Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Micromilieu maakt een zeer complexe en dynamische omgeving mogelijk, inclusief steeds veranderende cytokinen, ligandenconcentratie en samenstelling. Het creëren van een vergelijkbare kweekomgeving is cruciaal voor in vitro studies naar complexe levensmachines zoals stamceldifferentiatie, immuunresponsen en de ontwikkeling van organen op chipplatforms. Maar het genereren en leveren van chemische signalen van nanolitervolume en millisecondennauwkeurigheid is moeilijk met conventionele biomedische benaderingen zoals pipetten.

Om de uitdagingen het hoofd te bieden, is er veel vraag naar een cultuurplatform dat in staat is om dynamische combinatorische en sequentiële signaalingangen af te wisselen. In dit protocol worden de ontwerp- en fabricageprocedure van een microfluïdisch apparaat gepresenteerd. De voorgestelde microfluïdische chip bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en on-site mengmodulus.

We tonen aan dat platform geschikt is voor studies naar tweedimensionale celpopulaties met één cel en driedimensionale neurale bollen. De complexe en dynamische omgevingsomstandigheden op chip hebben grote effecten op neurale stamceldifferentiatie en zelfvernieuwing. De details van ontwerp- en fabricageprocedures zijn als volgt.

Chipontwerp werd uitgevoerd met behulp van AutoCAD-software. Om de grootte van de plaathouder op de microscoop te passen, is de microfluïdische chip ongeveer zeven bij vijf centimeter groot en bestaat uit 1.500 kweekkamers. Een van de belangrijke kenmerken is dat het een peristaltische pomp heeft die bestaat uit acht stroomkanalen en 200 micrometer brede besturingskanalen.

De toename van het overlappende gebied tussen controle en het stroomkanaal neemt 16 keer toe in vergelijking met de peristaltische pomp, voorgesteld door Stephen Quake in 2002, tot ongeveer 15 nanoliter vloeistof en per pompcyclus en volstaat de behoefte om 1.500 onafhankelijke omgevingsomstandigheden parallel op chip te handhaven. Een ander belangrijk onderdeel van het apparaat is een tweelaagse kweekkamer, die een afschuifvrije cultuuromgeving kan behouden. De ongewenste schuifspanning wordt voorkomen door deze snel door de bovenste laag te leiden.

De cellen, weefsels en cruciaal conditioneel medium blijven onaangeroerd op de onderste laag. Numerieke simulatie suggereert dat wanneer de vloeistoffen door kweekkamers worden geleid, van links naar rechts. de afschuifkrachten kunnen effectief worden voorkomen.

Zelfs bij een ingangsdebiet van 10 millimeter per seconde blijft weefsel ter grootte van een micrometer ongestoord aan de onderkant van de kweekeenheid. We fabriceerden de replicalijst of siliciumwafel met behulp van UV-lithografie. De vloeiende kanalen van 25 micrometer hoog en 100 micrometer in gewicht worden geproduceerd met behulp van SU-8 3025 negatieve fotoresist.

De kweekkamers van 75 micrometer en 150 micrometer hoog werden vervaardigd met behulp van SU-8 3075 fotoresist. AZ50X positieve fotoresist wordt gebruikt voor de ronde putfuncties die overlappen met de besturingskanalen om een goede verbinding te garanderen. Om de microfludische chip te produceren, werden de patroon- en blanco siliciumwafels eerst behandeld met TMCS.

Verschillende hoeveelheden PDMS 10 tot 1 van monomeer-katalysatorverhouding werden grondig gemengd en gedurende één tot twee uur in de vacuümkamer ontbobbeld bij min 0,85 megapascal. De controlelaag werd verkregen door spincoating PDMS bij 2,200 RPM. De siliciumwafels werden vervolgens overgebracht naar de incubator en gedurende 60 minuten geïncubeerd bij 80 graden Celsius.

Verschillende lagen werden uitgelijnd en aan elkaar gebonden met behulp van een aangepast optisch apparaat en een plasma-etsmachine. De inlaatgaten werden vervolgens geslagen na nog eens twee uur thermische binding bij 80 graden Celsius. De chip werd verlijmd aan een PDMS-gecoate afdekplaat, die even groot is als 96-putplaat en voor gebruik minstens 12 uur werd uitgehard bij 80 graden Celsius.

Voor de bediening werden regelkanalen via kunststof buizen verbonden met miniatuur pneumatische magneetventielen. Het draaien van alle penumatic putten werden gecontroleerd door een aangepast MATLAB-programma via de grafische gebruikersinterface. Optimale sluitdrukken van push-up PDMS membraankleppen werden individueel bepaald voor elke chip, die meestal varieert van 25 tot 30 PSI.

