Name: Bereiding van virusverrijkt entmateriaal voor orale infectie van honingbijen (Apis mellifera) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Leer hoe je virusdeeltjes produceert uit honingbijpoppen voor gecontroleerde bioassays met Apis mellifera. Deze methode vereenvoudigt onderzoek naar virus-gastheerinteracties en bespaart arbeid vergeleken met celkweek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen Dr. Julia Fine bedanken voor haar ideeën en discussie tijdens het proces van het maken van het protocol, evenals Dr. Cassondra Vernier voor haar nuttige opmerkingen tijdens het bewerken. Deze materialen droegen bij aan projecten die mede werden ondersteund door de Foundation for Food and Agriculture Research, onder subsidie ID 549025.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben we methoden beschreven die elke stap van het virusversterkings- en entmateriaalbereidingsproces beschrijven, inclusief het verzamelen van larven en virusvermeerdering, extractie en concentratie, evenals virale behandeling in de vorm van kooivoedingsexperimenten. Deze methoden maken de productie van semi-zuivere virusdeeltjes mogelijk (figuur 4), waarvan de effectiviteit consequent kan worden gekwantificeerd door dosis-respons mortaliteitstests voor virussen die dodelijk zijn voor...

Honingbijen (Apis mellifera) spelen een cruciale rol in het moderne wereldwijde landbouwlandschap, maar lijden momenteel aan een combinatie van biotische en abiotische stressoren, waaronder blootstelling aan pesticiden, slecht ruwvoer, parasieten en pathogenen 1,2. Een van de belangrijkste pathogenen van zorg zijn virussen, waarvan er vele worden overgedragen door een andere van de belangrijkste honingbijstressoren, de parasitaire Varroamijt (Varroa destructor). Deze virussen kunnen een reeks negatieve effecten bij honingbijen veroorzaken, waaronder verminderde broedoverleving, ontwikkelingsstoornissen en verlamming die kunnen leiden tot totale ineenstorting van de korf, zowel voor als na overwinteringsperioden 3,4,5. Hoewel er veelbelovende vooruitgang is geboekt bij de ontwikkeling van technologieën die worden gebruikt om virusinfecties te bestrijden 6,7,8,9, is de dynamiek waarmee veel virussen zich verspreiden, verspreiden en interageren binnen een honingbij of kolonie nog steeds slecht begrepen 5,10 . Het begrijpen van de basisbiologie van honingbij- en virusinteracties en hun relaties met andere omgevingsfactoren is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van effectieve virusbeheertechnieken.
Het bestuderen van interacties tussen honingbijen en virussen vormt echter uitdagingen met tal van bekende en onbekende factoren die het proces bemoeilijken. Deze omvatten interacties met dieet11,12, blootstelling aan pesticiden13 en genetische achtergrond bijen14,15. Zelfs wanneer ze zich alleen richten op virusinfectie, komen complicaties vaak voor omdat honingbijenpopulaties, zowel beheerd als wild, altijd een zekere mate van achtergrondvirusinfectie hebben, hoewel vaak zonder acute symptomen te manifesteren16,17, en de effecten van virus-co-infectie zijn niet goed begrepen18. Dit heeft de studie van honingbijviruseffecten moeilijk te ontwarren gemaakt.
Veel honingbijvirusstudies hebben circumstantial virusinfecties gebruikt om te zoeken naar interacties met andere stressoren, waarbij wordt waargenomen hoe achtergrondinfecties veranderen met andere behandelingen 12,19,20,21. Hoewel deze aanpak succesvol is geweest bij het identificeren van belangrijke effecten, met name het ontdekken hoe pesticiden of dieetbehandelingen de virusniveaus en replicatie beïnvloeden, is inenting met een virusbehandeling met bekende inhoud en concentratie van cruciaal belang voor het experimenteel testen van de dynamiek van virusinfecties. Toch kan het scheiden van experimentele behandeling van achtergrondinfectie ook uitdagingen opleveren. In veldstudies hebben onderzoekers stammen van het misvormde vleugelvirus (DWV) gedifferentieerd om bewijs te leveren voor virusoverdracht van honingbijen naar hommels22, maar het gebruik van deze aanpak zou moeilijk zijn bij honingbijen alleen. Virus infectieuze klonen zijn een krachtig hulpmiddel, niet alleen voor het volgen van infectie 23,24,25 maar ook voor omgekeerde genetische studies van honingbijvirussen en voor virus-gastheer interactie onderzoek 26,27,28. In de meeste gevallen zijn infectieuze klonen echter nog steeds nodig om de infectiecyclus in cellen te vervullen om deeltjes te produceren. Dergelijke deeltjes hebben de voorkeur als inocula voor experimentele behandelingen omdat hun infectiviteit hoger is dan het naakte virale RNA en inenting met ingekapselde genomen een natuurlijke infectie nabootst.
