Cryogene monster laden in een magische hoek spinnen nucleaire magnetische resonantie spectrometer die cellulaire levensvatbaarheid behoudt
September 1st, 2020
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor cryogene overdracht van bevroren monsters in de dynamische nucleaire polarisatie (DNP) magic angle spinning (MAS) nucleaire magnetische resonantie (NMR) sonde. Het protocol bevat aanwijzingen voor rotoropslag voorafgaand aan het experiment en aanwijzingen voor levensvatbaarheidsmetingen voor en na het experiment.
De gevoeligheid van DNP-ondersteunde MAS NMR-spectroscopie stelt ons in staat om eiwitten binnen intacte cellen te karakteriseren bij hun endogene concentratie. Deze toepassing vereist zorgvuldige behandeling van het monster. Sommige morfologieën blijven behouden en cellen zijn levensvatbaar wanneer ze cryogenetisch worden overgebracht naar de spectrometer volgens dit protocol.
Het introduceren van de koude rotor kan vocht en ijsophoping veroorzaken, wat mechanisch kan voorkomen dat het monster gaat draaien. Deze demonstratie zal experimenten begeleiden om de cryogene overdracht met vertrouwen uit te voeren. Plaats om te beginnen een kussen gemaakt van een stuk weefsel of papieren handdoek onder het deksel en op de bodem van de cryogeen flesje.
Plaats de 3,2 millimeter saffier rotor in de cryogeen fles met het weefselpapier als buffer, met de gemarkeerde kant naar de bodem van het flesje. Bevries de rotor langzaam door het flesje in een container met gecontroleerde afkoelingssnelheid te plaatsen en de container in een 80 graden Celsius vriezer te plaatsen gedurende minimaal drie uur. Breng het cryogeen flesje met de bevroren rotor over naar een kleine vacuümkolf gevuld met vloeibare stikstof.
Gebruik de vacuümkolf om het monster naar de spectrometerfaciliteit te brengen. Vul een droge, thermisch geïsoleerde, breed mondschuimvacuümkolf met 500 milliliter tot één liter vloeibare stikstof. Neem het cryogeen flesje uit de overdrachtskolven en houd het net boven het oppervlak van de vloeibare stikstof om het te beschermen tegen de atmosfeer.
Terwijl je het cryogeen flesje vasthoudt met de mond van het flesje lichtjes naar beneden gericht, draai de dop los en laat de rotor in het bad met vloeibare stikstof glijden. Koel een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje voor door het onder te dompelen in de vloeibare stikstof. Onder het oppervlak van het bad met vloeibare stikstof, gebruik pincetten om de rotor over te brengen naar het microcentrifugebuisje met de aandrijvingstip naar de bodem van het buisje gericht en de markeringen naar de opening gericht.
Gebruik pincetten om het buisje met de rotor onder vloeibare stikstof vast te houden aan de hals. Houd met een tweede paar pincetten de NMR-monstervanger boven het oppervlak van de vloeibare stikstof in een scherpe hoek ten opzichte van het microcentrifugebuisje. Om de rotor van de NMR-monstervanger over te brengen naar de NMR-spectrometer, plaatst u de cryo-kast in de uitwerpmodus door op uitwerpen te drukken.
Breng het opene uiteinde van de NMR-monstervanger in het microcentrifugebuisje terwijl u zich nog onder het oppervlak van de vloeibare stikstof bevindt. Til zowel het microcentrifugebuisje als de NMR-monstervanger op om de rotor in de monstervanger te laten vallen. Schud de monstervanger en het buisje als de rotor vast komt te zitten op de rand.
Laat het lege microcentrifugebuisje op de NMR-monstervanger liggen om de rotor tegen lucht te beschermen. Verwijder de andere lege monstervanger uit de sonde en leg hem op de vloer. Breng de NMR-monstervanger met de rotor over naar de andere hand.
Verwijder vervolgens het microcentrifugebuisje en breng het onmiddellijk in de sonde. Geef de persoon die de cryo-kast bedient het sein om stop uitwerpen en invoegen in te drukken. Draai het monster naar de gewenste draaisnelheid door de lager en aandrijfgasdruk aan te passen.
Giet 500 milliliter tot één liter vloeibare stikstof in een schuimvacuümkolf met brede mond en plaats het bad onder de spectrometer. Dompel het lege cryogeen flesje met een stukje weefselpapier onder in het bad met vloeibare stikstof. Verlaag de draaisnelheid tot nul kilohertz door de aandrijving en lagergasstroom geleidelijk te verminderen en werpt de rotor uit door over te schakelen naar de uitwerpmodus.
Terwijl u de uitwerpmodus aanhoudt, verwijdert u de monstervanger uit de sonde en laat u de rotor direct in de schuimkolf met brede mond vallen die vloeibare stikstof bevat. Gebruik voorgekoelde pincetten om de rotor onder het oppervlak van de vloeibare stikstof over te brengen naar het voorgekoelde cryogeen flesje. Koel het deksel van het cryogeen flesje voor door het in vloeibare stikstof te dompelen.
Verwijder het flesje met de rotor en vloeibare stikstof uit het bad en sluit het buisje af met het voorgekoelde deksel. Dompel het cryogeen flesje opnieuw onder in vloeibare stikstof. Het monster kan worden overgebracht naar een langere termijn vloeibare stikstofopslag of onmiddellijk worden uitgepakt voor verdere analyse.
