Name: Meting van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer hyperspectrale FRET-beeldvorming om driedimensionale cAMP-distributies in levende cellen te meten met behulp van confocale microscopie en lineaire spectrale ontmenging. Deze methode verbetert de analyse van cellulaire signaaltransductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dr. Kees Jalink (Het Nederlands Kanker Instituut en van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Nederland) bedanken voor het leveren van de H188 cAMP FRET biosensor en Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) voor technische hulp bij het verkorten van de tijd die nodig is om onze op maat ontwikkelde programmeerscripts uit te voeren.
De auteurs willen graag de financieringsbronnen erkennen: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

<ol><li>Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate+and+adenosine+3%27%3A5%27-monophosphate-dependent+protein+kinase+in+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue.</a> The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).</li>
<li>Terrin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE1+stimulation+of+HEK293+cells+generates+multiple+contiguous+domains+with+different+%5BcAMP%5D%3A+role+of+compartmentalized+phosphodiesterases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases.</a> The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).</li>
<li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+dynamics+of+cAMP+and+protein+kinase+A+subunits+in+Aplysia+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons.</a> Science. 260, 222-226 (1993).</li>
<li>Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+aspects+of+cAMP+signalling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes.</a> Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).</li>
<li>Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+compartmentation+of+cyclic+AMP+and+protein+kinase+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cyclic+Nucleotide+Research%22%5BJournal%5D)">Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart.</a> Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).</li>
<li>Hohl, C. M., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+cAMP+in+adult+canine+ventricular+myocytes.+Relation+to+single-cell+free+Ca2%2B+transients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients.</a> Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).</li>
<li>Rich, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uniform+extracellular+stimulus+triggers+distinct+cAMP+signals+in+different+compartments+of+a+simple+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).</li>
<li>Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+adenylyl+cyclase+reveals+the+significance+of+cAMP+compartmentation+on+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier.</a> Circulation Research. 98, 675-681 (2006).</li>
<li>Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+local+phosphodiesterase+activity+using+tailored+cyclic+nucleotide-gated+channels+as+cAMP+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors.</a> The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).</li>
<li>Blackman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDE4D+and+PDE4B+function+in+distinct+subcellular+compartments+in+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).</li>
<li>Sayner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+cAMP-induced+lung+endothelial+hyperpermeability+revealed+by+Pseudomonas+aeruginosa+ExoY%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY.</a> Circulation Research. 95, 196-203 (2004).</li>
<li>Klarenbeek, J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP+with+an+EPAC-based+FRET+sensor+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).</li>
<li>Surdo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+biosensor+uncovers+cAMP+nano-domains+at+%CE%B2-adrenergic+targets+that+dictate+precise+tuning+of+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility.</a> Nature Communications. 8, 15031(2017).</li>
<li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%3A+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).</li>
<li>Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fanciful+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Fanciful FRET.</a> Science's STKE. 2006, (2006).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+History+of+FRET%3A+From+conception+through+the+labors+of+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">The History of FRET: From conception through the labors of birth.</a> Reviews in Fluorescence. 3, (2006).</li>
<li>Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li>
<li>Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+by+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+microscopy+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells.</a> Current Protocols in Protein Science. 93, 58(2018).</li>
<li>Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclases+and+the+interaction+between+calcium+and+cAMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling.</a> Nature. 374, 421-424 (1995).</li>
<li>Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+gene+expression+to+cAMP+signalling%3A+role+of+CREB+and+CREM%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).</li>
<li>Rebhun, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotides%2C+calcium%2C+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotides, calcium, and cell division.</a> International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).</li>
<li>Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fourth-generation+Epac-based+FRET+sensors+for+cAMP+feature+exceptional+brightness%2C+photostability+and+dynamic+range%3A+characterization+of+dedicated+sensors+for+FLIM%2C+for+ratiometry+and+with+high+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity.</a> PLOS ONE. 10, 0122513(2015).</li>
<li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET%3A+signals+hidden+within+the+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">FRET: signals hidden within the noise.</a> Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).</li>
<li>Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+decipher+the+information+content+contained+within+cyclic+nucleotide+signals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals.</a> The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).</li>
<li>Annamdevula, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+of+FRET-based+sensors+reveals+sustained+cAMP+gradients+in+three+spatial+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions.</a> Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).</li>
<li>Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+FRET+using+spectral+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Assessing FRET using spectral techniques.</a> Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).</li>
<li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+limitations+of+FRET+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Overcoming limitations of FRET measurements.</a> Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).</li>
<li>Fink, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Earcths+Resources+from+Space%5BTitle%5D)+AND+%22Technology+Review%22%5BJournal%5D)">Monitoring Earcths Resources from Space.</a> Technology Review. 75, 32-41 (1973).</li>
<li>Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Spectrometry+for+Earth+Remote+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing.</a> Science. 228, 1147-1153 (1985).</li>
<li>Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-FLIM+applications+in+plant+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">FRET-FLIM applications in plant systems.</a> Protoplasma. 251, 383-394 (2014).</li>
<li>Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spectral+FRET+imaging+microscopy+for+monitoring+nuclear+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions.</a> Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).</li>
<li>Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+FRET+Efficiency+using+Excitation-Scanning+Hyperspectral+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging.</a> Biophysical Journal. 112, 586(2017).</li>
<li>Favreau, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-scanning+hyperspectral+imaging+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope.</a> Journal of Biomedical Optics. 19, 046010(2014).</li>
<li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).</li>
<li>Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+multiphoton+spectral+imaging+and+its+use+for+measuring+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer.</a> Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).</li>
<li>Agarwal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+cAMP+signaling+associated+with+lipid+raft+and+non-raft+membrane+domains+in+adult+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 332(2018).</li>
<li>Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signaling+compartmentation%3A+Adenylyl+cyclases+as+anchors+of+dynamic+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes.</a> Mol Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+measurement+using+emission-spectral+unmixing+with+independent+excitation+crosstalk+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction.</a> Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).</li>
<li>Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IIem-spFRET%3A+improved+Iem-spFRET+method+for+robust+FRET+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 105003(2016).</li>
<li>Levy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpRET%3A+highly+sensitive+and+reliable+spectral+measurement+of+absolute+FRET+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency.</a> Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).</li>
<li>West, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+Measurements+Allow+Separation+of+FRET+Signals+from+Non-Uniform+Background+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence.</a> Biophysical Journal. 112, 453(2017).</li>
<li>Annamdevula, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+for+characterizing+and+comparing+hyperspectral+microscopy+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems.</a> Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).</li>
</ol>

