MS2-Affinity Zuivering in combinatie met RNA Sequencing in Gram-Positieve Bacteriën
23 februari 2021
MAPS-technologie is ontwikkeld om het targetoom van een specifiek regulerend RNA in vivo te onderzoeken. De sRNA van belang is gelabeld met een MS2 aptamer die de co-zuivering van zijn RNA-partners en hun identificatie door RNA-sequencing mogelijk maakt. Dit gewijzigde protocol is bijzonder geschikt voor Gram-positieve bacteriën.
MS2-affiniteitszuivering in combinatie met RNA-sequencing of MAPS is ontwikkeld om het hele doel van elk RNA dat van belang is voor bacteriën te identificeren. Deze technologie maakt het mogelijk om elke vorm van sRNA-partners onafhankelijk van het reguleringsmechanisme te identificeren. De karakterisering van sRNA-afhankelijke regulerende netwerken zal helpen om betere virulentiefactoren productie, biofilmvorming en overleving van de bacteriën in de gastheercellen te begrijpen en uiteindelijk te vechten tegen stafylokokkeninfecties.
Dit protocol kan worden toegepast op pathogene of niet-pathogene grampositieve bacteriën. Noemie Mercier, een promovendus uit het laboratorium van Dr.Pascal Romby, demonstreert de procedure. Om te beginnen, kweek een kolonie stammen met pCN51 P3 MS2 sRNA of pCN51 P3 MS2 plasmiden in drie milliliter BHI medium aangevuld met 10 microgram per microliter erytromycine in duplicaten.
Verdun elke nachtcultuur in 50 milliliter vers BHI-medium aangevuld met erytromycine om een OD 600 van 0,05 te bereiken. Kweek de culturen op 37 graden Celsius met schudden bij 180 RPM gedurende zes uur. Breng elke kweek over in een centrifugebuis van 50 milliliter en centrifugeer de buizen op 2,900 maal G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, gooi het supernatant weg, vries ze in en bewaar ze op min 80 graden Celsius of houd de pellets op ijs en voer direct mechanische cellyse uit.
Om mechanische cellyse uit te voeren, resuspend pellets in vijf milliliter buffer A en breng de geresuspendeerde cellen over naar 15 milliliter centrifugebuizen met 3,5 gram silicaparels. Plaats de buizen in een mechanisch cellyse-instrument en voer een cyclus van 40 seconden uit met vier meter per seconde. Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten op 2,900 maal G, herstel vervolgens het supernatant en houd het op ijs.
Zorg ervoor dat het supernatant helder is en herhaal de centrifugeer als dit niet het is. Verwijder de kolomtip, plaats vervolgens een chromatografiekolom in een kolomrek en was de kolom met ultrapure water. Voeg 300 microliter amylosehars toe en was de kolom met 10 milliliter buffer A.Verdun 1, 200 picamoles MBP-MS2-eiwit in zes milliliter buffer A en laad het in de kolom.
Was de kolom met 10 milliliter buffer A.Voer vervolgens ms2-affiniteitszuivering uit. Laad het cellysaat in de kolom en verzamel de doorstroomfractie in een schone opvangbuis. Was de kolom drie keer met 10 milliliter buffer A en verzamel de wasfractie, eluteer vervolgens de kolom met één milliliter buffer E en verzamel de elutiefractie in een microbuis van twee milliliter.
Bewaar alle verzamelde fracties op ijs tot RNA-extractie. Gebruik één milliliter van elke fractie voor RNA-extractie. Voeg een volume fenol toe aan het RNA en meng krachtig en centrifugeer het mengsel vervolgens op 16.000 keer G gedurende 10 minuten bij 20 graden Celsius.
Breng de bovenste fase over op een schone microbuis van twee milliliter. Voeg een volume chloroform isoamylalcohol toe en herhaal de centrifugering en breng vervolgens de bovenste fase over naar een nieuwe buis. Voeg 2,5 volumes 100% koude ethanol en 0,1 volume van drie molair natriumacetaat bij pH 5,2 toe en stort 's nachts neer bij min 20 graden Celsius.