Cryogene inbrenging van voorbevroren monsters van zoogdiercellen in de NMR-spectrometer ondersteunt de levensvatbaarheid gedurende het NMR-experiment. Met behulp van dit protocol is de trypanblauwdoorlaatbaarheid van zoogdiercellen na MAS NMR vergelijkbaar met die van cellen die niet zijn blootgesteld aan temperatuurveranderingen. Als cellen langzaam worden bevroren, dan worden ze op kamertemperatuur gebracht voordat ze worden ingebracht, neemt de cellulaire levensvatbaarheid af tot minder dan 10%. Ondertussen ondersteunt cryogene inbrenging van bevroren monsters van zoogdiercellen de cellevensvatbaarheid gedurende het NMR-experiment.
Wanneer u dit protocol probeert, vraag dan om hulp bij het uitwerpen en opstarten van het monster, zodat het monster in de sonde kan worden gebracht voordat het opwarmt, en zorg ervoor dat er geen vocht in de sonde komt, en ervoor zorgen dat de spectrometer koud blijft lopen gedurende vele weken. Dit protocol is van toepassing op elk systeem waarbij temperatuurschommelingen de integriteit van het monster kunnen aantasten, zoals bijvoorbeeld reacties met snel bevriezen of karakterisering van vastgelopen reactie-intermediaten enzymologie, en eiwitvouwing.
Overzicht
Dit protocol beschrijft de cryogene overdracht van bevroren monsters naar een magische hoek draaiende (MAS) nucleaire magnetische resonantie (NMR) sonde, met de nadruk op het behoud van de integriteit en levensvatbaarheid van het monster. Het richt zich op de uitdaging van vochtophoping bij het introduceren van de rotor in de spectrometer, waarbij wordt gezorgd dat cellen hun functionele kenmerken tijdens het hele experiment behouden.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Dynamische nucleaire polarisatie (DNP) NMR-spectroscopie
- Monsterbehandeling in biologisch onderzoek
- Cellevensvatbaarheid tijdens experimentele procedures
Achtergrond
- Belang van DNP voor het bestuderen van eiwitten in intacte cellen
- Uitdagingen van vochtophoping en ijsvorming tijdens cryogene overdracht
- Belang van het behoud van cellulaire levensvatbaarheid tijdens het protocol
Gebruikte methoden
- Cryogene overdracht van bevroren monsters met behulp van een thermisch geïsoleerd systeem
- Zoogdiercellen als het biologische systeem
- Nucleaire magnetische resonantie (NMR) technologie
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle behoud van cellevensvatbaarheid tijdens het NMR-experiment
- Trypanblauw permeabiliteit geeft vergelijkbare levensvatbaarheid aan in gekoelde versus niet-gekoelde cellen
- Het protocol valideert de effectiviteit van cryogene methoden voor monsterbehandeling
Conclusies
- De studie toont effectieve cryogene methoden voor monsterinsertie in NMR-sondes
- Dit protocol verbetert de betrouwbaarheid van biologische experimenten met temperatuurgevoelige monsters
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Cryogenic sample handling enables preservation of cellular integrity for dynamic nuclear polarization NMR studies of intracellular proteins at endogenous concentrations. This approach supports target validation in native cellular environments by maintaining viability through low-temperature transfer. The protocol addresses a key bottleneck in applying high-sensitivity NMR to drug discovery workflows requiring mechanistic de-risking of therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by characterizing proteins inside intact cells at physiological concentrations.
- Operational Value: Preserves cellular viability during NMR experiments, reducing false negatives from sample degradation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through structural data obtained under near-native conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, atom-level readouts of protein-ligand interactions in cryopreserved cellular systems.
- Operational Value: Standardizes sample introduction to minimize variability from ice accumulation or moisture interference.
- Assay Readiness: Enables reproducible preparation of frozen rotor samples for high-sensitivity DNP-MAS NMR screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage structural biology with preclinical validation by maintaining sample integrity across workflows.
- Disease-Relevant System: Applicable to mammalian cell models used in target validation and pathway elucidation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on structural data from viable, endogenous-state samples.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling structural characterization after target identification and before lead optimization, particularly for intracellular targets requiring native-cell context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing atomic-resolution data on proteins in viable cells.
- Screening: Ensures assay reproducibility through controlled cryogenic transfer that prevents moisture-related spinning failures.
- Analytics: Generates quantitative structural and dynamic measurements that inform target confidence and ligand-binding assessments.
- Translational Research: Maintains continuity from cellular target validation to preclinical models by preserving sample integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for cryogenic handling of temperature-sensitive biological samples across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation via structural data from intact, viable cells.
- Operational Value: Standardization and reproducibility in sample transfer, reducing experimental failure from moisture or ice buildup.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through reliable mechanistic data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural feasibility in native cellular environments.
Implementation Considerations
- Expertise in cryogenic sample handling and NMR probe operation.
- Access to controlled-rate cooling equipment, liquid nitrogen dewars, and thermally insulated transfer flasks.
- Standardization of transfer procedures across teams to ensure consistent sample integrity.
- Adaptation considerations for different rotor types or cell lines while maintaining low-temperature chain.
- Practical limitation: Requires rapid execution to prevent warming during transfer, necessitating trained personnel coordination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Cryopreservation of Mammalian Cells in an NMR Rotor
1:25
Cryogenic Transfer of a Frozen Sample into the NMR Spectrometer
3:48
Cryogenic Removal of the Sample from the NMR Spectrometer
5:02
Results: Cryogenic Insertion of a Pre-frozen Sample of Mammalian Cells Results in Cellular Intactness Similar to Never-frozen Mammalian Cell Samples
5:47
Conclusion