Drs. Leavesley en Rich onthullen financieel belang in een startend bedrijf, SpectraCyte, LLC, dat werd opgericht om spectrale beeldvormingstechnologieën te commercialiseren. Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn echter uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgbare producten die niet zijn gekoppeld aan SpectraCyte, LLC.

De ontwikkeling van FRET-biosensoren heeft de meting en visualisatie van cyclische nucleotidesignalen in afzonderlijke cellen mogelijk gemaakt, en er is een grote belofte voor het visualiseren van subcellulaire signaleringsgebeurtenissen13,22,37,38. Het gebruik van FRET-biosensoren vertoont echter verschillende beperkingen, waaronder de lage signaal-ruiskenmerken van veel op fluorescerende eiwi...

Cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) is een tweede boodschapper die betrokken is bij belangrijke cellulaire en fysiologische processen, waaronder celdeling, calciuminstroom, gentranscriptie en signaaltransductie. Een groeiend aantal bewijzen suggereert het bestaan van cAMP-compartimenten in de cel waardoor signaleringsspecificiteit wordt bereikt1,2,3,4,5,6,7. Tot voor kort werd cAMP-compartimentering afgeleid op basis van verschillende fysiologische of cellulaire effecten geïnduceerd door verschillende G-gekoppelde receptoragonisten8,9,10,11. Meer recent hebben fret-gebaseerde fluorescentiebeeldvormingssondes nieuwe benaderingen geboden voor de directe meting en observatie van cAMP-signalen in een cel12,13,14.
Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een fysisch fenomeen waarbij energieoverdracht plaatsvindt tussen donor- en acceptormoleculen op een niet-stralingsve manier wanneer de moleculen zich in de nabijheid bevinden15,16. Met de ontwikkeling van FRET-gebaseerde fluorescerende indicatoren is dit fysische fenomeen gebruikt in biologische toepassingen om eiwit-eiwitinteracties17,eiwitcolokalisatie18,Ca+2-signalering 19,genexpressie20,celdeling21 en cyclische nucleotidesignalering te bestuderen. FRET-gebaseerde cAMP-indicatoren bestaan doorgaans uit een cAMP-bindingsdomein, een donorfluoofoor en een acceptorfluoofoor22. De H188 cAMP-sensor12,22 die in deze methodologie wordt gebruikt, bestaat bijvoorbeeld uit een cAMP-bindingsdomein verkregen van Epac, ingeklemd tussen Turquoise (donor) en Venus (acceptor) fluoroforen. Bij basale omstandigheden (ongebonden) bevinden Turkoois en Venus zich in een zodanige oriëntatie dat FRET optreedt tussen de fluoroforen. Bij binding van cAMP aan het bindingsdomein treedt een conformatieverandering op die zodanig dat Turquoise en Venus uit elkaar bewegen, wat resulteert in een afname van FRET.
FRET-gebaseerde beeldvormingsbenaderingen bieden een veelbelovend hulpmiddel voor het onderzoeken en visualiseren van cAMP-signalen in een cel. De huidige op FRET gebaseerde microscopische beeldvormingstechnieken zijn echter vaak slechts gedeeltelijk succesvol in het bereiken van voldoende signaalsterkte om FRET met subcellulaire ruimtelijke helderheid te meten. Dit komt door verschillende factoren, waaronder de beperkte signaalsterkte van veel FRET-verslaggevers, de hoge mate van precisie die nodig is om veranderingen in FRET-efficiëntie nauwkeurig te kwantificeren en de aanwezigheid van verstorende factoren, zoals cellulaire autofluorescentie23,24. Het resultaat is vaak een FRET-beeld dat wordt geplaagd door zwakke SNR, waardoor visualisatie van subcellulaire veranderingen in FRET erg moeilijk is. Bovendien is onderzoek naar ruimtelijk gelokaliseerde cAMP-signalen bijna uitsluitend uitgevoerd in slechts twee ruimtelijke dimensies en is de axiale cAMP-verdeling zelden beschouwd25. Dit komt waarschijnlijk omdat een lage SNR de mogelijkheid belemmerde om cAMP-gradiënten in drie ruimtelijke dimensies te meten en te visualiseren. Om beperkingen van het gebruik van FRET-sensoren met een lage SNR te overwinnen, hebben we hyperspectrale beeldvormings- en analysebenaderingen geïmplementeerd om FRET in afzonderlijke cellen te meten25,26,27.