Centrifugeer de volgende dag de buizen gedurende 15 minuten bij 16.000 keer G en vier graden Celsius. Verwijder de ethanol langzaam met een pipet en zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Voeg 500 microliters 80% koude ethanol toe en centrifugeer gedurende vijf minuten.
Gooi de ethanol weg door deze langzaam te pipetten en droog de pellet vervolgens gedurende vijf minuten met een vacuümconcentrator in de werkingsmodus. Resuspend de pellet in een geschikte hoeveelheid ultrapure water. Dit protocol werd gebruikt om het RsaC-doeloom in S.aureus te bestuderen.
Verschillende mRNAs die rechtstreeks met RsaC interageren, werden geïdentificeerd met behulp van MAPS-technologie, wat zijn cruciale rol in oxidatieve stress en metaalgerelateerde reacties onthulde. Om de MS2 sRNA-constructies te bevestigen en hun expressiepatroon te visualiseren, werden cellen geoogst na twee, vier en zes uur groei in BHI-medium. RNA werd geëxtraheerd en noordelijke vlekanalyse werd uitgevoerd met behulp van de RsaC-specifieke DIG-sonde.
Het niveau van endogene RsaC nam aanzienlijk toe na zes uur groei. Belangrijk is dat het niveau van MS2-RsaC 544 en MS2-RsaC 1, 116 na zes uur vergelijkbaar was met endogene RsaC. Affiniteitszuivering werd uitgevoerd en RNA's werden geëxtraheerd uit het ruwe extract, de doorstroomfracties en de elutiefracties in de wild-type stam die alleen de MS2-tag uitdrukte en de mutante RsaC-stam die de MS2-RsaC 544-constructie uitdrukte.
De 1,116 nucleotide lange endogene RsaC werd verrijkt in de elutiefractie, maar interageerde niet specifiek met de affiniteitskolom vanwege de lengte en complexe secundaire structuur. De MS2-RsaC 544 werd sterk verrijkt in de elutiefractie, wat aantoont dat het met succes werd behouden door het MS2-MBP fusie-eiwit. Een bioinformatische analyse onthulde putatieve mRNA-doelen volgens de vouwverandering tussen MS2 sRNA en MS2-controle, wat aangeeft dat sodA het eerste putatieve doelwit was.
Een noordelijke vlekanalyse die sodA-specifieke DIG-sonde na ms2-affiniteitszuivering wordt uitgevoerd toont aan dat sodA efficiënt met MS2-RsaC 544 in vergelijking met de controle MS2 werd verrijkt. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat de toevoeging van de MS2-tag van invloed kan zijn op de bevestiging, stabiliteit of functie van sRNA. Dit moet zorgvuldig worden gecontroleerd.
MAPS biedt een momentopname van het koppelen van sRNA-RNA-doelen. Verdere experimentele validatie zal hun functie ontrafelen. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel om sRNA-regulerende netwerken in bacteriën op te bouwen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
MAPS-technologie maakt de identificatie van het targetoom van specifieke regulatoire RNA's in vivo mogelijk, met name in Gram-positieve bacteriën. Deze methode maakt gebruik van MS2-affiniteitszuivering en RNA-sequencing om RNA-partners gezamenlijk te zuiveren en te identificeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Microbiologie
- RNA-biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van sRNA-afhankelijke regulatienetwerken is essentieel voor het bestuderen van bacterieel gedrag.
- Het identificeren van RNA-partners kan inzicht verschaffen in virulentiefactoren en biofilmvorming.
- MAPS-technologie maakt de onafhankelijke identificatie van sRNA-partners mogelijk.
- Dit protocol is toepasbaar op zowel pathogene als niet-pathogene Gram-positieve bacteriën.
Doel van de studie
- Om sRNA-afhankelijke regulerende netwerken in bacteriën te karakteriseren.
- Om het begrip van bacteriële overlevingsmechanismen binnen gastheercellen te vergroten.
- Om strategieën tegen staphylococceninfecties te ontwikkelen.
Gebruikte methoden
- MS2-affiniteitszuivering gekoppeld aan RNA-sequencing.
- Groei van bacteriële stammen in BHI-medium met erythromycine.
- Co-purificatie van sRNA en de bijbehorende partners voor analyse.
- Identificatie van RNA-partners via sequencingtechnieken.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle identificatie van sRNA-partners in Gram-positieve bacteriën.
