Meting van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse
27 oktober 2020
Vanwege de inherente lage signaal-ruisverhouding (SNR) van Fӧrster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde sensoren, is het meten van cAMP-signalen een uitdaging geweest, vooral in drie ruimtelijke dimensies. Hier beschrijven we een hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysemethodologie die het mogelijk maakt om de cAMP-verdeling in drie ruimtelijke dimensies te meten.
Dit protocol is belangrijk omdat het een methode biedt voor het meten en visualiseren van FRET- of cyclisch AMP-signalen in drie ruimtelijke dimensies in individuele cellen. Cyclisch AMP-verdelingen kunnen zich naast lateraal ook axiaal voordoen en het is belangrijk om FRET cyclisch AMP-beeldgegevens in drie dimensies te verzamelen om deze verdelingen te bemonsteren. Op de dag van beeldvorming, verwarm Tyrodes buffer tot 37 graden Celsius in een waterbad en monteer een dekglas met de getransfecteerde cellen van belang in een cellenkamer.
Bevestig de bovenkant van de kamer met een montagepakking om lekkage te voorkomen en gebruik een delicate taakveger om eventueel overtollig medium of adherante cellen van de onderkant van het dekglas te verwijderen. Voeg 800 microliters werkbuffer en vier microliters van vijf millimolair nucleair label toe aan de cellenkamer en schud de kamer voorzichtig vijf tot 10 seconden. Dek vervolgens de cellenkamer af met aluminiumfolie voor een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur.
Om de cellen te beeldvormen, selecteer de 60X waterimmersie-objectief op een confocale microscoop uitgerust met een spectraal detector en voeg een druppel water toe aan het objectief. Plaats de geladen cellenkamer op het microscoopplatform en stel de filterknop in om de juiste filterset te selecteren. Selecteer de modus voor fluorescentie-veldverlichting en gebruik de oogstukken om een gezichtsveld te selecteren dat cellen bevat die de FRET cyclisch AMP-sensor tot expressie brengen.
Open de beeldvormingssoftware, selecteer de confocale modus en ontgrendel de laserinterlock-knop. Open het A1-instellingenmenu. Vink de vakken aan die overeenkomen met de laserlijnen van 405 en 561 nanometer en stel deze spectrale detecties in op SD, de resolutie op 10 en de kanalen op 32.
Selecteer de start- en eindgolflengtewaarden om het golflengtebereik in te stellen. Open het A1-instellingenmenu om het binning-skip-pictogram te selecteren. Selecteer het vak met het getal 15 en klik op OK.Stel de laserintensiteiten in op acht procent voor de 405 nanometer-laser en op twee procent voor de 561 nanometer-laser.
Stel de detectorversterking in op 149 en de pinholeradius op 2,4 Airy disk-eenheden. Stel de scansnelheid in op 25 spectrale frames per seconde en selecteer de unidirectionele scanrichting. Stel het aantal op vier en de scanschaal op 1024 bij 1024.
Om de z-stack-acquisitieparameters te definiëren, klik op Beeld, Acquisitiecontrole en ND-acquisitie en voer de bestemming en naam van het bestand in het pop-upvenster in om het ND-bestand op te slaan. Klik op het z-serievak en klik op Live in het A1 Plus-instellingenvenster om een live beeldvenster te openen. Stel de focusknop in om op de cellen te focussen terwijl u in het voorbeeldvenster kijkt.
Stel de focusknop op de microscoop in om de bovenkant van de cel te selecteren en klik op Boven in het ND-acquisitievenster om de huidige positie als bovenkant in te stellen. Stel de focusknop op de microscoop in om de onderkant van de cel te selecteren en klik op Onder om de huidige positie als onderkant in te stellen. Voer één micrometer in voor de stapgrootte.
Selecteer Boven Onder voor de z-scanrichting en klik op uitvoeren om een z-stack te verkrijgen. Wanneer de z-stack-acquisitie voltooid is, gebruik een pipet om het reagens van belang voorzichtig aan de kamer toe te voegen zonder de cellen te verstoren. Na 10 minuten, verander de bestandsnaam en verwerf een tweede z-stack-beeld.