Hyperspectrale beeldvormingsbenaderingen werden ontwikkeld door NASA om terrestrische objecten te onderscheiden die aanwezig zijn in satellietbeelden28,29. Deze technieken zijn sindsdien vertaald naar het fluorescentiemicroscopieveld30, met verschillende commerciële confocale microscoopsystemen die spectrale detectoren aanbieden. In traditionele (niet-spectrale) fluorescentiebeeldvorming wordt het monster geëxciteerd met behulp van een banddoorlaatfilter of een laserlijn en wordt de emissie verzameld met behulp van een tweede banddoorlaatfilter, vaak geselecteerd om overeen te komen met de piekemissiegolflengte van de fluorofoor (en). Hyperspectrale beeldvormingsbenaderingen daarentegen proberen een volledig spectraal profiel te bemonsteren van ofwel de fluorescentie-emissie26,31,32 of excitatie33,34 op specifieke golflengte-intervallen. In onze eerdere studies toonden we aan dat hyperspectrale beeldvormings- en analysebenaderingen een verbeterde kwantificering van FRET-signalen in cellen kunnen bieden in vergelijking met traditionele filtergebaseerde FRET-beeldvormingstechnieken26. Hier presenteren we een methodologie voor het uitvoeren van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse om cAMP-verdelingen in drie ruimtelijke dimensies te meten en te visualiseren. Deze benaderingen hebben visualisatie van agonist-geïnduceerde cAMP ruimtelijke gradiënten in afzonderlijke cellen mogelijkgemaakt 25. Interessant is dat, afhankelijk van de agonist, cAMP-gradiënten zichtbaar kunnen zijn in cellen. De hier gepresenteerde methodologie maakt gebruik van spectrale ontmenging van niet-uniforme achtergrond en cellulaire autofluorescentie om de nauwkeurigheid van de FRET-metingen te verbeteren. Hoewel deze methodologie wordt gedemonstreerd in pulmonale microvasculaire endotheelcellen (PMVECs) met behulp van een cAMP FRET-biosensor, kan de methodologie gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met alternatieve FRET-reporters of alternatieve cellijnen.

```html
<table>
 <tbody>
 <tr>
 <td>Attofluor Cell Chamber</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A7816</td>
 <td>Attofluor bevat stalen cellkamers en een rubberen O-ring. De cellkamer houdt de dekglas vast en de O-ring zorgt voor een vergrendelingsmechanisme om de buffer in de cellkamer te houden zonder lekkage</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP231-100</td>
 <td>Oplosmiddel dat wordt gebruikt om een voorraadoplossing forskolin te bereiden.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DRAQ5 Fluorescent Probe Solution</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>62252</td>
 <td>Kernlabel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11965-092</td>
 <td>Bevat voedingsstoffen en groeifactoren voor de cellen om te groeien en zich te delen in de kweekschalen.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F6178</td>
 <td>Groeifactorsupplement dat wordt toegevoegd aan het kweekmedium, DMEM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forskolin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F3917</td>
 <td>Adenylylcyclase-activator.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H188 Cyclic AMP FRET biosensor</td>
 <td>Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink</td>
 <td>Gift</td>
 <td>Plasmid dat Turquoise (donor fluorofoor), Venus (acceptor fluorofoor) en bindingsdomein codeert verkregen uit Epac.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Image J</td>
 <td>image.net</td>
 <td>Gratis download</td>
 <td>Een andere beeldverwerkingsplatform die wordt gebruikt om spectrale informatie en beeldverwerking te extraheren.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Integrating Sphere</td>
 <td>Ocean Optics</td>
 <td>FOIS-1</td>
 <td>Wordt gebruikt om de verlichtingsintensiteit van de laserlijn bij verschillende laserintensiteiten te meten (?).</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>23017-015</td>
