Asymmetrische flowveld-flow fractionering voor dimensionering van gouden nanodeeltjes in ophanging
11 september 2020
Dit protocol beschrijft het gebruik van Asymmetrische Flow Field-Flow Fractionation in combinatie met UV-vis detectie voor de bepaling van de grootte van een onbekend goud nanodeeltje monster.
Het gebruik van asymmetrische flowveld-flowfractiefractie in combinatie met externe groottekalibratie is een krachtig hulpmiddel voor het nauwkeurig bepalen van de grootteverdeling van gouden nanodeeltjes in suspensie. AF4 bestrijkt het hele groottebereik, van één tot 1000 nanometer. Het is onafhankelijk van de monstersamenstelling van de monsterstof en kan zelfs worden toegepast op slecht gedispergeerde en complexe monsters.
De schoonheid van AF4 is het zeer brede toepassingsgebied, dat niet alleen nanodeeltjes van verschillende aarden en groottes omvat, maar ook eiwitten, virussen of synthetische of natuurlijke macromoleculen. Begin met het vortexen van 50 milligram per liter van een willekeurige gouden nanodeeltjesgroottestandaard gedurende twee minuten voordat u de standaard verdunt tot een verhouding van één tot vier met ultrapuur water. Vortex vervolgens de verdunde oplossing gedurende nog eens twee minuten om een gehomogeniseerde suspensie te verkrijgen.
Na het reinigen van het systeem opent u de AF4-cartridge om de AF4-membraan te vervangen. Spoel de nieuwe membraan met UPW en bouw de cartridge weer in elkaar. Sluit vervolgens de cartridge opnieuw aan op het AF4-UV-vis-systeem.
Spoel het gereinigde AF4-UV-vis-systeem minimaal 30 minuten door met gefilterd en ontgast eluaat door een tip-stroomsnelheid van één milliliter per minuut, een focusstroomsnelheid van één milliliter per minuut en een cross-stroomsnelheid van 1,5 milliliter per minuut toe te passen, om de membraan te gelijken, het systeem te stabiliseren en te controleren op mogelijke lekken. De systeemdruk moet een constant niveau tussen vier en 12 bar bereiken. Om het AF4-UV-vis-systeem te kwalificeren door de massaherstel en variatie van de retentietijd te bepalen met behulp van een willekeurige gouden nanodeeltjesgroottestandaard, voert u een directe injectie-run uit zonder toepassing van een scheidingskracht.
Voer vervolgens een fractioneringsrun uit met toepassing van een scheidingskracht. Om gouden nanodeeltjesgroottestandaarden voor de externe groottekalibratie voor te bereiden, vortext u alle 50 milligram per liter gouden nanodeeltjesgroottestandaarden gedurende twee minuten en verdunt u elk respectief monster voor analyse in ultrapuur water met een verhouding van één tot vier. Wanneer de groottestandaarden zijn voorbereid, stelt u onder het FFF-methodetab de detector-stroomsnelheid in op 500 microliter per minuut, de injectiestroomsnelheid op 500 microliter per minuut en de injectietijd op 0,1 minuten.
Stel een elutieduur van acht minuten in zonder gedefinieerde scheidingskracht en injecteer 10 microliter van de eerste standaard in het systeem. Wanneer alle groottestandaarden zijn gemeten, injecteert u 50 microliter van de eerste standaard in het systeem. Stel de detector-stroomsnelheid in op 500 microliter per minuut.
Stel de vertraging in op twee minuten, de injectiestroomsnelheid op 200 microliter per minuut gedurende vijf minuten en de overgangstijd op 0,2 minuten. De focusstroomsnelheid wordt automatisch berekend. Stel de elutieduur in op 60 minuten en de cross-stroomsnelheid op één milliliter per minuut.
Deze AF4-methode gebruikt een constante cross-stroomsnelheid die wordt gevolgd door een lineaire afname gedurende 10 minuten tot nul microliter per minuut. Stel de spoelfase van negen minuten in met een tip-stroomsnelheid van 500 microliter per minuut. Wanneer alle gouden nanodeeltjesgroottestandaarden zijn gefractioneerd, bereidt u het onbekende gouden nanodeeltjesmonster voor en voert u een directe injectiemeting en fractionering van het onbekende gouden nanodeeltjesmonster uit zoals zojuist is gedemonstreerd.
Om de gegevens te analyseren importeert u de gegevensbestanden in de systeemsoftware. Geef de metingen weer in het overzichtstab en selecteer het UV-vis-detectorsignaal uit de detectielijst. Definieer een interessegebied en baseline voor elke meting en pas de signaal- en baselineweergave zo nodig aan.