Na het beeldvormen, maak nieuwe mappen met dezelfde bestandsnamen als de spectrale z-stack-afbeeldingen en open het spectrale beeldbestand van belang. Klik op Bestand, Importeren/Exporteren en ND-document exporteren. Selecteer in het pop-upvenster de nieuw gemaakte map, TIFF voor het bestandstype, Mono-afbeelding voor elke kanaal en behoud de bitdiepte.
Klik op exporteren om de individuele bestanden naar de map te exporteren en open de lineaire spectrale unmixing-software. Open het Linear Unmixing. m-bestand en klik op Uitvoeren.
Blader en selecteer de map met de geëxporteerde TIFF-bestandssequentie en klik op OK om het golflengte- en z-slicevenster te openen. Kopieer de bestandsnaam van het eerste bestand zonder de z-slice en het kanaalnummer uit de map en plak deze in de eerste stap van de Enter of the imagename-box, voer het aantal kanalen in in de Enter the number of wavelength bands-box en het aantal z-slices in de Enter the number of Z Slices-box en klik op OK.Bekijk vervolgens in het pop-upvenster en selecteer het Wavelength. mat-bestand en klik op Openen.
Blader en selecteer het Library. mat-bestand in het nieuwe pop-upvenster en klik opnieuw op Openen om het slice-unmixing te initiëren. Om de FRET-efficiëntie te berekenen, open de multiFRRC.
.m programmeerscript en voer het aantal experimentele proeven in dat moet worden geanalyseerd in het How many folders to reslice-vak. Klik op OK.Blader om de ongemengde mappen te selecteren en klik opnieuw op OK.Stel in het nieuwe pop-upvenster de schaalfactor in op 12,4, de drempelwaarde op 56, de X, Y en Z-frequentie op respectievelijk vijf, vijf en één en het uitgloeialgoritme op Gaussiaans.
Klik vervolgens op Uitvoeren om de FRET-metingen en reslicing uit te voeren. Om de FRET-efficiëntie tot cyclisch AMP-niveaus te mappen, open het Mapping_FRET.Efficiency_to_cAMP_concentration. m-bestand en klik op Uitvoeren.
Navigeer naar en selecteer de eerste grijswaardige FRET-afbeelding en klik op OK.Open vervolgens de FRET cyclisch AMP-afbeeldingen om de verdeling van de cyclisch AMP-signalen in drie dimensies te inspecteren. In deze afbeeldingen kunnen driedimensionale weergaven van vals gekleurde ruwe hyperspectrale beeldgegevens worden waargenomen die zijn verkregen met behulp van confocale microscopie bij baseline en 10 minuten na forskoline-behandeling. In deze analyse werd een acceptor-fluorofoor volledig foto-gedestructureerd, waardoor spectrale signaturen van de donor en acceptor met een één-op-één stoichiometrie konden worden verkregen.
Niet-getransfecteerde cellen gelabeld met een nucle
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op de uitdagingen bij het meten van cAMP-signalen in drie ruimtelijke dimensies met behulp van sensoren gebaseerd op Fӧrster resonantie-energietransfer (FRET). Er wordt een nieuwe hyperspectrale FRET-beeldgevingsmethodologie gepresenteerd die de visualisatie en meting van de cAMP-distributie binnen individuele cellen mogelijk maakt.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Cyclisch AMP-signalering
- FRET-beeldvormingstechnologie
- Cellulaire dynamiek in drie dimensies
Achtergrond
- Lage signaal-ruisverhouding (SNR) in traditionele FRET-sensoren
- Belang van driedimensionale cAMP-metingen
- Toepassingen in cellulaire signaleringspaden
Gebruikte methoden
- Hyperspectrale beeldvorming voor FRET-analyse
- Confocale microscopie voor beeldvorming
- Lineaire spectrale ontmengingstechnieken
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van de cAMP-distributie in drie dimensies
- Visualisatie van cellulaire responsen op behandeling met forskoline
- Aantoonde bruikbaarheid van lineaire unmixing voor signaalscheiding
Conclusies
- Deze methodologie biedt een robuust kader voor het bestuderen van cAMP-dynamiek met een hoge resolutie.