- Inzichten in regulatoire netwerken die de virulentie en overleving beïnvloeden.
- Demonstratie van het protocol door een PhD-student uit het laboratorium van Dr. Pascal Romby.
- Potentiële toepassingen bij de bestrijding van bacteriële infecties.
Conclusies
- MAPS-technologie is een krachtig instrument voor het bestuderen van RNA-interacties.
- Inzicht in sRNA-netwerken kan leiden tot betere therapeutische strategieën.
- Deze methode kan worden aangepast voor diverse bacteriële soorten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
MAPS-technologie maakt uitgebreide targetome-mapping van kleine regulerende RNA's in Gram-positieve pathogenen mogelijk, wat targetvalidatie bij de ontdekking van antimicrobiële middelen ondersteunt. Door sRNA-mRNA-interacties te onthullen die de virulentie en overleving beïnvloeden, biedt het mechanistische risicoreductie voor antibacteriële programma's in een vroeg stadium. Deze benadering vergroot het voorspellende vertrouwen bij het prioriteren van sRNA-targets voor therapeutische interventie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om sRNA-afhankelijke regulatoire netwerken te onderzoeken om therapeutische hypothesen bij Gram-positieve bacteriën te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een momentopname van sRNA-targetomen ter ondersteuning van biologische risicoreductie en functionele targetvalidatie.
- Wetenschappelijke waarde: Identificeert vermeende mRNA-targets zoals sodA, waardoor sRNA-activiteit wordt gekoppeld aan oxidatieve stress en metaalresponspaden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve RNA-sequencingresultaten uit co-gezuiverde fracties om reproduceerbare doelwitidentificatie mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Standaardiseert capture via MS2-MBP-fusie op amylosehars, wat de schaalbaarheid van de assay over Gram-positieve stammen ondersteunt.
- Wetenschappelijke waarde: Levert verrijkingsmetrieken (bijv. elutiefractie) om specifieke van niet-specifieke RNA-interacties te onderscheiden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt sRNA-regulonen met fenotypische outputs, zoals de productie van virulentiefactoren en biofilmvorming in Staphylococcus aureus.
- Operationele waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door sRNA-activiteit te koppelen aan stressresponspaden die relevant zijn voor infecties.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door sRNA-targets te valideren via orthogonale methoden zoals Northern blot.
Integratie van Pipeline & Workflow
MAPS past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-identificatie tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor antibacteriële programma's die zich richten op RNA-gebaseerde regulatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van sRNA-functies door RNA-interactomen in vivo in kaart te brengen onder gedefinieerde groeicondities.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde lysis-, affiniteitsopvang- en RNA-extractieworkflows die compatibel zijn met sequencing.
- Analytiek: Levert fold-change-metingen tussen MS2-sRNA- en controlefracties om targets met een hoge betrouwbaarheid te prioriteren voor vervolgonderzoek.
- Translationeel onderzoek: Verbindt sRNA-targetomen met overlevingsmechanismen van de gastheer, wat bijdraagt aan de preklinische validatie van anti-infectieve strategieën.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor sRNA-targetoomprofilering over pathogene en niet-pathogene Gram-positieve soorten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen bij de identificatie van sRNA-doelen, vermindering van mechanistische ambiguïteit bij post-transcriptionele regulatie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van het vastleggen van RNA-eiwitinteracties in bacteriële lysaten.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen bij de selectie van antimicrobiële doelen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van sRNA-doelen op basis van verrijkingsgegevens en fenotypische correlatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering, bacteriële kweek en RNA-handling.
- Vereist infrastructuur voor mechanische lysis, chromatografiesystemen en mogelijkheden voor RNA-sequencing.
- Vraagt om cross-team standaardisatie voor het ontwerp van constructen (bijv. MS2-sRNA fusies) en expressievalidatie.
- Vereist overwegingen voor aanpassing van de sRNA-stabiliteit en secundaire structuur bij toepassing op diverse Gram-positieve modellen.
- Praktische beperking: Veronderstelde targets vereisen orthogonale validatie (bijv. Northern blot) om de specificiteit te bevestigen vanwege mogelijke aspecifieke interacties.