De productie van zuivere, niet-verontreinigde inencula uit het honingbijenvirus (virusstammen van het wilde type of stammen die zijn afgeleid van infectieuze klonen) vormt ook een uitdaging. Deze zijn voornamelijk te wijten aan de moeilijkheden bij het verkrijgen van een betrouwbare, continu replicerende, virusvrije honingbijencellijn om zuivere stamvirussen te produceren29,30. Hoewel sommige cellijnen zijn geproduceerd, blijven deze systemen onvolmaakt; toch is er hoop dat er een levensvatbare cellijn kan worden geproduceerd29, die een fijnere controle van de virusproductie en -onderzoek mogelijk zou maken. Totdat een dergelijke lijn op grote schaal beschikbaar komt, zullen de meeste virusproductieprotocollen blijven vertrouwen op het gebruik van in vivo virusproductie en -zuivering 18,31,32,33,34. Deze benaderingen omvatten het identificeren en zuiveren van virusdeeltjes van belang (of het produceren van een infectieuze kloon) en het gebruik ervan om honingbijen te infecteren, meestal als poppen. De poppen worden geïnjecteerd met het doelvirus en vervolgens opgeofferd, en verdere deeltjes worden geëxtraheerd en gezuiverd. Omdat echter geen bijen om te beginnen virusvrij zijn, is er altijd een zekere mate van besmetting van sporen van andere virussen in een dergelijk concentraat, en daarom moet grote zorg worden besteed aan het kiezen van bijen met een lage kans op achtergrondinfecties. Verder zijn methoden voor het verwijderen van de poppen uit de kamcellen voor gebruik in deze protocollen33 zeer arbeidsintensief en kunnen ze stress bij de bijen veroorzaken, waardoor de productie op deze manier wordt beperkt18,32. Hier rapporteren we een alternatieve methode die grootschalige verwijdering van larven mogelijk maakt met weinig arbeid en minder mechanische stress op de bijen.
Zodra poppen zijn verkregen en geïnjecteerd met het beginnende virus entmateriaal, moeten ze worden geïncubeerd om het virus de tijd te geven zich te vermenigvuldigen. Vervolgens kunnen geproduceerde virusdeeltjes worden verwerkt tot een vorm die bruikbaar is om experimentele bijen te infecteren. Er zijn verschillende eenvoudige methoden om dit te bereiken, waaronder het gebruik van een ruw homogenaat35,36 of hemolymfe gegenereerd door viraal geïnfecteerde bijen als een bron van infectie37. Deze methoden zijn effectief, maar lopen op een grotere kans om onbekende variabelen uit het achtergrondsubstraat te introduceren (bijvoorbeeld andere factoren in de dode bijenhomogenaten). Bovendien is het wenselijk om de deeltjes te concentreren als een experiment vereist dat in korte tijd een grote, bekende dosis van een virus wordt gegeven. Daarom heeft het voor een betere controle de voorkeur om methoden te gebruiken die een zekere mate van zuivering en concentratie van de virusdeeltjes mogelijk maken. Over het algemeen zal een reeks neerslag- en centrifugeringsstappen resulteren in de verwijdering van bijna al het mogelijke niet-doelvirusmateriaal33.
Na de productie van dit geconcentreerde entmateriaal is het gunstig om de virale titers (qPCR) te kwantificeren en te karakteriseren met in vivo bioassays om de levensvatbaarheid en het vermogen om sterfte te veroorzaken te testen, en om te bevestigen dat verhoogde virustiters worden verkregen na infectie. Dit kan worden bereikt door injectie-experimenten (in poppen of volwassenen) of voedingsexperimenten (in larven of volwassenen). Hoewel al deze benaderingen mogelijk zijn, is het voeren aan groepen volwassen bijen in een kooi vaak de snelste en eenvoudigste. De kooitestmethode wordt ook veel gebruikt voor het testen van verschillende andere behandelingen op bijen, waaronder pesticidentoxiciteit38, ovariumontwikkeling39 en voedingsinvloed op gedrag40,41 en kan daarom een goede basis vormen voor experimenten die virusinfectie koppelen aan andere factoren42.
Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het produceren van grote hoeveelheden semi-zuivere, hoogverrijkte virusdeeltjes zonder een dure ultracentrifuge te gebruiken, inclusief een methode voor het verwijderen van poppen die arbeid en mechanische stress op de bijen vermindert en een zeer herhaalbare, high-throughput bioassay voor het testen van virale infectie en effecten. Door de zuiverheid van het virale entapparaat strak te controleren, kunnen onderzoekers de variatie in de virale respons van honingbijen verminderen ten opzichte van andere virale inentingsmethoden. Bovendien kan de bioassay screenen op virale effecten op een niveau van kleine groepen met behulp van zeer herhaalbare experimentele eenheden voordat wordt geschaald naar veldrealistische instellingen, wat veel arbeidsintensiever is om te beheren. In combinatie bieden deze twee methoden de nodige hulpmiddelen voor studies die kunnen helpen ons algehele begrip van fysiologische interacties tussen honingbijen en virussen te verbeteren.

