analysis Symposium. 8 (2), 67112(2015).</li>
<li>Torquato, S., Truskett, T. M., Debenedetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+random+close+packing+of+spheres+well+defined%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Is random close packing of spheres well defined.</a> Physical Review Letters. 84 (10), 2064-2067 (2000).</li>
<li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+promote+transition+of+ductal+carcinoma+in+situ+to+invasive+ductal+carcinoma+by+inducing+myoepithelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 65(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De experimentele protocollen beschreven in dit document bieden nuttige instrumenten om de oncogene transformatie van in vitro gekweekte cellen te beoordelen. Elke techniek evalueert specifieke aspecten van het transformatieproces, en daarom moet bijzondere aandacht worden besteed aan het trekken van conclusies uit een enkele analyse. Groeicurven opbouw is een aanpak die informatie die al beschikbaar is bij het kweken van cellen voor andere doeleinden vereist. Dat maakt deze techniek goedkoper en gemakkelijker toe te pass...

Meerdere opeenvolgende gebeurtenissen zijn vereist voor de ontwikkeling van het neoplasma. In 2011 beschreven Hanahan en Weinberg 10 vermogens die de groei, overleving en verspreiding van getransformeerde cellen mogelijk maken: de zogenaamde "Hallmarks of Cancer"1. De hier beschreven methodologie stelt drie verschillende instrumenten samen om in vitro cellulaire transformatie te evalueren door zich te concentreren op enkele onderscheidende kenmerken van de tumorcellen. Deze technieken beoordelen de celproliferatiesnelheid, het gedrag van cellen wanneer gekweekt in 3D en hun vermogen om kolonies met ankerveronafhankelijkheid te vormen.
Celmodellen zijn cruciaal om hypothese in vitro te testen. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om experimentele modellen van cellulaire transformatie te genereren voor de studie van kanker2,3,4. Aangezien borstkanker is de meest voorkomende kanker onder vrouwen wereldwijd en is verantwoordelijk voor ongeveer 15% van de sterfgevallen door kanker onder vrouwen5, het verstrekken van geschikte cellulaire modellen van borstepitheelcellen is van het grootste belang voor verder onderzoek. In dit artikel hebben we het potentieel van drie technieken geïllustreerd om cellulaire transformatie te evalueren met behulp van een experimenteel model van borstwerkelijke epitheelcellen (BPC's) transformatie aanvankelijk beschreven door Ince en collega's in 20076 en later geïmplementeerd in ons laboratorium7. Dit experimentele model is gebaseerd op de sequentiële wijziging van drie gerichte genen (SV40 Large T en kleine t-antigenen hierin aangeduid als Ttag, hTERTen HRAS) op het genoom van niet-getransformeerde BBC's. Bovendien, de methode die wordt gebruikt voor BPECs afleiding bevordert het behoud van borstepileliale cellen met luminale of myoepithelial markers, wat resulteert in een heterogene celcultuur die een aantal van de borstklier fysiologische eigenschappen behoudt.
In de borstklier bevinden zich borstlichaamcellen, die verantwoordelijk zijn voor de melkproductie, in de buurt van het lumen, terwijl myoepitheliale cellen rond luminale cellen worden verwijderd en zorgen voor samentrekkingsbewegingen die de melk naar de tepel leiden. Het verlies van de juiste organisatie tussen deze cellijnen is een kenmerk van tumorale transformatie8 die in vitro kan worden beoordeeld na immunofluorescente detectie van onderscheidende afstammingmarkers in 3D-celculturen. Een ander belangrijk kenmerk van tumorcellen is hun vermogen om te groeien zonder gehechtheid aan andere cellen en aan de extracellulaire matrix1. Wanneer gezonde cellen worden gedwongen om te groeien in suspensie, mechanismen zoals anoikis \u2012 een soort celdood geïnduceerd in reactie op detachement van de extracellulaire matrix \u2012 worden geactiveerd9. De ontduiking van celdood is een van de kenmerkende kenmerken van kanker en dus zijn getransformeerde cellen in staat om anoikis te activeren en op een ankeronafhankelijke manier te overleven. Deze capaciteit kan in vitro worden geëvalueerd met de verankering-onafhankelijke test met behulp van zachte agar. Bovendien is een inherent kenmerk van tumorweefsels hun aanhoudende proliferative signaleringscapaciteit, die gemakkelijk kan worden gecontroleerd onder in vitro omstandigheden door de toename van het aantal cellen langs de tijd te meten, niet alleen in suspensietesten, maar ook door het toezicht op de groeisnelheid van monolaagaanhangende culturen.
Ondanks het beste model om tumorigenic potentieel te testen is de inenting van tumorcellen in murinemodellen en evaluatie van tumorontwikkeling in situ, is het belangrijk om het aantal dieren dat in experimentele procedures wordt aangewend zo veel mogelijk te minimaliseren. Daarom is het hebben van geschikte tests om transformatie in vitro te beoordelen een topprioriteit. Hier bieden we een reeks tools om het tumorigenic potentieel van gedeeltelijk en volledig getransformeerde borsteptropelial cellen te evalueren die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd in de meeste laboratoria die werken met cellulaire transformatiemodellen.