Door alle series putten dynamisch te draaien kunnen combinatorische en sequentiële ingangen op chip worden gegenereerd. Cellen werden geoogst bij 80% samenvloeiing en geresuspendeerd met kweekmedium DMEM met een dichtheid van ongeveer 10 tot het vermogen zes per milliliter, die vervolgens in de chip werden geladen door de cel met oplossing onder druk te zetten. Voor zowel aanhangend als de suspensiecultuur van neurostamcellen werden cellen verzameld en werden de bollen direct in de chip geladen.

Voor beeldverwerving werd gebruik gemaakt van een omgekeerde microscoop met een automatische translationele fase en de digitale complementaire metaaloxide halfgeleidercamera. Het podium en de beeldverwerving werden bestuurd via de software toont de linkerbovenhoek en de kamers in de rechterbenedenhoek als selectiepunten en verplaatst de translationele fase naar de punten ordelijk om de voorlopige beeldvorming met 4x objectieve lens te krijgen. Verander de 4x objectieve lens met de 20x één en pas beeldparameters aan, waaronder lichtintensiteit, belichtingstijd, enzovoort.

Zoek vervolgens de selectiepunten zodat de positie van elke kamer 13 bij 15 kamermatrix verlaat of automatisch door het programma moet worden gedefinieerd. Bij het bepalen van de coördinaten van de kamers verplaatst de vertaalfase zich naar elke kamer waar het X-, Y- en Z-brandpuntsvlak nauwkeurig kan worden afgesteld. Stel het interval en de duur van de beeldvormingscyclus in.

Sla het pad op en begin met beeldvorming. Dit systeem is beschikbaar voor verschillende doel dynamische tracking, zoals neurale stamcellen differentiatie in brightfield en het fluorescentieveld van het proces van neurale stamcellen bolvorming. Data-analyse.

Wijzig de indeling in nd2 in Tif met behulp van het aangepaste MATLAB-programma. En verdeel de gegevens op basis van punten. Selecteer object dat moet worden geanalyseerd is cel of weefsel.

Voer de drempelwaarde, objectgrootte, ruisgrootte in om te analyseren. Of u kunt kiezen voor stapsgewijze analyse naar optimale parameters. En dan alle data analyseren.

Nadat u het resultaat in MAT-indeling hebt opgeslagen, gebruikt u de plot om de resultaten of sporen te tekenen. In dit artikel beschreven we het protocol van de en cultuur van het microfluïdische chipsysteem met hoge doorvoer op basis van de fotolithografietechnologie voor de dynamische regeling van het micromilieu van levende cellen. We hebben ook enkele parameters beschreven die men zorgvuldig moet regelen, zoals de sluitdruk van PDMS-membraankleppen en de centrifugeregeling van vloeistof parallel aan de kamer.

In traditionele celin vitro cultuur wordt de behandeling van celkweekomgeving handmatig uitgevoerd, wat tijdrovend en arbeidsintensief is en vloeistof gevuld is niet gemakkelijk te standaard controleren. Vooral minuten oplossing. Er zijn enkele problemen zoals het genereren van inputs, immuundrugsconcentratie en grote consumptie.

Echter, met behulp van ons microfluïdische systeem, is het mogelijk om het te herhalen als stimulator bij een vaste dosis enkele vloeistof gelijke hoeveelheid uniforme concentratie, verschillende culturen in verschillende kweekkamers tegelijkertijd te vergelijken. Verschillend met wat miniatuur tijdelijke resolutierugstimulans en met het subsetting van de resolutie door de vloeistof te regelen. Bovendien kan ons systeem een groot aantal vergelijkende experimentele resultaten verkrijgen door eenvoudige bewerkingen.

Ons systeem is gebaseerd op het principe van diffusie, creëert minimale mechanische verstoring van het cellulaire micromilieu. Voor stabielere cellulaire micromilieuchips kunt u de lijst van de bufferlaag verhogen als de diepte van de kweeklaag of de invoervloeistof van mediumuitwisseling verminderen, dat wil zeggen de druk verminderen, die hier zal zijn voor het onderzoek naar celgedrag. Het valt op dat deze studie alleen de cultuur van 3T3- en NSC-cellen heeft onderzocht.

Voor andere cellen of cellijnen zijn de kweekomstandigheden vergelijkbaar met onze parameters om deze aan te passen.