Identificatie, isolatie en karakterisering van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopercellen (MP's) in skeletspieren bij de rat

Aangezien FAP's mediatoren zijn van spierregeneratie en pathologische fibrose, maakt ons protocol het mogelijk om de FAP-dynamiek na spierletsel te karakteriseren en FAP's te isoleren voor in vitro of ex vivo studies. Tot op heden zijn studies uitsluitend uitgevoerd op FAPs geïsoleerd van muizen. Ons protocol maakt een effectieve isolatie van FAPs van de grotere rat mogelijk, waardoor er veel meer weefsel beschikbaar is voor downstream-assays.

Langdurige weefselverwerkingstijd kan de levensvatbaarheid van FAPs negatief beïnvloeden. Als meerdere monsters tegelijkertijd worden verwerkt, wordt aanbevolen dat twee operators het protocol samen uitvoeren om de levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen te maximaliseren. Begin met het plaatsen van het geoogste spierweefsel in een steriele celkweekschaal van 10 centimeter.

Scheur en hak het weefsel voorzichtig met een tang en verwijder bindweefsel om ongeveer drie tot vier millimeter blokjes te verkrijgen. Breng het minsterweefsel over in een steriele conische buis van 50 milliliter met zes milliliter DMEM en 1% penicilline-streptomycine. Activeer vervolgens 365 microliter collagenase II-oplossing door 10 microliter 300-millimolaire calciumchlorideoplossing toe te voegen.

Voeg de geactiveerde collagenase II-oplossing toe aan de weefselslib voor een eindconcentratie van 250 eenheden per milliliter. Incubeer de buizen in een shaker gedurende een uur en bij 37 graden Celsius bij 240 x g met handmatig roeren om de 15 minuten om weefsel los te maken dat aan de zijkant van de buis is gehecht. Voeg na een uur incubatie 100 microliter collagenase II en 50 microliter dispase toe aan het monster.

Pipetteer vervolgens monsters 15 tot 20 keer met een serologische pipet totdat de oplossing homogeen is. Incubeer het monster opnieuw gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en 240 x g met handmatig roeren om de 15 minuten. Schuif de monsters van de spieroplossing langzaam door een spuit van 20 milliliter met een naald van 20 gauge gedurende 10 cycli.

Plaats vervolgens een celzeef van 40 micron op een steriele conische buis van 50 milliliter en maak deze nat door vijf milliliter DMEM te pipetteren, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Pipetteer het monster één milliliter per keer door de zeef. Zodra het hele monster is gefilterd, wast u de celzeef met DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine om het totale monstervolume op 25 milliliter te brengen.

Verdeel het monstervolume gelijkmatig in twee conische buisjes van 15 milliliter en centrifugeer bij 15 graden Celsius, 400 x g gedurende 15 minuten. Zuig na centrifugeren het supernatant op en resuspend de pellet gedurende zeven minuten in één milliliter RBC-lysisbuffer bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens negen milliliter wasbuffer toe om het volume op 10 milliliter te brengen en centrifugeer bij 15 graden Celsius, 400 x g gedurende 15 minuten.

Zuig na het centrifugeren het supernatant op en resuspend de pellet in een milliliter wasbuffer. Breng een geschikt volume cellen over in een afzonderlijke microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en meng deze met trypanblauwe kleurstof. Tel levende cellen op een lichtmicroscoop met behulp van een hemocytometer.

Breng voor flowcytometrie één tot 2 miljoen cellen per experimenteel monster over naar een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Breng het monstervolume met wasbuffer op één milliliter en plaats de buis op ijs. Stel alle besturingselementen voor het experiment in.

Voor celcontroles, aliquot 500,000 tot 1 miljoen cellen in een milliliter wasbuffer in een 1,5-milliliter microcentrifugebuis en plaats deze op ijs. Als het experiment voor de eerste keer wordt uitgevoerd, moeten ook suspensies met één kleur cel worden opgenomen. Om kraalcontroles in te stellen, voegt u ongeveer 150.000 positieve compensatieparels toe aan elke gelabelde centrifugebuis van 1,5 milliliter.