<table><tbody><tr><td>10% bleekvloeistoplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanoloplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kotten voor bioassay</td><td></td><td></td><td>Afhankelijk van experimentele opstelling</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0,1 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td>Optioneel (indien geen spuitapparaat beschikbaar is)</td></tr><tr><td>Containers voor zelfverwijdering van larven</td><td></td><td></td><td>Moeten ongeveer 19" x 9-1/8" meten (Langstroth diepe frame afmetingen)</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td></td><td></td><td>Blunt, zachte pincetten voor larveseparatie; blunt, harde pincetten voor pop-excisie</td></tr><tr><td>Afzuigkap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>Capabel om 34 &ordm;C en 50% relatieve luchtvochtigheid te handhaven</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Elke absorberende doek zal werken</td></tr><tr><td>Gemiddelde gewichtsboten</td><td></td><td></td><td>Dienen als inoculum trays</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa met Biomax membraan</td><td>MilliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitril handschoenen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferd zoutoplossing (PBS)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde tafelcentrifuge</td><td></td><td></td><td>Capabel om 15.000 x g</td></tr><tr><td>Gekoelde centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capabel om 21.000 x g</td></tr><tr><td>Repeater M4 Multipipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Optioneel (indien geen spuitapparaat beschikbaar is)</td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-vrije water</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

bereiding van virusverrijkt entmateriaal voor orale infectie van honingbijen (apis mellifera)

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Honingbijen zijn van groot ecologisch en agrarisch belang over de hele wereld, maar zijn ook onderhevig aan een verscheidenheid aan druk die de gezondheid van bijen negatief beïnvloedt, waaronder blootstelling aan virale pathogenen. Dergelijke virussen kunnen een breed scala aan verwoestende effecten veroorzaken en kunnen vaak een uitdaging zijn om te bestuderen vanwege meerdere factoren die het moeilijk maken om de effecten van experimentele behandelingen te scheiden van reeds bestaande achtergrondinfectie. Hier presenteren we een methode om grote hoeveelheden virusdeeltjes massaal te produceren, samen met een bioassay met hoge doorvoer om virale infecties en effecten te testen. Noodzakelijk door het huidige gebrek aan een continue, virusvrije cellijn van honingbijen, worden virale deeltjes in vivo versterkt met behulp van honingbijpoppen, die in grote hoeveelheden uit de korf worden geëxtraheerd met behulp van minimaal stressvolle methodologie. Deze virusdeeltjes kunnen vervolgens worden gebruikt in bioassays van honingbijenkooien om de levensvatbaarheid van inentcula te testen, evenals verschillende andere virusinfectiedynamiek, waaronder interacties met voeding, pesticiden en andere pathogenen. Een groot voordeel van het gebruik van dergelijke deeltjes is dat het de kans op het introduceren van onbekende variabelen in latere experimenten aanzienlijk vermindert in vergelijking met de huidige alternatieven, zoals infectie via geïnfecteerde bijenhemolymfe of homogenaat, hoewel er nog steeds voorzichtig moet worden omgegaan bij het vinden van de bijen, om achtergrondvirusbesmetting te minimaliseren. De kooitests zijn geen vervanging voor grootschalige, veldrealistische experimenten die virusinfectie-effecten op kolonieniveau testen, maar functioneren in plaats daarvan als een methode om baseline virale reacties vast te stellen die, in combinatie met de semi-zuivere virusdeeltjes, kunnen dienen als belangrijke hulpmiddelen om verschillende dimensies van fysiologische interacties tussen honingbijen en virussen te onderzoeken.