<table><tbody><tr><td>1 ml Serologische Pipetten</td><td>Labclinics</td><td>PLC91001</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorfs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3451</td><td>Donkere eppendorfs worden bij voorkeur gebruikt voor langdurige opslag van MTT</td></tr><tr><td>10 µl Pipet tips zonder filter</td><td>Biologix</td><td>20-0010</td><td></td></tr><tr><td>100 ml glazen fles</td><td></td><td></td><td>Met dop, autoklaveerbaar</td></tr><tr><td>1000 µl Pipet tips met filter</td><td>Labclinics</td><td>LAB1000ULFNL</td><td></td></tr><tr><td>1000 µl Pipet tips zonder filter</td><td>Biologix</td><td>20-1000</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conische buisjes</td><td>VWR</td><td>525-0400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serologische Pipetten</td><td>Labclinics</td><td>PLC91002</td><td></td></tr><tr><td>200 µl Pipet tips met filter</td><td>Labclinics</td><td>FTR200-96</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serologische Pipetten</td><td>Labclinics</td><td>PLC91005</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conische buisjes</td><td>VWR</td><td>525-0304</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>PanReac AppliChem</td><td>211007</td><td>Wordt gebruikt voor fixatie van 3D-structuren voorafgaand aan immunofluorescente markering</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>Wordt gebruikt voor verankeringstest</td></tr><tr><td>Anti-Claudin 4 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>15104, RRID:AB_301650</td><td>Werkverdunning 1:100, gastheer: konijn</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antilichaam</td><td>Abcam</td><td>9220, RRID:AB_307087</td><td>Werkverdunning 1:100, gastheer: muis</td></tr><tr><td>Anti-muis Cyanine Cy3 antilichaam</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>115-165-146, RRID:AB_2338690</td><td>Werkverdunning 1:500, gastheer: geit</td></tr><tr><td>Anti-konijn Alexa Fluor 488 antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034, RRID:AB_2576217</td><td>Werkverdunning 1:500, gastheer: geit</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioVoxxel Toolbox</td><td></td><td>RRID:SCR_015825</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur 24-well Plaat</td><td>Labclinics</td><td>PLC30024</td><td>Wordt gebruikt voor 3D-culturen in Matrigel. Platte bodem</td></tr><tr><td>Celcultuur 6-well Plaat</td><td>Labclinics</td><td>PLC30006</td><td>Wordt gebruikt voor verankeringstest</td></tr><tr><td>Cel incubator (37 ºC en 5 % CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cel zeefjes</td><td>Fisherbrand</td><td>11587522</td><td>Maaswijdte: 40 µm</td></tr><tr><td>CellSense software</td><td>Olympus</td><td></td><td>Wordt gebruikt voor beeldacquisitie</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin van Vibrio cholerae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>Wordt gebruikt om celcultuurmedium aan te vullen</td></tr><tr><td>Biologische veiligheidskast Klasse II</td><td>Herasafe</td><td>HAEREUS HS12</td><td></td></tr><tr><td>Confocale omgekeerde microscoop</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Dekglaasjes</td><td>Witeg Labortechnik GmbH</td><td>4600122</td><td>22 X 22 mm, dikte 0,13 - 0,17 mm</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>2-(4-amidinofenyl)-1H -indole-6-carboxamide</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td>Wordt gebruikt om trypsinewerking te inactiveren</td></tr><tr><td>Fiji software (ImageJ)</td><td>National Institutes of Health</td><td>RRID:SCR_002285</td><td>Gratis download, geen licentie nodig</td></tr><tr><td>Glazen Pasteur Pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen schuifjes</td><td>Fisherbrand</td><td>11844782</td><td></td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Biowest</td><td>S2000</td><td>Wordt gebruikt voor immunofluorescentie van 3D-structuren</td></tr><tr><td>Hittebestendige handschoenen</td><td></td><td></td><td>Wordt gebruikt voor agarmanipulatie na autoclaaf</td></tr><tr><td>Verwarmingsbad (37 ºC)</td><td></td><td></td><td>Wordt gebruikt om oplossingen te temperen voorafgaand aan celsubcultuur</td></tr><tr><td>Verwarmingsbad (42 ºC)</td><td></td><td></td><td>Wordt gebruikt om agar warm te houden</td></tr><tr><td>Verwarmingsplaat</td><td></td><td></td><td>Wordt gebruikt voor Matrigel-dehydratie</td></tr><tr><td>Vochtigheidskamer</td><td></td><td></td><td>Wordt gebruikt voor de incubatie van antilichamen tijdens immunofluorescentie</td></tr><tr><td>IJs</td><td></td><td></td><td>Wordt gebruikt tijdens Matrigel-manipulatie</td></tr><tr><td>IJsbox</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde optische microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Becton Dickinson</td><td>354234</td><td>Bewaar bij -20 ºC en koel houden wanneer in gebruik. Wordt ook wel basement membrane matrix genoemd</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131091</td><td>Wordt gebruikt voor fixatie van 3D-structuren voorafgaand aan immunofluorescente markering</td></tr><tr><td>Micropipet</td><td></td><td></td><td>p1000, p200 en p10</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td>RRID:SCR_016137</td><td>Wordt gebruikt om de populatiedubbeling te berekenen en om de groeiversnellingsvergelijking te verkrijgen</td></tr><tr><td>MilliQ water</td><td></td><td></td><td>Wordt ook wel ultrapuur water genoemd</td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td></td><td></td><td>Wordt gebruikt om monsters te verzegelen na montage</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Wordt gebruikt om antilichaamoplossing tijdens incubatie te bedekken</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (zonder calcium & magnesium)</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>Steriel. Wordt gebruikt voor celsubcultuur</td></tr><tr><td>PBS tabletten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Verdun in milliQ water. Geen steriliteit vereist. Wordt gebruikt voor immunofluorescentie</td></tr><tr><td>Pipet hulpmiddel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primaria T25 kolven</td><td>Corning</td><td>353808</td><td>Wordt gebruikt voor BPEC-cultuur</td></tr><tr><td>Scepter Geautomatiseerde Celteller</td><td>Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>Gebruik alternatief een hemocytometer</td></tr><tr><td>Schaar</td><td></td><td></td><td>Wordt gebruikt om pipet tips en parafilm te snijden</td></tr><tr><td>Steriele

