4D-microscopie: Caenorhabditis elegans embryonale ontwikkeling ontrafelen met behulp van Nomarski-microscopie

4D-microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het reconstrueren van de volledige cel-afstamming van C.elegans-embryo of enig ander specimen op het niveau van een enkele cel. Nomarski-optica kan worden gebruikt om veranderingen in celvorm tijdens de ontwikkeling te benadrukken met een standaard microscoop en doorgelaten licht, zonder de noodzaak van transgene dieren of fluorescentiemicroscopie. 4D-microscoop maakt het mogelijk om de celcyclus, proliferatie, differentiatie en apoptose in C.elegans en in andere systemen zoals zoogdieren of weefselcelkweek te bestuderen.

Celafstammingstracering op DIC-beelden wordt handmatig uitgevoerd. Het is tijdrovend en vereist enige oefening om een volledige embryo-analyse uit te voeren. Het demonstreren van de procedure zal Begona Ezcurra zijn, een technicus in ons lab.

Voordat je de embryo's voorbereidt, pas de opnametemperatuur van de 4D-microscoop aan op 15, 20 of 25 graden Celsius en stel de microscoop in om 1.500, 30 focale vlak z-stacks van één micrometer uit elkaar te registreren met 30 seconden tussenpozen tussen het begin van elke stack. Verdeel vervolgens 500 tot 1000 microliters vloeibare 4,5% agar in drie millimeter glazen buisjes en verzegel de buisjes voorzichtig met wasfilm om uitdroging te voorkomen. Om een dunne homogene agarpad voor de opname voor te bereiden, verwarm en verdeel een deel agar voorzichtig over een alcoholbrander tot de agar gesmolten is en plaats de buis in een 80 graden Celsius hitteblok.

Plaats een glazen microscoopglaasje op een stuk plastic en gebruik een weidepipet in één hand om een kleine druppel gesmolten agar in het midden van het glaasje te plaatsen, gebruik vervolgens onmiddellijk de andere hand om een tweede glaasje op de agardruppel te plaatsen om een zeer dunne agarpad te creëren. Om de embryo's te monteren, gebruik eerst een picker om 5 tot 10 gravide hermafrodieten over te brengen in een horlogeglas gevuld met water onder een stereomicroscoop. Gebruik een scalpel om de hermafrodiet nederdieren open te snijden en één tot vier vroege eieren uit de baarmoeder te extraheren.

Schuif voorzichtig het bovenste glaasje van de agarpad en gebruik een capillaire buis om een vroeg ei in het midden van de pad te plaatsen. Gebruik een wimper die aan het uiteinde van een tandenstoker is vastgelijmd om de ei-positie zo nodig aan te passen en gebruik de capillaire pipet om overtollig water te verwijderen. Gebruik een scalpel om de dekglas langzaam en schuin over de voorbereiding te draperen voordat je een micropipet gebruikt om 3/4 van de ruimte rond de agarpad met water te vullen.

Versluit vervolgens het dekglas met petroleumgel om uitdroging tijdens lange opnameperioden te voorkomen. Plaats na het verzegelen het glaasje op de 4D-microscoopstandaard en gebruik een objectief met lage vergroting om het embryo scherp te stellen. Selecteer het 100X-onderdoel en focus de condensor.

Open volledig de opening van de condensor en sluit het velddiafragma om een hogere numerieke apertuur en grotere resolutie te bieden. Draai de Wollaston-prisma om een driedimensionale afbeelding van het embryo te verkrijgen dat aan één kant verlicht is, draai vervolgens het prisma in de andere richting om het effect te krijgen dat het embryo aan de andere kant verlicht is en begin met de 4D-opname. Voor cel-afstammingsreconstructie van een 4D-opgenomen embryo, open de afstammingstraceringssoftware en selecteer Bestand en Nieuw project.

Selecteer de juiste cel-afstammingssjabloon afhankelijk van de opnametemperatuur en stel het scanaantal in op 1500. De tijd tussen scans op 30 seconden, het niveauaantal op 30 en de afstand tussen niveaus op één micrometer. Selecteer het afbeeldingsbestand, formaat en directory waar de afbeeldingen zijn opgeslagen.

Selecteer of de afbeeldingen zijn opgeslagen als enkele afbeeldingen of als meervoudige afbeeldingen z-stacks en stel de bestandsnamen en afbeeldingsformaten in. Klik vervolgens op Kanaalverwerking ingeschakeld om de juiste lichtkanalen van de 4D-film te detecteren en in te stellen. Voor celafstammingstracering, start de celafstammingstraceringssoftware.

Een videovenster en een cel-afstammingsvenster verschijnen. Selecteer in het afstammingsvenster de afstammingstak en klik op de celkern die overeenkomt met deze cel in het videovenster. Speel de 4D-film vooruit, achteruit of een niveau omhoog of omlaag om de cel van belang ruimtelijk in de tijd te volgen.

Klik periodiek op de celkern om een punt in de afstammingstak te genereren en om de ruimtelijke coördinaten van de cel op een specifiek moment te registreren. Als gevolg hiervan zijn celafstammingsprogressies en 3D-reconstructies van het embryo mogelijk. Druk vervolgens op de retourtoets om mitose te markeren en selecteer een van de dochtercellen om de celprogressie te volgen zoals zojuist is gedemonstreerd.

Herhaal de analyse voor de rest van de embryonale cellen om de volledige celafstamming na te gaan of om specifieke cellen van belang te volgen, zoals cellen die apoptose ondergaan. Om de vergelijking van mutante afstammingen van belang met de stereotiepe wild-type C.elegans-cel-afstamming mogelijk te maken, worden wormplaten geïncubeerd in kartonnen dozen om condensatie te voorkomen.

Zodra de opname is voltooid, kan de celafstamming worden gereconstrueerd met behulp van de afstammingstraceringssoftware zoals gedemonstreerd. In deze representatieve analyse werd bijvoorbeeld de getraceerde gsr-1-mutante embryo-cel-afstamming vergeleken met de wild-type C.elegans-afstamming. En de detectie van een progressieve vertraging in de celcyclus tijdens de embryonale ontwikkeling werd onthuld.

Als gevolg hiervan stopten mutante embryo's in tussenliggende stadia, terwijl wild-type embryo's voortschreden en uiteindelijk uitkwamen als larven. Bovendien kunnen andere belangrijke kenmerken van embryonale ontwikkeling, zoals apoptose, dynamisch worden gevisualiseerd met behulp van 4D-microscopie. Afstammingstracering van de DIC-afbeeldingen moet handmatig worden verwerkt.

Een softwareverwerking van ongemarkeerde cellen op zichtbaar licht in vroege ontwik