Het succesvol volgen van de protocollen (figuren 1) voor popinjectie en virale extractie zou grote hoeveelheden virusdeeltjes moeten produceren. Het bemonsteren en injecteren van poppen afkomstig uit verschillende kolonies op meerdere tijdstippen maximaliseert echter de kans op het verkrijgen van doelvirus met een lage besmetting. De dynamiek waarmee virussen zich binnen een honingbij vermenigvuldigen en met elkaar interageren, is niet goed begrepen; in combinatie met de waarschijnlijkheid van reeds best...

Hier beschrijven we twee protocollen: ten eerste om grote hoeveelheden niet-omhulde virusdeeltjes van honingbijen te vermeerderen, te extraheren, te zuiveren en te kwantificeren, inclusief een methode voor het verwijderen van honingbijpoppen en ten tweede om de effecten van virale infectie te testen met behulp van een zeer herhaalbare kooibioassay met hoge doorvoer.

Bereiding van virusverrijkt entmateriaal voor orale infectie van honingbijen (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Ons protocol laat zien hoe je op grote schaal honingbijvirusdeeltjes kunt produceren voor gebruik in gecontroleerde, high-throughput bioassays voor snel screenen van de effectiviteit van virale behandelingen. De assay gebruikt gemakkelijk te kweken bijpoppen in plaats van celcultuur, waardoor het werk om experimentele onderwerpen te verkrijgen wordt verminderd. Het virus kan vervolgens worden gebruikt om voorspelbare sterftecurven en herhaalbare bioassays te produceren.Er is aanzienlijk belangstelling geweest om te begrijpen hoe zogenaamde honingbijvirussen een groter gastheerbereik beïnvloeden. Deze virusproductietechniek kan worden gekoppeld aan andere bestuiverssystemen om de besmettelijkheid te testen. Voor massale bijenextractie door zelfverwijdering van larven, plaats een honingbijkoningin in een lege, uitgetrokken Langstroth-raam en breng haar terug naar haar kolonie.Nadat de koningin 24 uur lang eieren op het frame heeft laten leggen, controleer het frame om er zeker van te zijn dat de meeste cellen van het raster nieuw gelegde eieren bevatten en laat de koningin vrij. Precies 192 uur nadat de koningin was vastgezet, verwijdert u het frame uit de kolonie en borstelt u event

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We laten zien hoe je een gedrags-farmacologie methode te implementeren in een appetitief olfactorische conditionering paradigma in de honingbijen (Apis mellifera) door systemische toediening van drugs. Deze methode maakt het mogelijk onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan leren en geheugen vorming in een eenvoudige en betrouwbare manier.

Behavioural Farmacologie in klassieke conditionering van de Proboscis Extension Response in Honingbijen ( Apis mellifera)

We beschrijven het proces van het isoleren van hoge zuiverheid herpesvirus nucleocapside DNA van geïnfecteerde cellen. De uiteindelijke DNA veroverd op oplossing is van de hoge concentratie en zuiverheid, waardoor het bij uitstek geschikt voor high-throughput sequencing, high fidelity PCR-reacties, en transfecties om nieuwe virale recombinanten te produceren.

De voorbereiding van Virale DNA van nucleocapsiden

In dit protocol beschrijven we twee strategieën die tegelijkertijd in honingbijen te onderdrukken twee genen (dubbel gen knockdown). Dan presenteren we hoe de proboscis extensie respons (PER) test om het effect van de dubbele gen knockdown op honingbij smaak perceptie bestuderen gebruiken.