in vitro evaluatie van oncogene transformatie in human mammary epithelial cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenese is een proces in meerdere stappen waarin cellen mogelijkheden verwerven die hun groei, overleving en verspreiding onder vijandige omstandigheden mogelijk maken. Verschillende tests zijn gericht op het identificeren en kwantificeren van deze kenmerken van kankercellen; echter, ze richten zich vaak op een enkel aspect van cellulaire transformatie en, in feite, meerdere tests nodig zijn voor hun juiste karakterisering. Het doel van dit werk is om onderzoekers te voorzien van een reeks instrumenten om cellulaire transformatie in vitro vanuit een breed perspectief te beoordelen, waardoor het mogelijk is om goede conclusies te trekken.
Een aanhoudende proliferative signaling activatie is het belangrijkste kenmerk van tumorweefsels en kan gemakkelijk worden gecontroleerd onder in vitro omstandigheden door het berekenen van het aantal populatieverdubbelingen bereikt in de tijd. Bovendien maakt de groei van cellen in 3D-culturen hun interactie met omringende cellen mogelijk, die lijkt op wat er in vivo gebeurt. Dit maakt de evaluatie van cellulaire aggregatie mogelijk en, samen met immunofluorescente etikettering van onderscheidende cellulaire markers, om informatie te verkrijgen over een ander relevant kenmerk van tumorale transformatie: het verlies van een goede organisatie. Een ander opmerkelijk kenmerk van getransformeerde cellen is hun vermogen om te groeien zonder gehechtheid aan andere cellen en aan de extracellulaire matrix, die kan worden geëvalueerd met de verankeringstest.
Gedetailleerde experimentele procedures om de groei van cellen te evalueren, om immunofluorescente etikettering van cellijnmarkers in 3D-culturen uit te voeren en om verankering-onafhankelijke celgroei in zachte agar te testen, worden verstrekt. Deze methoden zijn geoptimaliseerd voor borst primary epitheelcellen (BPEC) vanwege de relevantie ervan bij borstkanker; Na enkele aanpassingen kunnen echter procedures worden toegepast op andere celtypen.

