Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

Dit protocol kan ons helpen bij het karakteriseren van de immuunrespons van de gastheer tegen verschillende biomaterialen, wat vervolgens kan helpen bij het ontwerpen van betere toekomstige medische implantaten. Flowcytometrie geeft ons informatie over immuuncellen die een biomateriaal infiltreren, wat ons helpt mechanismen te bepalen van hoe cellen reageren op verwonding en materiaalimplantatie, evenals doelen voor verbeterde therapieën. Hetzelfde protocol kan worden aangepast om de immuunrespons in verschillende omgevingen te karakteriseren.

Ontleed de quad-spier van muizen die een week geleden een ECM-implantaat hebben gekregen en zijn verzameld in een buis van 50 milliliter met vijf milliliter serumvrije media. Snijd ten slotte het weefsel in blokjes met een schaar. Voeg vervolgens vijf milliliter spijsverteringsenzymmedia toe aan de buis.

Plaats de buis met spijsverteringsmedia en in blokjes gesneden weefsels gedurende 45 minuten in een schudincubator bij 37 graden Celsius en 100 RPM. Filtreer aan het einde van de incubatie de verteerde weefselsuspensie door een zeef van 70 micron in een individuele buis van 50 milliliter. Gebruik een spuitkop van vijf milliliter om een vast stuk tissues te pureren en was de zeef met PBS op kamertemperatuur.

Gooi eventuele resterende resten in de zeef weg en pas het volume van de buis aan tot 50 milliliter met PBS op kamertemperatuur. Verzamel de cellen door centrifugeren en resuspendeer de pellets in 10 milliliter koude EDTA-oplossing van vijf millimolaire in PBS. Als er bloedcellen in het monster aanwezig zijn, resuspendeer de pellet dan in één milliliter RBC-lysisbuffer, incubeer gedurende 10 minuten en voeg vervolgens negen milliliter EDTA toe.

Laat de suspensie 10 minuten op ijs staan. Pas vervolgens het volume aan tot 50 milliliter met koude PBS. Verzamel de cellen door centrifugeren en resuspendeer de pellets en 100 microliter koude PBS.

Breng 10 microliter van de suspensie over in individuele microcentrifugebuisjes en meng met 10 microliter trip en blauw om te tellen. Doseer het resterende volume cellen in elk putje van een V-bodem met 96 putjes. Verwijder 20 microliter cellen uit het putje en voeg ze toe aan een nieuw putje om te gebruiken als ongekleurde controle.

Gebruik vervolgens PBS om het uiteindelijke volume in elk putje op 200 microliter te brengen. Verzamel de cellen op de bodem van de plaatputjes door centrifugeren en resuspendeer de cellen in 100 microliter van een concentratie van één tot 1000 levensvatbaarheidskleurstof per putje. Was aan het einde van de incubatie elk putje met 100 microliter vers PBS en resuspendeer de pellets in 200 microliter kleurbuffer per putje.

Na de tweede centrifugatie resuspenderen de cellen in 50 microliter van één tot 100 verdunning van monocytenblokker. Incubeer de celsuspensie gedurende vijf minuten op ijs en voeg vervolgens 50 microliter antilichaamcocktail toe. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs beschermd tegen licht.

Was de putjes vervolgens met 100 microliter kleurbuffer per putje. Centrifugeer de cellen opnieuw en was ze met 200 microliter kleurbuffer. Herhaal het proces nog twee keer, gevolgd door de cellen opnieuw te suspenderen in 400 microliter kleuringsbuffer.

Voordat u de steekproef analyseert, voert u een ongekleurde steekproef uit zodat de celpopulatie kan worden aangepast op een zijspreiding versus een voorwaartse spreidingsplot. Voer vervolgens het gekleurde monster uit. Extraheer de autofluorescerende signatuur.

Importeer vervolgens de FCS-bestanden om ze te gebruiken als besturingselement voor het ontmengen. Klik op het pictogram voor het ontmengen om de wizard voor het ontmengen te openen en het ontmengen uit te voeren met behulp van alle besturingselementen voor één kleur door de positieve en negatieve populaties te vergrendelen. Klik vervolgens op het gedeelte QC en bekijk de complexiteitsindex.

De complexiteitsindex is een maat voor hoe te onderscheiden een verzameling spectrale signaturen is wanneer de spectrale signaturen niet met elkaar vermengd zijn. Maak ten slotte de sample ongemengd door op live unmix te klikken. Hier kunnen de resultaten van 14 kleurenfeiten op controlemuizenweefsel worden waargenomen.

In deze analyse konden verschillende lobbypopulaties worden waargenomen, zoals ly6g-positieve neutrofielen en ly6c-monocytklassen met gemiddelde en hoge expressie. CD11c hoge MHC twee positieve dendritische cellen waren duidelijk zichtbaar wanneer ze werden afgeschermd tegen CD11b om macrofagen en andere myeloïde afstammingscellen zoals neutrofielen en monocyten uit te sluiten. Een subset van CD206-positieve CD86-positieve dendritische cellen kan worden geïdentificeerd door zich te concentreren op deze CD11c-positieve populatie, die zowel CD86 hoge M1-achtige dendritische cellen als CD206 hoge M2-achtige dendritische celpopulaties omvat.

F4/80 vertoonde een gradiënt van expressie zoals vaak wordt waargenomen in verschillende macrofaagpopulaties. Siglec-F was aanwezig op zowel F4-80 positieve als negatieve populaties, die hoogstwaarschijnlijk overeenkwamen met respectievelijk een macrofaagsubgroep en eosinofielen. Hoewel kleuring met celoppervlaktemarkers het mogelijk maakt om deze aanduidingen van celtypen te maken, is het belangrijk op te merken dat cellen die verschillende markers tot expressie brengen, op een functionele manier moeten worden bekeken in tegenstelling tot een meer binaire classificatie.

Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat het begrijpen van de autofluorescerende signatuur van uw ondergekleurde monsters voordat u uw paneel ontwerpt, de sleutel is tot het bereiken van een betere en menging. Naast het analyseren van cellen, kunnen de geïsoleerde cellen worden gesorteerd in specifieke populaties voor stroomafwaartse evaluaties met cellulaire assays, in vitro, transcriptomische analyse of voor microscopische analyse om de cellulaire morfologie te evalueren. De toenemende complexiteit van flowcytometrie-analyses van biomaterialen helpt de kloof te overbruggen tussen fundamentele immunologische studies en de ontwikkeling van nieuwe therapieën.