Intramyocardtransplantatie van MSC-Loading Injecteerbare Hydrogels na myocardinfarct in een Murine-model

Deze methode kan helpen bij het aanpakken van belangrijke problemen in de huidige verergerde harttherapie, zoals lage toepasbaarheid voor lage retentie en overleving van getransplanteerde cellen in infarcteerde harten. Om dit probleem aan te pakken, kan deze methode een betrouwbare techniek bieden om intramyocardial transplantatie met stamcellen te bestuderen met behulp van injecteerbare hydrogels in een muismodel, wat een uitstekend platform is om cardiale weefselreparatie en regeneratie na myocardinfarct te onderzoeken. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een haalbare methode is om de retentie en overleving van getransplanteerde stamcellen na intra-myocardial transplantatie te verbeteren met behulp van in-situ cross-link cover injecteerbare hydrogels.

Deze hydrogels bieden diverse mogelijkheden voor cardiale weefselengineering, zoals het leveren van niet alleen stamcellen, maar ook groeifactoren, genetisch materiaal en geneesmiddelen om hun therapeutische effect in infarcteerde hartweefsels te maximaliseren. Eunmi Lee, een onderzoekstechnoloog uit mijn laboratorium, zal de procedure voor het in-vitro experiment demonstreren. Eun-Hye Park en Eunhwa Seong onderzoekstechnologen zullen de procedure voor in-vivo experimenten demonstreren.

Kweek mesenchymale stamcellen, of MSC's in een 100 millimeter kweekschaal bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Wanneer de cellen 80% confluëntie bereiken, was de schaal twee keer met DPBS en incubeer ze met een milliliter trypsine-vervanger bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Voeg vervolgens negen milliliter kweekmedium toe aan de cellen en centrifugeer ze gedurende drie minuten bij 500 maal G.

Gooi het resulterende supernatant weg. Resuspendeer de cellen in een milliliter PBS en houd de celsuspensie op ijs. Verdun 10 microliters celsuspensie met 10 microliters trypanblauw en bepaal de celconcentratie met behulp van een geautomatiseerde celteller.

Resuspendeer de MSC's tot een dichtheid van een maal 10 tot de zevende cel per milliliter en breng ze over naar een milliliter buisje. Bereid een 6,25% GH-conjugaat oplossing in PBS en verdeel deze in twee flesjes. Meng vervolgens de GH-oplossingen met zes microgram per milliliter HRP of 0,07% waterstofperoxide.

Centrifugeer de celsuspensie kort bij 1000 maal G en aas voorzichtig het resulterende supernatant af. Meng vervolgens de celpellet met GH-oplossing A. Laad de MSC's in GH-oplossing A en GH-oplossing B in beide zijden van een dubbele spuit. Plateer 300 microliters van de gecombineerde GH-oplossingen met MSC's bij een eindconcentratie van 5 miljoen cellen per milliliter op een achtputjes kamerschijf.

Na in situ hydrogelvorming en daaropvolgende MSC-incapsulatie via enzymatische cross-linking, voeg 700 microliters DMEM toe dat 10% FBS en 1% antibioticum-antimycotische oplossing bevat. Incubeer de schijf bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide en vervang het kweekmedium elke twee tot drie dagen. Voor de operatie, onthaar de borstkas van de muis met behulp van een ontharingscrème en steriliseer de huid met jodium.

Plaats de muis op een operatietafel en intubeer hem door een katheter in de luchtpijp in te brengen om aanvullend zuurstof te leveren via mechanische ventilatie. Snijd voorzichtig door de huid met chirurgische schaar. Dring vervolgens de intercostale spieren door met micro schaar.

Separeer de tweede en derde linker ribben met behulp van een 5-O zijden naald om een open borstholte te behouden. Ligatuur de linker voorste aflopende kransslagader zorgvuldig met behulp van een naaldhouder met een 8-0 polypropyleen naald en snijd de naald af met behulp van elektrocauterisatie. Observeer een onmiddellijke kleurverandering in de voorste linker ventrikelwand.

Na het induceren van het myocardinfarct, injecteer 10 microliters van de MSC-beladen GH-oplossingen op twee verschillende punten in de infarctgrenszone. Herstel de geopende borstholte en sluit de spieren en huid met behulp van 5-0 naden. Verwijder de tracheaalbuis en plaats de muis in een kooi onder een infraroodlamp tijdens het herstel.

Voer een echocardiografie uit en meet de bijbehorende lijnen voor LV voorwand, LV intern en LV achterwand om de dikte van de hartwand, de kamerdimensie en de fractionele verkorting te verkrijgen. Voorafgaand aan de in vivo transplantatie, werd de proliferatie en overleving van MSC's in GH-hydragels bevestigd door een 3D in vitro levende dode celkleuringstest. Representatieve beelden vertoonden voldoende MSC-proliferatie met vertakte netwerken binnen GH-hydrogels.

Een uitgebreide meercellige 3D-structuur van MSC's werd duidelijk waargenomen op dag 14, wat aangeeft dat GH-hydrogels een geschikte micro-omgeving voor de ingekapselde cellen kunnen bieden. Na de inductie van myocardinfarct, werden MSC-beladen GH-hydrogels intramyocardiaal getransplanteerd in de peri-infarct gebieden. De MSC's en het gel werden adequaat gehandhaafd binnen het infarcteerde gebied.

MSC's waren goed geïntegreerd in GH-hydrogels. Om de therapeutische effecten van de MSC-beladen GH-hydrogels te verifiëren, werden de veranderingen in hartfunctie en structuur geëvalueerd door middel van echocardiografie en histologische analyse op dag 28 na transplantatie en vergeleken tussen de verschillende behandelingsgroepen. De representatieve echocardiografie toonde verbeterde hartfuncties, waaronder fractionele verkorting, ejectiefractie en eindsystolisch volume in de MSC-gel behandelde groep.

Bovendien vertoonde histologische analyse minder fibrose, dikkere infarcteerde wanden en een kleinere infarctgrootte in de MSC-gel behandelde groep dan in de andere groepen, wat aangeeft dat dit protocol de LV-remodeling aanzienlijk verminderde. Met behulp van deze techniek hebben we langetermijnstamcellen en proliferatie bereikt en geleid tot een aanzienlijke verbetering van de hartstructuur en functie na myocardinfarct in een muismodel. Deze techniek kan worden uitgebreid voor gebruik in grote dieren en voor klinische toepassing als een nieuwe strategie voor preventie van post-infarct hartfalen door cardiaal weefselreparatie en regeneratie te bieden.