Gebruik de signaalverwerkingstoolbox om eventuele lawaaierige signalen glad te strijken en gebruik de functie toewijzen van verwerkingsparameters aan andere runs om de parameters toe te wijzen aan andere metingen. Om een massaherstelberrekening uit te voeren, opent u de directe injectiemetingen en fractioneringsgegevens. Voeg een directe injectiekalibratie toe en selecteer de respectieve directe injectiemetingen uit de directe injectiekalibratie-instellingenweergave.
Het injectievolume en de concentratie van het monster worden gebruikt om het piekoppervlak te correleren met de geïnjecteerde hoeveelheid. Gebruik vervolgens de functie toewijzen aan geselecteerde deeltjespresets om de verkregen kalibratiefunctie toe te wijzen aan de respectieve fractioneringsmetingen. Gebruik vervolgens de vergelijking om de massaherstel van gouden nanodeeltjes te berekenen door het gebied onder de respectieve UV-vis-pieken van de fractionerings- en directe injectiemetingen te vergelijken.
Om de resultaten weer te geven, opent u de berekening van de kwantitatieve resultaten. Er wordt een massaconcentratie gepresenteerd op basis van het piekoppervlak. De massaherstel kan worden verkregen door deze waarde te vergelijken met de geïnjecteerde concentratie.
Onder het tabblad deeltjesgrootte in het venster voor deeltjesgroottekalibratie, klikt u op elke geschikte meting in de selectiereferenties voor kalibratietabel om alle kalibratieruns te selecteren. De metingen worden in een tabel weergegeven naarmate ze worden geselecteerd. Voer de hydrodynamische straal in voor alle kalibratiemetingen.
De functie en vergelijking worden weergegeven in het venster voor de functie voor deeltjesgroottekalibratie. Om de kalibratiefunctie toe te wijzen aan de metingen van het onbekende gouden nanodeeltjesmonster, selecteert u de respectieve fractioneringen binnen de selecteer runs voor toewijzingslijst en opent u een berekening van de deeltjesgrootteverdeling om de resultaten weer te geven. De berekende grootte wordt getoond in het venster voor de deeltjesgrootteverdeling, gelabeld op het piekmaximum.
En de eerder gemaakte deeltjesgroottekalibratie zal worden vermeld als de kalibratie voor de metingen van het onbekende gouden nanodeeltjesmonster. Om alle metingen van één monster te gemiddelen, selecteert u het selectievakje gemiddelde signalen voor monster. Het resultaat
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van asymmetrische flow field-flow fractionering (AF4) gekoppeld aan UV-visdetectie voor het bepalen van de grootteverdeling van goudnanodeeltjes in suspensie. AF4 is veelzijdig en kan een breed scala aan deeltjesgroottes analyseren, waardoor het geschikt is voor complexe monsters.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Karakterisering van nanodeeltjes
- Analytische chemie
- Biofysica
Achtergrond
- AF4 is effectief voor de grootteanalyse van nanodeeltjes van 1 tot 1000 nanometer.
- De methode is onafhankelijk van de samenstelling van het monster, waardoor analyse van slecht gedispergeerde monsters mogelijk is.
- AF4 kan worden toegepast op verschillende soorten deeltjes, waaronder eiwitten en virussen.
- Analyse van de grootteverdeling is cruciaal voor het begrijpen van het gedrag van nanodeeltjes in biologische systemen.
Doel van de studie
- Om de grootteverdeling van onbekende goudnanodeeltjesmonsters nauwkeurig te bepalen.
- Om de effectiviteit van AF4 aan te tonen bij het analyseren van complexe nanodeeltjessuspensies.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden waarmee onderzoekers de methode kunnen reproduceren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van goudnanodeeltjes-groottestandaarden via verdunning en vortexen.
- Kalibratie van het AF4-UV-vis-systeem voor nauwkeurige metingen.
- Directe injectie en fractionering van onbekende monsters.
- Data-analyse met behulp van systeemsoftware om de massarecuperatie en grootteverdeling te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kalibratie van het AF4-systeem met bekende groottestandaarden.
- Nauwkeurige bepaling van de grootteverdeling van onbekende goudnanodeeltjes.
- Demonstratie van berekeningen voor massarecuperatie op basis van UV-vis piekgebieden.
- Visualisatie van de resultaten van de grootteverdeling voor een effectieve interpretatie.
