Visualiseren van de Calcitonine Gen-Gerelateerde Peptide Immunoreactieve Innervation van de Rat Cranial Dura Mater met Immunofluorescentie en Neural Tracing

Dit protocol kan een variabele methodologische referentie bieden voor het begrijpen van de gecompliceerde neurovasculaire structuur van de craniale dura mater op de fysiologische of pathologische aandoening. Profiterend van transparante gehele mount dura mater, kan de spaciale correlatie van dural CGRP immunoreactieve zenuwvezels en bloedvaten worden aangetoond in een 3D-weergave. Na euthanasie van een rat, transcardially doordrenkt met 100 milliliter van 0,9% normale zoutoplossing gevolgd door 250 tot 300 milliliter 4% paraformaldehyde in 0,1 molaire fosfaatbuffer.

Als u klaar bent, verwijdert u de hoofdhuid en opent u de schedel om de dura mater en dorsale kant van de hersenen bloot te leggen. Ontleed de craniale dura mater langs de hersenstam naar de olfactorische bol in een heel mount patroon. Spoel de craniale dura mater ongeveer een minuut af in 0,1 molaire fosfaatbuffer en incubeer deze in een blokkerende oplossing.

Breng de dura mater 's nachts over in het anti-CGRP-antilichaam van de muis. Was de dura mater de volgende dag driemaal in 0,1 molaire fosfaatbuffer. Incubeer de dura mater in een gemengde oplossing van ezel antimuis Alexa Fluor 488 secundair antilichaam en falloïde 568 in 0.1.

Molaire fosfaatbuffer met 1%normaal ezelsserum en 0,5%Triton X-100 gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de dura mater drie keer in 0,1 molaire fosfaatbuffer, knip de randen bij en monteer deze op microscoopglaasjes. Doe op cover slips met 50%glycerine voor observatie.

Beeld de hele mount dura mater met een fluorescerende microscoop, maak vervolgens beelden van de CGRP immunoreactieve zenuwvezels en falloïdine-gelabelde bloedvaten in de dura mater met behulp van een confocale microscoop. Scheer het hoofd van de rat met een elektrisch scheermes, leg vervolgens stompe oorstangen tegen de rat en plaats deze op het stereotaxic-apparaat. Plaats de mondhouder en breng oogzalf aan op de ogen.

Reinig de chirurgische kant van de hoofdhuid met 75% ethanol en maak een incisie langs de middellijn van de hoofdhuid. Verwijder het periosteum en de spierweefsels botweg van de schedel met steriele applicators met katoenen punt. Boor een klein gaatje met behulp van een braamboor met een ronde puntbit op de linker pariëtale en temporale botten boven de middelste hersenvliesslagader.

Bouw een bank rond het gat met tandsilicaatcement en voeg twee microliters fluorgoud toe aan het gat rond de middelste meningeale slagader met een microsyringe van 10 microliter. Bedek het gat met een klein stukje hemostatische spons. Leg een stuk paraffinefilm op het gat en sluit de randen af met beenderwas.

Hecht de wond met steriele draad. Houd de ratten in een warme omgeving totdat ze volledig zijn hersteld. Breng de ratten dan terug naar hun kooien.

Na zeven overlevingsdagen, perfuseer deze ratten met 0,9% normale zoutoplossing gevolgd door 4% paraformaldehyde in 0,1 molaire fosfaatbuffer. Ontleed de TG en cervicale één tot vier DRG's en snijd ze vervolgens op de dikte van 30 micrometer op een cryostaatmicrotomesysteem in de sagittale richting. En monteer de secties op silane gecoate glazen dia's.

Omcirkel de secties met een histochemische pen en incubeer ze gedurende 30 minuten in een blokkerende oplossing. Breng de monsters over in de oplossing van konijn anti-fluorgoud en muis anti-CGRP antilichaam en incubeer bij vier graden Celsius 's nachts. Was de volgende dag de secties drie keer in 0,1 molaire fosfaatbuffer.

Incubeer de gewassen secties in een gemengde oplossing van ezel anti-konijn Alexa Fluor 594 en ezel anti-muis Alexa Fluor 488 secundaire antilichaam. Was ze vervolgens drie keer in 0,1 molaire fosfaatbuffer en breng afdekstroken aan met 50% glycerine ter observatie. Maak foto's van de fluorgoud gelabelde neuronen in TG en DRG's onder UV-verlichting met behulp van een fluorescerende microscoop.

Leg vervolgens beelden vast van de fluorgoud en CGRP gelabelde neuronen in TG en DRG's. Na immunofluorescente en fluorescerende histochemische kleuring met CGRP en phalloidine, werden CGRP immunoreactieve zenuwvezels en phalloïdine gelabeld dural arterioles en bindweefsels duidelijk gevisualiseerd in de hele mount cranial dura mater in een 3D-patroon. Zowel dikke als dunne CGRP immunoreactieve zenuwvezels lopen parallel aan de dural arteriële rond de vaatwand of tussen de bloedvaten.

Zeven dagen na fluorgoudtoepassing op het gebied van de middelste hersenvliesslagader en de schedel dura mater van de rat, werden de fluorgoud gelabelde neuronen gedetecteerd in TG en cervicale DRG's aan de ipsilaterale kant van de tracertoepassing, die direct werd waargenomen onder de UV-verlichting van de fluorescerende microscopie. Fluorogold gelabelde neuronen werden gevonden in alle drie de takken van TG, met hogere concentraties op de oogheelkundige en maxillaire divisies en met lagere concentraties op de mandibulaire deling. Sommige van de fluorgoud gelabelde neuronen werden ook waargenomen in de cervicale twee tot drie DRG's.

Deze dubbele immunofluorescentie representatieve foto's tonen sensorische neuronen in TG en DRG. De gelabelde neuronen met FG, CGRP en zowel FG als CGRP werden gevisualiseerd door dubbele immunofluorescentie. Wanneer u dit protocol probeert, vergeet dan niet om de craniale dura mater volledig te ontleden en op een dia te plakken in een heel montagepatroon.