 <td>Dekglazen zijn bedekt met laminine en dit helpt bij hechting, groei en beweeglijkheid van de cel.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lipofectamine 3000 Transfection Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>L3000-015</td>
 <td>Transfectiereagens dat wordt gebruikt om cellen te transfecteren met H188 FRET biosensor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MATLAB</td>
 <td>Mathworks</td>
 <td>R2019a</td>
 <td>Beeldverwerkingsoperaties (lineaire unmixing en FRET-efficiëntieberekeningen) worden uitgevoerd door het schrijven van aangepaste programma's in de MATLAB-programmeeromgeving</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nikon A1R confocale microscoop</td>
 <td>Nikon Instruments</td>
 <td>Nikon A1R</td>
 <td>Spectraal beeldverwerving wordt uitgevoerd met behulp van een confocale microscoop.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nikon Elements Software</td>
 <td>Nikon Instruments</td>
 <td>Software dongle</td>
 <td>wordt gebruikt om nd2-beeldbestanden (multidimensionale beeldbestanden) te exporteren en te verwerken die zijn verkregen met behulp van Nikon A1R</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
 <td>Ocean Optics</td>
 <td>LS-1-CAL-INT</td>
 <td>Een lamp met een bekend spectrum voor gebruik als standaard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS pH 7.4 (1X)</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10010-023</td>
 <td>Meestal gebruikte buffer tijdens celkweek</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs)</td>
 <td>In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama</td>
 <td>Geïsoleerd uit de pulmonaire microvatsculatuur van ratten</td>
 <td>PMVECs vormen de binnenbekleding van een bloedvat.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15140-122</td>
 <td>Antibiotica worden toegevoegd aan het kweekmedium om besmetting van de cellen te voorkomen.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides</td>
 <td>Clay Adams</td>
 <td>3010</td>
 <td>Microscoopglaasjes die worden gebruikt voor celfixatie</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ProLong Diamond Antifade Mounting Media</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P36961</td>
 <td>Als monsters worden gefixeerd met behulp van antifade-montant, beschermt deze later de fluorescente kleurstoffen en chromoforen tegen vervagen.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrometer</td>
 <td>Ocean Optics</td>
 <td>QE65000</td>
 <td>Wordt gebruikt om de spectrale respons van de lichtbron te meten (?)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200-056</td>
 <td>Verteert de eiwit-eiwitbinding tussen de cel en het celmatrix en helpt bij het losmaken en opheffen van de cellen tijdens celplakken.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tyrodes Buffer</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td>Tyrodes buffer wordt gebruikt om werkoplossingen te maken en om cellen in waterige oplossing te houden tijdens beeldacquisitie.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6 Well Cell Culture Plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3506</td>
 <td>Laminine gecoate dekglazen worden geplaatst in een 6-wels kweekschaal (één dekglas/wels). Cellen samen met medium worden in elke wels toegevoegd.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 mm Round Microscope Cover Slips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>12545102</td>
 <td>Cellen werden gekweekt op ronde glazen dekglazen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60X Objectief</td>
 <td>Nikon Instruments</td>
 <td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &infin;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
 <td>water-immersie en veel gebruikt objectief voor cellen</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
```

