Atomic Force Microscopie gecombineerd met infraroodspectroscopie als hulpmiddel om single bacterium chemistry te onderzoeken

De methode maakt nanoscale studies van bacteriën mogelijk. Het biedt ons gedetailleerde inzichten in de chemische veranderingen in antimicrobiële resistentie. Daarom kan het bijdragen aan ons begrip van AMR en de ontwikkeling van medicijnen.

De nanoscale grootte van bacteriën beperkt aanzienlijk de beschikbare onderzoeksinstrumenten die in staat zijn om hun chemie te onderzoeken. AFM-IR stelt ons in staat om dit op een niet-destructieve, observer-onafhankelijke manier te doen, zelfs op subcellulair niveau. Door een inzicht in de antimicrobiële resistentie te bieden, kan de methode helpen om moleculaire doelen voor nieuwe antimicrobiële middelen te identificeren en te testen.

Naast bacteriën kan AFM-IR een reeks cellen, weefsels en zelfs virussen onderzoeken. Om een monster voorbereiden voor AFM-IR beeldvorming, gebruik na het kweken van de belangrijke bacteriën op het juiste medium onder de juiste kweekcondities een steriele lus om voorzichtig bacteriën van de top van de kolonies op te nemen voor overdracht naar een glasbuis. Voeg een milliliter ultrapuur water toe aan de buis en vortex gedurende een tot twee minuten totdat de verzamelde bacteriële pellet niet langer zichtbaar is op de bodem van de buis.

Schat de ruwe turbiditeit van de oplossing door visuele vergelijking tussen de bereide oplossing en McFarland-standaarden. Als de turbiditeit van de bacteriesuspensie erg laag lijkt, blijf dan meer bacteriën toevoegen en vortex totdat de ruwe turbiditeit van de oplossing vergelijkbaar is met de 0,5 en 1 McFarland-standaarden. Bezin de bacteriën door centrifugatie en zuig voorzichtig het supernatant op met een pipet.

Resuspendeer de bacteriële celpellet in een milliliter ultrapuur water met vortexen, en sedimenteer de bacteriën met nog een centrifugatie. Na het wassen van de bacteriën tot wel drie keer zoals zojuist is aangetoond, zuig het supernatant op en vortex de pellet gedurende ten minste twee minuten voordat u vijf microliter cellen op het experimentele substraat aanbrengt. Als de gewenste dikte een monolaag of individuele bacteriën is, voegt u onmiddellijk na het aanbrengen tussen 20 en 100 microliter ultrapuur water toe aan het substraat en meng de oplossing voorzichtig met een pipettentip.

Wanneer het monster is gedroogd, gebruik dubbelzijdig plakband om het substraat op een AFM-metaalmonsterschijf te monteren. Om het AFM-IR-spectroscopie-instrument voor een analyse voor te bereiden, drukt u op Initialize nadat u de software en laser hebt ingeschakeld en bevestigt dat de lasersluiter in de open positie staat. Tijdens dit proces verschijnt het venster Stage Initialization.

Wanneer het initialisatieproces is voltooid, klikt u op Initialize en OK. Schakel indien mogelijk de stikstofstroom in om het instrument te spoelen met stikstof en pas de stikstofspoeling aan om een stabiele vochtigheidsgraad te bereiken. Plaats het monster voorzichtig in de monsterkamer zonder de tip te beschadigen en klik op Load in de software. Volg de wizard om het monster te laden, waarbij u zich in elke stap op de tip en het monster richt.

Klik vervolgens op Approach om het monster te benaderen zonder het te engageren. Selecteer voordat u het monster engageert Tools, IR Background Calibration en New. Stel in het pop-upvenster de resolutie en spectraalbereik in volgens het doel van de analyse en stel de co-averages en de achtergronden in op gemiddelde waarden.

Selecteer Enable. In het pop-upvenster stelt u de start- en eindparameters in en klikt u op Accept and Acquire. Wanneer de achtergrondgegevens zijn verkregen, klikt u op Save.

Om de tip te engageren met het monster, klikt u op Engage. Het systeem nadert het monsteroppervlak tot direct contact wordt gedetecteerd. Klik op Scan om een ​​initiële grotere gebied, lage ruimtelijke resolutie AFM-afbeelding te verzamelen om het oppervlak te visualiseren voordat u de tip verplaatst naar een meetpunt van belang.

Om de infraroodlaser uit te lijnen op een golfnummer waarop het monster zal absorberen, voert u het golfnummer in waarop het monster zal absorberen in het veld Wave Number in en klikt u op Start IR. Er moet ten minste één duidelijke piek worden waargenomen in de Amplitude Versus Frequency-grafiek. De Deflection Versus Time-grafiek moet een periodische golfvorm tonen. Klik op Optimize om een conventioneel infraroodbacteriespectrum te selecteren om de posities van de banden te identificeren en gebruik het spectrum om de hotspots bij verschillende golfnummerwaarden van verschillende spectrale gebieden te optimaliseren.

Wanneer de infraroodspots voor geselecteerde golfnummerwaarden zijn geoptimaliseerd, definieert u de spectrale resolutie en het bereik en het aantal co-averages en klikt u op Acquire om het AFM-IR-spectrum te verzamelen. Om een intensiteitsverdelingsbeeld voor een geselecteerd golfnummer te verzamelen, neemt u na het opnemen van een enkele AFM-IR-spectrum een AFM-afbeelding van het geselecteerde monstergebied op en selecteert u de golfnummerwaarden voor AFM-IR-beeldvorming. Bevestig dat de IR-spot van de laser is geoptimaliseerd voor de geselecteerde golfnummerwaarden en stel het aantal datapunten in de X- en Y-richtingen van het beeldgebied in.

Stel in het algemene venster de laserkracht in. Definieer in het AFM Scan-venster de scannelheid. Vink vervolgens het vakje IR Imaging Enable aan en klik op Scan om met beeldvorming te beginnen.

De AFM-IR van de intensiteit van het signaal bij het geselecteerde golfnummer wordt gelijktijdig met de AFM-gegevens van dat gebied verzameld. Dit protocol maakt de verwerving mogelijk van een reeks typen bacteriecelverdelingen op een substraat, van enkele cellen tot monolagen en multilagen. Het protocol kan worden gebruikt om dynamische veranderingen in levende bacteriën te volgen.

Bijvoorbeeld, in de vorming van een septum tijdens S.aureus celdeling. Het AFM-IR-spectrum van het septum werd gekenmerkt door een hogere relatieve intensiteit van banden bij 1.240 en 1.090 centimeter in vergelijking met AFM-IR-spectra die werden verzameld uit het celgebied, wat suggereert dat het septum is opgebouwd uit koolhydraat- en fosfodiëstergroepen van celwandcomponenten. Het protocol kan ook worden gebruikt om verschillen in de chemische samenstelling te bestuderen die ontstaan door de ontwikkeling van resistentie.

Zoals waargenomen in de