- Het vergroot het inzicht in signaleringspaden binnen de celbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Nauwkeurige ruimtelijke mapping van second messenger-dynamiek is cruciaal voor het verlagen van risico's bij targetvalidatie in GPCR- en adenylylcyclase-paden. Deze hyperspectrale FRET-benadering maakt driedimensionale resolutie van cAMP-signalen mogelijk, waardoor mechanistische ambiguïteit in studies naar subcellulaire compartimentalisatie wordt verminderd. De methode ondersteunt predictieve betrouwbaarheid in vroege discovery door ruimtelijke cAMP-patronen te koppelen aan functionele cellulaire responsen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door cAMP-compartimentalisatie in drie ruimtelijke dimensies op te lossen.
- Operationele waarde: Biedt functionele targetvalidatie door visualisatie van route-specifieke signaleringspatronen in levende cellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door ruimtelijke cAMP-distributies te correleren met fenotypische uitkomsten na farmacologische perturbatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste FRET-efficiëntie-uitlezingen die geschikt zijn voor high-content screening-formaten.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van lineaire spectrale ontmenging om autofluorescentie en spectrale crosstalk te minimaliseren, waardoor de betrouwbaarheid van het signaal over replicates wordt verhoogd.
- Schaalbaarheid: Compatibel met aanpassing aan multi-well platen voor het screenen van de effecten van verbindingen op subcellulaire cAMP-dynamiek.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Toepasbaar op pulmonale microvasculaire endotheelcellen, ter ondersteuning van translationele studies naar vasculaire signaleringsroutes.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt of waargenomen cAMP-veranderingen het gevolg zijn van werkelijke modulatie van de route versus imaging-artefacten door spectrale overlap.
- Preklinische continuïteit: Maakt longitudinale tracking van cAMP-dynamiek mogelijk, van ontdekking tot functionele validatie in ziekterelevante systemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van hypothesen over targets tot lead-optimalisatie, door ruimtelijk opgeloste, kwantitatieve readouts van second-messengeractiviteit te leveren.
- Discoverybiologie: Ondersteunt hypothesetests door cAMP-dynamiek in kaart te brengen als reactie op GPCR-agonisten of adenylylcyclase-modulatoren.
- Screening: Levert assay-klare, driedimensionale cAMP-gegevens met minder fout-positieven door spectrale interferentie.
- Analytica: Genereert FRET-efficiëntie en cAMP-concentratiekaarten die vergelijking tussen behandelcondities en genetische perturbaties mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinisch werk door gebruik in primaire endotheelcellen en aanpasbaarheid aan ziektemodellen.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbare imaging-kerncapaciteit voor het bestuderen van ruimtelijke signalering in meerdere second messenger-systemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in cAMP-signalering door axiale en laterale distributies op te lossen.
- Operationele waarde: Standardiseert FRET-metingen via spectrale bibliotheekgebaseerde unmixing en reproduceerbare acquisitieparameters.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door ruimtelijk gecontextualiseerde gegevens over target engagement te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van de getrouwheid van subcellulaire signalering.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in hyperspectrale beeldvorming, spectrale ontmenging en de validatie van FRET-biosensoren.
- Afhankelijk van confocale microscopie met een spectrale detector en een detectiecapaciteit van 32 kanalen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor het genereren van spectrale bibliotheken en ontmengingsparameters.
- Aanpassing aan andere celtypen kan optimalisatie van de labelingsdichtheid en z-stack-parameters vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten risico's op fotobleken tijdens langdurige z-stack-acquisitie en de computationele eisen van spectrale verwerking.
