Isolatie, proliferatie en differentiatie van rhesus makaken vet-afgeleide stamcellen

Vetweefsel-afgeleide stamcelisolatie en proliferatie produceert een groot aantal stamcellen die kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen en experimentele technieken. Een belangrijk bedoeld gebruik voor gedifferentieerde adipocyten in dit protocol zijn metabole testen zoals insuline gestimuleerde glucose opname, lipogenese en gestimuleerde lipolyse. Creëer om te beginnen een steriele werkomgeving door de bioveiligheidskap en alle gereedschappen te desinfecteren.

Pipetteer ongeveer 10 milliliter van vijf PBS-buffer in vier celkweekschalen van 100 millimeter. Breng een vetmonster van 50 gram over in een van de gerechten en was het vier keer door het achtereenvolgens over de andere gerechten met vijf PBS over te brengen. Breng vervolgens het gewassen vetweefsel over in een schone kweekschaal van 100 millimeter en hak het grondig fijn met een schaar of steriele tang.

Breng een gedeelte van één tot drie centimeter van het gehakte weefsel over naar een conische buis van 50 milliliter met 13 milliliter collagenasebuffer. Spoel het resterende weefsel uit de kweekschaal met twee milliliter collagenasebuffer om een totaal volume van 15 milliliter te garanderen. Meng het monster grondig met een serologische pipet van 25 milliliter en incubeer de buis bij 37 graden Celsius op een rocker gedurende 30 tot 60 minuten.

Om de enzymactiviteit te neutraliseren, voegt u na incubatie 10 milliliter ADSC-groeimedium toe aan de buis en mengt u deze goed met een pipet om eventuele weefselaggregaten te scheiden. Breng het vloeibare gedeelte over in een nieuwe steriele conische buis van 50 milliliter, waardoor het vaste weefsel achterblijft. Was het weefsel drie keer met zeven milliliter van twee PBS en breng de vloeistof over naar de nieuwe buis.

Centrifugeer vervolgens de buis gedurende vijf minuten op 500 maal G en verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatant zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in één milliliter van 1X rode bloedcel of RBC lysis buffer en incubeer het bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Was vervolgens de cellen twee keer door vijf milliliter ADSC-groeimedium aan de buis toe te voegen en te centrifugeren om het supernatant te verwijderen.

Na de laatste wasbeurt resuspenseert u de pellet in twee milliliter ADSC-groeimedium en filtert u deze door een celzeef van 70 micron in een steriele conische buis van 50 milliliter. Spoel de zeef af met nog eens twee milliliter van het medium en breng vier milliliter van de suspensie over in een steriele kweekschaal van 100 milliliter. Spoel de conische buis twee keer af met drie milliliter medium om een totaal volume van 10 milliliter in de kweekschaal te verzamelen.

Observeer de verzamelde cellen onder een omgekeerde microscoop bij 10X vergroting om te controleren op zwevende cellen. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in een kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 100% relatieve vochtigheid. Om de steriliteit van de kweekmedia te garanderen, voegt u alleen een plaat met media toe.

Bekijk na 24 uur de cellen onder de omgekeerde microscoop om te controleren op celtrouw. Verwijder en vervang het medium elke 48 uur door een warm medium totdat de cellen 80 tot 90% samenvloeiend zijn. Verwijder voor proliferatie het groeimedium uit de confluente ADSC-cellen en was ze tweemaal met twee milliliter steriele PBS op kamertemperatuur.

Adem de PBS aan en voeg twee milliliter van 0,25% trypsine EDTA toe aan elke kweekplaat, die het hele oppervlak van de plaat bedekt. Incubeer de plaat gedurende zeven minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide en maak vervolgens de trypsinized cellen mechanisch los door krachtig pipetteren. Voeg twee milliliter ADSC-groeimedium toe en meng de cellen voorzichtig.

Breng de cellen over in een conische buis van 50 milliliter en spoel de schaal met nog eens twee milliliter medium om maximale celrecuperatie van de plaat te garanderen. Centrifugeer vervolgens de buis op 500 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en decanteer het supernatant om de celpellet te verkrijgen. Resuspendeer de celpellet in vijf tot zes milliliter ADSC-groeimedium per miljoen cellen.

Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en plaat ze zoals beschreven in het tekstmanuscript. Zodra de cellen 80 tot 90% confluency bereiken, aspirateer het groeimedium en spoel de cellen met steriele PBS op kamertemperatuur en voeg vervolgens 10 milliliter ADSC-differentiatiemedium toe. Vervang het medium om de drie dagen gedurende ongeveer 14 tot 21 dagen.

Observeer de cellen op de aanwezigheid van lipidedruppels onder de omgekeerde microscoop bij 40X vergroting. Rijpe adipocyten worden over het algemeen na 14 dagen waargenomen. Op de dag van de beplating waren de ADSC's niet-aanhangers en zweefden ze in cultuur.

De cellen werden na 72 uur 80% confluent en waren klaar voor adipocytendifferentiatie. Na 14 dagen ADSC-differentiatie vertoonden volwassen adipocyten sterke adipogene kenmerken die werden waargenomen onder 40X-vergroting. Op dag 14 werden cellen gekleurd en gefixeerd met Oil Red O en BODIPY voor lipidedruppelvisualisatie.

Gedifferentieerde adipocyten konden worden waargenomen onder 20X vergroting. Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om te onthouden dat een steriele werkomgeving van cruciaal belang is voor een gezonde isolatie, adequate uitbreiding en efficiënte differentiatie van van vetweefsel afgeleide stamcellen. Na deze procedure kunnen deze cellen worden gebruikt voor verschillende metabole testen, zoals glucoseopname, lipogenese en lipolyse, wat een belangrijk aandachtspunt van ons onderzoek is.

Deze techniek maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe chronische alcohol en SIV de metabole capaciteit van adipocyten beïnvloeden.