RNAi-gemedieerde Dubbele Gene Knockdown en Smaak Perception Meting in Honingbijen (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Hier presenteren we een protocol om Homalodisca vitripennis cellen en HoCV-1 propageren in vitro. Medium werd verwijderd uit HoCV-1 positieve kweken en RNA geëxtraheerd elke 24 uur gedurende 168 uur. Cell overlevingsvermogen werd gekwantificeerd door trypan blauw kleuring. Hele virusdeeltjes werden geëxtraheerd na infectie. Geëxtraheerde RNA werd gekwantificeerd door qRT-PCR.

Voortplanting van<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

Hier beschrijven wij onze gedetailleerde protocol voor de voorbereiding van de single-cohort bijenvolken - een nuttig instrument voor het analyseren van de role-geassocieerde werknemer fysiologie. We beschrijven ook gedetailleerde protocollen voor de behandeling van werknemers met juveniele hormoon en ecdyson de betrokkenheid van deze hormonen in de regulatie van de werknemer gedrag en / of fysiologie te evalueren.

Voorbereiding van de Single-cohort Colonies and Hormoon Behandeling van werkbijen Analyseer Physiology geassocieerd met Rol en / of endocriene systeem

Microbiële consortia binnen bumble bee-hives verrijken en behouden van pollen voor larven van de honingbij. Met behulp van de volgende generatie sequencing, samen met laboratorium en veld gebaseerde experimenten, dit manuscript wordt beschreven protocollen gebruikt om te testen van de hypothese dat fungicide residuen veranderen de stuifmeel microbiome, en de kolonie demografie, uiteindelijk leidde tot de kolonie verlies.

Empirische, Metagenomic en computationele technieken verlichten de mechanismen door welke fungiciden compromis Bee gezondheid

Dit manuscript beschrijft meerdere protocollen voor het toedienen van farmacologische middelen aan de bijen, waaronder eenvoudige niet-invasieve methoden voor vrij vliegende bijen, evenals meer invasieve varianten die precies gelokaliseerde behandeling van ingehouden bijen mogelijk.

Neurofarmacologische Manipulatie van ingetogen en vrij vliegende Honingbijen,<em&gt; Apis mellifera</em

Hier presenteren we een methode om zowel een individuele honingbij als een bijenkolonie voedsel te geven dat besmet is met pesticiden. De procedure evalueert het effect van pesticiden op individuele honingbijen door in vivo voeding van een basislarvenvoeding en ook op de natuurlijke toestand van de bijenkolonie.

Het evalueren van het effect van Environmental Chemicals over Honey Bee ontwikkeling van het individu naar Colony Level

Subletale doses van pesticiden kunnen van invloed zijn op de kolonies op manieren die moeilijk op te sporen met behulp van alleen visuele of periodieke methoden. Methoden voor het meten van de totale volwassen bee massa, brood en voedselbronnen door weging netelroos en korf onderdelen en frames te fotograferen, en installeren sensoren, worden geleverd. Data-analyse wordt ook behandeld.

Toezicht op de gevolgen van de kolonie-niveau van blootstelling van de subletale bestrijdingsmiddelen voor bijen

Dit protocol is ontwikkeld om het begrip te vergroten van hoe agrochemicaliën de reproductie van honingbijen(Apis mellifera)beïnvloeden door methoden vast te stellen om honingbijenkoninginnen en hun werkverzorgers bloot te stellen aan agrochemicaliën in een gecontroleerde, laboratoriumomgeving en zorgvuldig hun relevante reacties te volgen.

Beoordeling van agrochemisch risico voor gepaarde honingbijenkoninginnen

Deze methodologie, die orale voeding en intrathoracale injectie-infectie omvatte, kon de invloed van midgut- en / of speekselklierbarrières op arbovirusinfectie effectief beoordelen.

Experimentele virale infectie bij volwassen muggen door orale voeding en micro-injectie

Leer hoe je virusdeeltjes produceert uit honingbijpoppen voor gecontroleerde bioassays met Apis mellifera. Deze methode vereenvoudigt onderzoek naar virus-gastheerinteracties en bespaart arbeid vergeleken met celkweek.

Bereiding van virusverrijkt entmateriaal voor orale infectie van honingbijen (Apis mellifera)

Meer video's verkennen