Conclusies
- AF4 gekoppeld aan UV-vis detectie is een betrouwbare methode voor de analyse van de grootte van nanodeeltjes.
- Het protocol kan worden aangepast voor verschillende typen nanodeeltjes en complexe monsters.
- De resultaten bieden waardevolle inzichten in de karakterisering van goudnanodeeltjes.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Nauwkeurige bepaling van de nanodeeltjesgrootte is essentieel voor het voorspellen van biologisch gedrag, stabiliteit en werkzaamheid bij de ontwikkeling van nanogeneesmiddelen. Asymmetrische flow field-flow fractionatie (AF4) gekoppeld aan UV-visdetectie biedt een robuuste, samenstellingsonafhankelijke methode voor het bepalen van de grootte van goudnanodeeltjes in suspensie, wat betrouwbare karakterisering mogelijk maakt in het bereik van 1–1000 nm. Deze mogelijkheid ondersteunt vroege targetvalidatie en het verminderen van risico's bij formuleringen door nauwkeurige gegevens over de grootteverdeling te leveren, die essentieel zijn voor go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van therapeutica op basis van nanodeeltjes.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de grootte van nanodeeltjes te onderzoeken als een cruciale fysisch-chemische eigenschap die de biodistributie en cellulaire opname beïnvloedt.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare gegevens over de grootte, onafhankelijk van de complexiteit van het monster, wat consistente hypothesetoetsing ondersteunt voor diverse nanodeeltjesformuleringen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve output van de grootteverdeling via externe kalibratie, wat resulteert in een gestandaardiseerde assay voor het screenen van nanodeeltjesbibliotheken.
- Operationele waarde: Biedt een hoge precisie met een relatieve standaarddeviatie van minder dan 1,1% voor retentietijden, wat de reproduceerbaarheid van de assay tussen verschillende runs en laboratoria waarborgt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de grootte van nanodeeltjes te correleren met functionele uitkomsten in preklinische modellen.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische workflows door gebruik te maken van een gestandaardiseerde, gevalideerde SOP die is aangetoond in interlaboratoriumstudies.
Pipeline- & Workflowintegratie
AF4 met UV-vis-detectie past binnen het continuüm van nanodeeltjesontwikkeling, van vroege ontdekking tot preklinische evaluatie, en levert gegevens over de grootte die informatie bieden voor voorspellingen over de stabiliteit van de formulering en de biologische prestaties.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests door nauwkeurige groottegegevens te leveren om structuur-functierelaties in goudnanodeeltjessystemen te verduidelijken.
- Screening: Maakt assay-klare karakterisering van nanodeeltjes mogelijk met externe groottekalibratie, waardoor consistente sizing over verschillende verbindingenbibliotheken wordt gegarandeerd.
- Analytics: Biedt metrieken voor massaterugwinning en grootteverdeling via UV-vis piekarea-analyse, wat een kwantitatieve vergelijking van nanodeeltjesbatches mogelijk maakt.
- Translational Research: Verbindt sizing in de ontdekkingsfase met preklinische validatie via een robuuste, overdraagbare methode die over verschillende laboratoria is gevalideerd.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare SOP voor het bepalen van de grootte van nanodeeltjes die de kwaliteitscontrole standaardiseert over discovery- en developmentteams heen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in het gedrag van nanodeeltjes door nauwkeurige, compositie-onafhankelijke groottemetingen te leveren.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via een gevalideerde SOP met een lage variabiliteit in retentietijd (0,1–0,5% RSD voor onbekenden).
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door onzekerheid in de fysisch-chemische profilering van nanodeeltjes te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk op basis van betrouwbare gegevens over de grootteverdeling, wat cruciaal is voor de effectiviteit van nano-geoptimaliseerde producten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van nanodeeltjes en de bediening van AF4-systemen.
- Afhankelijk van AF4-UV-vis instrumentatie met mogelijkheden voor debietregeling en detectie.
- Vereist gestandaardiseerde monstervoorbereiding, inclusief vortexen en verdunningsstappen, voor consistentie.
- Betreft cross-team naleving van dezelfde AF4-methode voor standaarden en onbekenden om de validiteit van de kalibratie te waarborgen.
- Beperkt tot monsters die compatibel zijn met UV-vis detectie en stabiel blijven onder AF4-scheidingscondities.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:49
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4)-UV-Visible Spectroscopy System Preparation and Qualification
2:28
AF4-UV-vis Sample Analysis
4:22
Data Evaluation
7:16
Results: Representative AF4 Gold Nanoparticle Sizing
8:51
Conclusion