meting van 3-dimensionale camp-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale fret-beeldvorming en -analyse

Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and &lambda;) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis

Cyclisch AMP is een tweede boodschapper die betrokken is bij een breed scala aan cellulaire en fysiologische activiteiten. Verschillende studies suggereren dat cAMP-signalen gecompartimenteerd zijn en dat compartimentering bijdraagt aan signaleringsspecificiteit binnen de cAMP-signaleringsroute. De ontwikkeling van op Fӧrster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde biosensoren heeft het vermogen bevorderd om cAMP-signalen in cellen te meten en te visualiseren. Deze metingen zijn echter vaak beperkt tot twee ruimtelijke dimensies, wat kan resulteren in een verkeerde interpretatie van gegevens. Tot op heden zijn er slechts zeer beperkte metingen van cAMP-signalen in drie ruimtelijke dimensies (x, y en z) geweest, vanwege de technische beperkingen bij het gebruik van FRET-sensoren die inherent een lage signaal-ruisverhouding (SNR) vertonen. Bovendien zijn traditionele filtergebaseerde beeldvormingsbenaderingen vaak niet effectief voor nauwkeurige meting van cAMP-signalen in gelokaliseerde subcellulaire gebieden vanwege een reeks factoren, waaronder spectrale overspraak, beperkte signaalsterkte en autofluorescentie. Om deze beperkingen te overwinnen en fret-gebaseerde biosensoren te kunnen gebruiken met meerdere fluoroforen, hebben we hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysebenaderingen ontwikkeld die spectrale specificiteit bieden voor het berekenen van FRET-efficiëntie en de mogelijkheid om FRET-signalen spectraal te scheiden van verstorende autofluorescentie en / of signalen van extra fluorescerende labels. Hier presenteren we de methodologie voor het implementeren van hyperspectrale FRET-beeldvorming, evenals de noodzaak om een geschikte spectrale bibliotheek te construeren die niet ondersampled of oversampled is om spectrale ontmenging uit te voeren. Terwijl we deze methodologie presenteren voor het meten van driedimensionale cAMP-verdelingen in pulmonale microvasculaire endotheelcellen (PMVECs), kan deze methodologie worden gebruikt om ruimtelijke verdelingen van cAMP in een reeks celtypen te bestuderen.