Bereid de levensvatbaarheidsregeling voor door de helft van het celvolume van de levensvatbaarheidsbuis over te brengen om de 1,5-milliliter microcentrifugebuis met het label dood te verversen. Incubeer de dode buis bij 65 graden Celsius gedurende twee tot drie minuten en plaats deze vervolgens op ijs. Breng na de incubatie de dode cellen terug naar de levensvatbaarheidsbuis.

Centrifugeer de eencellige suspensies, inclusief experimentele en controlemonsters bij 500 x g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten, en resuspend de celkorrels in 100 microliter wasbuffer na het aanzuigen van het supernatant. Voeg antilichamen toe volgens de controle of experimentele toestand en veeg voorzichtig met het monster om een volledige menging te garanderen. Incubeer ze vervolgens gedurende 15 minuten op ijs in het donker.

Voor compensatieparels incubeer je de buis bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 minuten. Breng het volume van elk monster op één milliliter door 900 microliter wasbuffer toe te voegen aan de eencellige suspensie en 900 microliter PBS voor compensatieparelcontroles. Centrifugeer eencellige suspensies bij 500 x g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten, en compensatieparelcontroles bij 300 x g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Na het centrifugeren van de monsters, zuigt u het supernatant op en resuspendeert u de celkorrel in 300 microliter wasbuffer en kraalcontroles in 300 microliter PBS en 150.000 negatieve compensatieparels. Bewaar de celmonsters op ijs en kraalmonsters bij kamertemperatuur onder aluminiumfolie. Ga verder met het verwerven van flowcytometrie door het opzetten van de gating-strategie om fibro-adipogene voorlopers en myogene voorlopers te identificeren.

In de representatieve analyse werd een succesvolle conjugatie van het Sca-1 APC-antilichaam met enkele kleuring van compensatieparels en celsuspensies gegenereerd uit gezonde gastrocnemiusspier bij ratten bevestigd. Vijf verschillende concentraties Sca-1 APC werden getitreerd op eencellige suspensies en de optimale concentratie van antilichamen werd geïdentificeerd op basis van de grootste fluorescentie-intensiteit met minimale achtergrondkleuring. Flowcytometrische identificaties van FAPs en MP's bij rattengastrocnemius werden uitgevoerd met behulp van de hier getoonde gating-strategie.

Monsters werden eerst omheind om puin uit te sluiten bij het tellen van kralen. Cellen werden vervolgens gated om doubletten uit te sluiten door zowel front scatter als side scatter kenmerken. De levensvatbaarheid van de resulterende cellen werd beoordeeld door kleuring met SYTOX Blue.

SYTOX Blue negatieve singlets werden beoordeeld voor CD31 en CD45 om Lin+fracties uit te sluiten. De Lin-populatie werd beoordeeld. Cellen die enkel positief waren voor Sca-1 werden aangeduid als FAP's en cellen die enkel positief waren voor VCAM-1 werden aangewezen als parlementsleden.

Met co-immunostaining onmiddellijk na sortering vertoonde de vers geïsoleerde populatie van FAPs positieve kleuring voor PDGFRalpha zonder besmetting door Pax7-positieve cellen. Omgekeerd kleurde de gesorteerde populatie van parlementsleden positief voor Pax7 met een afwezigheid van PDGFRalpha-positieve cellen. FAPs toonden gedifferentieerde fibroblasten en adipocyten op dag 12 in adipogene differentiatiemedia met expressie van respectievelijk fibroblastspecifiek eiwit 1 en perilipin 1.

De aanwezigheid van neutrale triglyceriden en lipiden van volwassen adipocyten was duidelijk met Oil Red O-kleuring. Bovendien toonden de FAPs een aanwezigheid van collageen type I en een afwezigheid van contaminerende myocyten. Kamerleden gekweekt in myogene differentiatiemedia op dag 12 vertoonden de aanwezigheid van volwassen myocyten en gefuseerde multinucleaire myotubes en waren vrij van fibroblasten en adipocytenbesmetting.

Bij het gebruik van deze techniek om levende cellen te isoleren voor langdurige kweek, moeten onderzoekers ervoor zorgen dat ze aseptische techniek gebruiken en tegelijkertijd efficiënt werken om een goede levensvatbaarheid van de cel te garanderen.