Er werd gekozen voor een experimenteel model van cellulaire transformatie met de introductie van drie genetische elementen in BPC's om representatieve resultaten van oncogene transformatie te genereren6,7 (figuur 3). Niet-getransformeerde BPC's(N)werden afgeleid van ziektevrij borstweefsel zoals beschreven door Ince en collega's6 en gekweekt volgens het hier aangegeven protocol. Na he...

Dit protocol biedt experimentele in vitro tools om de transformatie van menselijke borstcellen te evalueren. Gedetailleerde stappen naar de follow-up cel proliferatie tarief, verankering-onafhankelijke groeicapaciteit, en de distributie van cellijnen in 3D-culturen met kelder membraan matrix worden beschreven.

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Deze methodologie maakt gebruik van de integratie van verschillende indicatoren om de mate van transformatie van elk celmodel te beoordelen. Deze techniek biedt onderzoekers een reeks tijdrovende maar eenvoudig te gebruiken hulpmiddelen voor het beoordelen van celtransformatie in vitro. Hierdoor kan de methode in de meeste laboratoria worden gebruikt.Teresa Anglada, een post-doctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium, en Joan Repulles, een microscopie specialist, zullen de procedure demonstreren. Wanneer de primaire borstpiteelcelcultuur 90% confluency bereikt, brengt u het supernatant van de kweekfles over naar een buisje van 15 milliliter met twee milliliter foetaal runderserum en spoelt u de cellen af met PBS. Behandel de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius met een milliliter trypsine.Wanneer de cellen losraken, inactiveer de trypsine met het gereserveerde medium en verzamel de cellen door centrifugatie. Schud het buisje om de pellet op te schommelen en voeg een tot twee milliliter vers medium toe voor het tellen. Na het bepalen van de celconcentratie, voegt u 300.000 cellen toe aan een nieuw buisje en brengt u het eindvolume aan tot vijf milliliter met aanvullend vers kweekmedium.Zaai cellen in een nieuwe T25-fles en zet de cellen terug in de celkweekincubator. Gebruik vervolgens de formule om het aantal opgehoopte populatie verdubbeling te berekenen. Om de proliferatiesnelheid van de cellen te beoordelen, zet u het opgehoopte aantal populatie verdubbeling voor een specifiek tijdsinterval uit. Een toegenomen helling duidt op een verhoogde celproliferatiesnelheid.Om een 3D-celkweek op te zetten, spoelt u putjes met een oppervlakte van 1,9 vierkante centimeter met koud steriel PBS en bekleedt u de bodem van elke put met 100 microliter basement membraanmatrix. Plaats vervolgens de plaat gedurende ongeveer 20 minuten in de celkweekincubator om de matrix te laten stollen.Tegelijkertijd oogst u borstcellen zoals zojuist gedemonstreerd en verdunt u de cellen tot een concentratie van 400.000 cellen per milliliter medium. Meng de cellen met vers medium aangevuld met 8% basement membraanmatrix in een verhouding van één op één en voeg 500 microliter van de cellen toe aan elke put van de gesolidificeerde matrix. Incubeer de cellen gedurende enkele minuten bij 37 graden Celsius, voeg vervolgens 500 microliter medium aangevuld met 4% basement membraanmatrix toe aan elke put.Plaats de cellen gedurende 14 dagen in de celkweekincubator. De gezaaide cellen zullen zich groeperen en prolifereren en vormen daarbij acini-achtige structuren. Voor de immunofluorescente detectie van eiwitten