Dit protocol beschrijft het gebruik van hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysebenaderingen om cAMP-gradiënten in drie ruimtelijke dimensies in levende cellen te meten. Er zijn verschillende belangrijke stappen betrokken bij het genereren van deze resultaten, waarvoor zorgvuldige aandacht vereist is bij het analyseren en kwantificeren van de gegevens. Deze belangrijke stappen omvatten de bouw van een geschikte spectrale bibliotheek, achtergrondspectraal onmenging, drempeling om celgrenzen te identificeren en FRET-e...

Vanwege de inherente lage signaal-ruisverhouding (SNR) van Fӧrster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde sensoren, is het meten van cAMP-signalen een uitdaging geweest, vooral in drie ruimtelijke dimensies. Hier beschrijven we een hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysemethodologie die het mogelijk maakt om de cAMP-verdeling in drie ruimtelijke dimensies te meten.

Meting van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse

Cyclic AMP is a second messenger that is involved in a wide range of cellular and physiological activities. Several studies suggest that cAMP signals are ...

Dit protocol is belangrijk omdat het een methode biedt voor het meten en visualiseren van FRET- of cyclisch AMP-signalen in drie ruimtelijke dimensies in individuele cellen. Cyclisch AMP-verdelingen kunnen zich naast lateraal ook axiaal voordoen en het is belangrijk om FRET cyclisch AMP-beeldgegevens in drie dimensies te verzamelen om deze verdelingen te bemonsteren. Op de dag van beeldvorming, verwarm Tyrodes buffer tot 37 graden Celsius in een waterbad en monteer een dekglas met de getransfecteerde cellen van belang in een cellenkamer.Bevestig de bovenkant van de kamer met een montagepakking om lekkage te voorkomen en gebruik een delicate taakveger om eventueel overtollig medium of adherante cellen van de onderkant van het dekglas te verwijderen. Voeg 800 microliters werkbuffer en vier microliters van vijf millimolair nucleair label toe aan de cellenkamer en schud de kamer voorzichtig vijf tot 10 seconden. Dek vervolgens de cellenkamer af met aluminiumfolie voor een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur.Om de cellen te beeldvormen, selecteer de 60X waterimmersie-objectief op een confocale microscoop uitgerust met een spectraal detector en voeg een druppel water toe aan het objectief. Plaats de geladen cellenkamer op het microscoopplatform en stel de filterknop in om de juiste filterset te selecteren. Selecteer de modus voor fluorescentie-veldverlichting en gebruik de oogstukken om een gezichtsveld te selecteren dat cellen bevat die de FRET cyclisch AMP-sensor tot expressie brengen.Open de beeldvormingssoftware, selecteer de confocale modus en ontgrendel de laserinterlock-knop. Open het A1-instellingenmenu. Vink de vakken aan die overeenkomen met de laserlijnen van 405 en 561 nanometer en stel deze spectrale detecties in op SD, de resolutie op 10 en de kanalen op 32.Selecteer de start- en eindgolflengtewaarden om het golflengtebereik in te stellen. Open het A1-instellingenmenu om het binning-skip-pictogram te selecteren. Selecteer het vak met het getal 15 en klik op OK.Stel de laserintensiteiten in op acht procent voor de 405 nanometer-laser en op twee procent voor de 561 nanometer-laser.Stel de detectorversterking in op 149 en de pinholeradius op 2,4 Airy disk-eenheden. Stel de scansnelheid in op 25 spectrale frames per seconde en selecteer de unidirectionele scanrichting. Stel het aantal op vier en de scanschaal op 1024 bij 1024.Om de z-stack-acquisitieparameters te definiëren, klik