in de 3D gekweekte borstcellen, gebruikt u een afgesneden P200 pipettip om de basement membraanmatrix uit elke put te verwijderen en smeer ongeveer 50 microliter van de gedesaggregateerde matrix van elke put op individuele glasplaten.Wanneer de monsters volledig zijn opgedroogd, fixeert u de cellen met een een-op-een methanol-aceton oplossing bij minus 20 graden Celsius gedurende 30 minuten. Na het fixeren, blokkeert u de monsters met een blokkeeroplossing gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, voegt u 30 microliter van de primaire antilichaam werkoplossing toe en bedekt u de platen met een strook laboratoriumfolie voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius in een vochtige kamer.De volgende ochtend wast u de platen drie keer gedurende één uur per wasbeurt met PBS en labelt u de monsters met de juiste secundaire antilichaamoplossing zoals zojuist gedemonstreerd. Aan het einde van de incubatie, wast u de monsters twee keer gedurende twee uur per wasbeurt in PBS voordat u tegenkleurt met DAPI verdund in anti-fade montagemedium en elke plaat bedekt met een dekglas. Analyseer vervolgens de fluorescente signaalverdeling voor elke acinus op een confocale microscoop.Om een verankeringsonafhankelijke test uit te voeren, bedekt u eerst de bodem van het juiste aantal putten van een zes-putten plaat met 1,5 milliliter 0,6% agar in mediumoplossing en laat u de agar stollen bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens een vijf keer 10 tot de vierde cellen per milliliter oplossing zoals gedemonstreerd en filter de cellen door een 40 micron zeef in een steriele 50 milliliter buis. Houd het buisje onder een hoek van 45 graden en voeg een gelijk volume van 0,6% agar in mediumoplossing toe aan de wand van het buisje.En na grondig mengen, plaatst u één milliliter van de cellen in agar suspensie in elke put van de eerder bereide zes-putten plaat. Gebruik een omgekeerde microscoop om te bevestigen dat de cellen homogeen verspreid zijn in de agar. Wanneer de agar volledig is gestold, voegt u voorzichtig één milliliter verversingsmedium toe aan elke put zonder de agar te verstoren en incubeer de cellen gedurende drie weken, waarbij het medium twee keer per week wordt ververst.Aan het einde van de kolonievormingsperiode, vervangt u het medium met één milliliter van één milligram per milliliter MTT per put voor een 24-uurs incubatie in de celkweekincubator. De volgende dag verwijdert u het MTT uit elke put en maakt u afbeeldingen van elke put op de omgekeerde microscoop. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, opent u de afbeeldingen in ImageJ en klikt u op afbeelding, aanpassen, drempel en toepassen om een binaire masker te verkrijgen door drempeling van de originele afbeelding.Wanneer er goed afgebakende kolonies zijn verkregen, selecteert u plugins en biovoxxel om de uitgebreide deeltjesanalysator te starten om de MTT-positieve kolonies te identificeren. Over een specifiek tijdsinterval bereiken gedeeltelijk en volledig getransformeerde cellen een hoger aantal populatie verdubbeling vergeleken met niet-getransformeerde cellen, wat aangeeft dat de celdelingssnelheid toeneemt met het transformatieproces. Over de tweeweken durende 3D-celkweekperiode aggregeren en prolifereren de cellen, waardoor de acini-grootte toeneemt.De juiste polarisatie van elke acinus kan nauwkeurig worden beoordeeld met behulp van eiwitimmun