op Beeld, Acquisitiecontrole en ND-acquisitie en voer de bestemming en naam van het bestand in het pop-upvenster in om het ND-bestand op te slaan. Klik op het z-serievak en klik op Live in het A1 Plus-instellingenvenster om een live beeldvenster te openen. Stel de focusknop in om op de cellen te focussen terwijl u in het voorbeeldvenster kijkt.Stel de focusknop op de microscoop in om de bovenkant van de cel te selecteren en klik op Boven in het ND-acquisitievenster om de huidige positie als bovenkant in te stellen. Stel de focusknop op de microscoop in om de onderkant van de cel te selecteren en klik op Onder om de huidige positie als onderkant in te stellen. Voer één micrometer in voor de stapgrootte.Selecteer Boven Onder voor de z-scanrichting en klik op uitvoeren om een z-stack te verkrijgen. Wanneer de z-stack-acquisitie voltooid is, gebruik een pipet om het reagens van belang voorzichtig aan de kamer toe te voegen zonder de cellen te verstoren. Na 10 minuten, verander de bestandsnaam en verwerf een tweede z-stack-beeld.Na het beeldvormen, maak nieuwe mappen met dezelfde bestandsnamen als de spectrale z-stack-afbeeldingen en open het spectrale beeldbestand van belang. Klik op Bestand, Importeren/Exporteren en ND-document exporteren. Selecteer in het pop-upvenster de nieuw gemaakte map, TIFF voor het bestandstype, Mono-afbeelding voor elke kanaal en behoud de bitdiepte.Klik op exporteren om de individuele bestanden naar de map te exporteren en open de lineaire spectrale unmixing-software. Open het Linear Unmixing. m-bestand en klik op Uitvoeren.Blader en selecteer de map met de geëxporteerde TIFF-bestandssequentie en klik op OK om het golflengte- en z-slicevenster te openen. Kopieer de bestandsnaam van het eerste bestand zonder de z-slice en het kanaalnummer uit de map en plak deze in de eerste stap van de Enter of the imagename-box, voer het aantal kanalen in in de Enter the number of wavelength bands-box en het aantal z-slices in de Enter the number of Z Slices-box en klik op OK.Bekijk vervolgens in het pop-upvenster en selecteer het Wavelength. mat-bestand en klik op Openen.Blader en selecteer het Library. mat-bestand in het nieuwe pop-upvenster en klik opnieuw op Openen om het slice-unmixing te initiëren. Om de FRET-efficiëntie te berekenen, open de multiFRRC..m programmeerscript en voer het aantal experimentele proeven in dat moet worden geanalyseerd in het How many folders to reslice-vak. Klik op OK.Blader om de ongemengde mappen te selecteren en klik opnieuw op OK.Stel in het nieuwe pop-upvenster de schaalfactor in op 12,4, de drempelwaarde op 56, de X, Y en Z-frequentie op respectievelijk vijf, vijf en één en het uitgloeialgoritme op Gaussiaans.Klik vervolgens op Uitvoeren om de FRET-metingen en reslicing uit te voeren. Om de FRET-efficiëntie tot cyclisch AMP-niveaus te mappen, open het Mapping_FRET.Efficiency_to_cAMP_concentration. m-bestand en klik op Uitvoeren.Navigeer naar en selecteer de eerste grijswaardige FRET-afbeelding en klik op OK.Open vervolgens de FRET cyclisch AMP-afbeeldingen om de verdeling van de cyclisch AMP-signalen in drie dimensies te inspecteren. In deze afbeeldingen kunnen driedimensionale weergaven van vals gekleurde ruwe hyperspectrale beeldgegevens worden waargenomen die zijn verkregen met behulp van confocale microscopie bij baseline en 10 minuten na forskoline-behandeling. In deze analyse werd een acceptor-fluorofoor volledig foto-gedestructureerd, waardoor spectrale signaturen van de donor en acceptor met een één-op-één stoichiometrie konden worden verkregen.Niet-getransfecteerde cellen gelabeld met een nucle

measurement-3-dimensional-camp-distributions-living-cells-using-4

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij ontwikkelden een software platform dat Imaris Neuroscience, ImarisXT en MATLAB om de veranderingen in morfologie van een ongedefinieerde vorm uit driedimensionale confocale fluorescentie van afzonderlijke cellen te meten gebruikt. Deze nieuwe benadering kan worden gebruikt om veranderingen in celvorm na receptor activatie kwantificeren en dus een mogelijke extra hulpmiddel voor drug discovery.

Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor real-time celbiologie studies. Hier een werkwijze voor FRET beeldvorming cellen in fysiologische driedimensionale (3D) hydrogel microenvironments middels conventionele epifluorescentie microscopie wordt gepresenteerd. Een analyse voor ratiometrische FRET probes die lineaire verhoudingen over de activering bereik oplevert wordt beschreven.

FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Beschrijven we een protocol voor de identificatie van label-vrij van lymfocyt subtypen met behulp van kwantitatieve fase beeldvorming en een machinaal leren algoritme. Metingen van 3D refractive index tomograms van lymfocyten 3D morfologische en biochemische informatie voor individuele cellen, die vervolgens wordt geanalyseerd met een machine-leren algoritme voor de identificatie van celtypes presenteren.

Label-gratis identificatie van lymfocyt subtypen met behulp van drie-dimensionale kwantitatieve fase Imaging en Machine Learning

Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.

4D microscopie van gist

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.

Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Hier presenteren we een protocol dat gebruik maakt van optische fotothermische infrarood-fluorescentie in situ hybridisatie (OPTIR-FISH), ook bekend als mid-infrarood fototherme-FISH (MIP-FISH), om individuele cellen te identificeren en hun metabolisme te begrijpen. Deze methodologie kan breed worden toegepast voor diverse toepassingen, waaronder het in kaart brengen van het cellulaire metabolisme met een resolutie van één cel.

Optische fotothermische infrarood-fluorescentie in situ hybridisatie (OPTIR-FISH)

Dit protocol presenteert een multimodale benadering die Raman-spectroscopie en tomografische fasemicroscopie combineert voor labelvrije, niet-invasieve fenotypering van levende menselijke borstkankercellen. Het omvat een gebruiksvriendelijke, menselijke bias-vrije analysepijplijn voor snelle, kwantitatieve morfochemische analyse, die gedetailleerde moleculaire en structurele inzichten biedt met toepassingen in kankeronderzoek en celbiologie.

Een multimodaal beeldvormingskader om fenotypering van levende labelvrije borstkankercellen te bevorderen

Nauwkeurige analyse van multidimensionale microscopiegegevens vereist complexe workflows. In dit artikel wordt gedemonstreerd hoe u de software Cell-ACDC kunt gebruiken. Het maakt gebruik van state-of-the-art AI-gestuurde modellen voor segmentatie, tracking, celstamboomanalyse en kwantificering van microscopiegegevens. Cruciaal is dat het deze modellen aanvult met een innovatief raamwerk voor semi-geautomatiseerde correctie van de output van de modellen.

Analyse van multidimensionale microscopiegegevens met behulp van Cell-ACDC

Leer hyperspectrale FRET-beeldvorming om driedimensionale cAMP-distributies in levende cellen te meten met behulp van confocale microscopie en lineaire spectrale ontmenging. Deze methode verbetert de analyse van cellulaire signaaltransductie.

Meting van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse (Video) | JoVE Journal

Meting van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse

Meer video's verkennen