in-vitro-evaluation-oncogenic-transformation-human-mammary-epithelial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In dit rapport tonen we een systeem te isoleren en cultuur donor cellen van de muis borstklier, en orthotopically deze cellen transplantatie in ontvangende muizen om de stromale analyseren: epitheel interacties tijdens mammatumor ontwikkeling.

Borstklieren transplantatie van stromale cellen en carcinoom cellen in C57BL/6J Muizen

Werkwijze voor menselijke mammaire chirurgische discard materiaal wordt beschreven. Verwerkte weefsel in de vorm van organoids, onbeperkt worden opgeslagen bevroren of in kweek zijn geplaatst voor lange termijn. Deze methode maakt experimentele onderzoek van normale menselijke epitheliale celbiologie en de effecten van exogene verstoringen.

Verwerking van de mens Vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor Cultuur van de Cel

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

De Focus Formation Assay verschaft een eenvoudige methode om de transformerende potentieel van een kandidaat oncogen beoordelen.

Focus Formation: A-cel gebaseerde test om de oncogene potentiaal van een Gene bepalen

Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende&gt; 6 maanden.

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

Drijvende mammosfeer-assays kunnen de subset van stamcel-achtige borstkankercellen onderzoeken die overleven in suspensie-omstandigheden en verhoogde tumorigenese vertonen wanneer ze in muizen worden geïmplanteerd. Dit protocol biedt een handige in vitro maatstaf voor sfeervormingsvermogen, een proxy voor in vivo tumorigenese, terwijl het de analyse van het stamcel-geassocieerde transcriptionele landschap vergemakkelijkt.

Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen

Dit protocol beschrijft methoden voor het zuiveren, kwantificeren en karakteriseren van extracellulaire vesicles (EVs) / exosomen van niet-aanhechtende / mesenchymale mammary epitheelcellen en voor het gebruik ervan om het vermogen van de borstkanker te overdragen naar luminale mammary epitheelcellen. EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen kunnen deze celeigenschap overbrengen aan cellen die de EV's / exosomen innemen.

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen

De in vitro Cell Invasion assay wordt gebruikt om het potentieel van kanker metastasen te meten door het cellulaire potentieel voor invasie en migratie te kwantificeren met behulp van celkweek inserts met eiwit matrix. Cellen worden uitgedaagd om te migreren door de eiwit matrix en een poreus membraan, naar een chemoaantretant, en vervolgens gekwantificeerd door lichte microscopie.

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

Patient-derived xenograft (PDX) modellen en transplanteerbare genetisch gemanipuleerde muismodellen getrouw de menselijke ziekte samenvatten en zijn voorkeursmodellen voor fundamenteel en translationeel borstkankeronderzoek. Hier wordt een methode beschreven om borsttumorfragmenten orthotopisch in het borstvetkussen te transplanteren om tumorbiologie te bestuderen en de respons van geneesmiddelen te evalueren.

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

Het huidige protocol beschrijft intraductale injectie van virale vectoren via de speen om genen van belang af te leveren in de borstepitheelcellen.

In Vivo Genafgifte in muisepitheelcellen via intraductale injectie van zmammas

De huidige studie rapporteert een eenvoudiger, tijdbesparend en economisch protocol om primaire menselijke borstepitheelcellen (HMEC's) efficiënt te isoleren en te laten groeien uit kleine hoeveelheden borstweefsel. Dit protocol is geschikt voor het snel produceren van primaire HMEC's, zowel voor laboratorium- als klinische toepassingen.

Isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen

Leer oncogene transformatie evalueren in humane mammaire epitheelcellen met 3D-cultuur en ankeronafhankelijke groeiassays. Deze methode biedt eenvoudige tools voor gedetailleerde celbiologische analyses.

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Meer video's verkennen