Name: Transuterine foetale tracheale occlusie model in muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Leer de transuterine foetale tracheale occlusietechniek in muizen voor onderzoek naar congenitale hernia diafragmatica en longontwikkeling. Deze omkeerbare methode vermindert sterfte en kosten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek heeft geen specifieke subsidie ontvangen van financieringsinstellingen in de publieke, commerciële of non-profitsector. Alle auteurs hebben een substantiële bijdrage geleverd aan de conceptie en het ontwerp van de studie, verwerving, analyse en interpretatie van gegevens, het opstellen van het artikel en het herzien ervan voor belangrijke intellectuele inhoud en definitieve goedkeuring van de in te dienen versie. De auteurs danken Can Sabuncuoğlu voor zijn vriendelijke inspanningen voor de productie van het kunstwerk van de chirurgische techniek.

Alle experimenten zijn in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80023, herzien 1978). De procedure werd goedgekeurd met IACUC protocol #2016-0068 door de Cincinnati Children's Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Voorbereiding
<ol><li>Om leeftijdsgematchte wild-type (WT) C57BL/6 muizen te paren, plaatst u ze om 18:00 uur in dezelfde kooi.m. en scheidt u ze de volgende dag om 9:00 uur.m.</li>
	<li>Om embryonale dag 0 (E0) te bepalen, kijk naar de vaginale plug, die een homogene buitenste zone heeft die aan de vaginale wand is bevestigd en een binnenzone die vezelig is en enkele spermatozoa bevat die verstrengelde massa's vormen gemengd met de vezels van het plugmateriaal.</li>
	<li>Noteer het gewicht van de muizen op het moment van de paring.</li>
	<li>Weeg de muizen opnieuw op E10 om een voortdurende zwangerschap te garanderen.</li>
	<li>Voer de operatie uit op E16.5 (vroege canaliculaire fase).</li>
	<li>Steriliseer de instrumenten die tijdens de operatie zullen worden gebruikt: schaar, naaldhouder, tang, klemmen en chirurgische messen en handgrepen.</li>
	<li>Verwarm het operatieplatform voor op 24 °C en bereid warme zoutoplossing (24 °C) voor voorafgaand aan de operatie.</li>
	<li>Creëer een warme omgeving voor herstel en laat nat voedsel achter in de kooi voor de vroege voeding.</li>
	<li>Blijf bij de geopereerde dieren totdat ze zichzelf kunnen voeden.</li>
	<li>Houd de geopereerde muizen na de operatie alleen in hun individuele kooien.</li>
</ol>2. Anesthesie
<ol><li>Breng 1 uur voor de ingreep subcutaan 0,1 mg/kg buprenorfine aan op de zwangere moeder.</li>
	<li>Gebruik 5 ml/h isofluraan voor inductie en 2 ml/h continu tijdens de anesthesieprocedure.</li>
	<li>Controleer de bewegingen van de kinnen van de zwangere muizen.</li>
</ol>3. Laparotomie
<ol><li>Reinig het buikoppervlak met alcohol en povidon-jodium. Houd steriele omstandigheden gedurende de hele operatie.</li>
	<li>Voer een verticale incisie uit voor de laparotomie van zwangere moeders. Snijd alle lagen afzonderlijk.</li>
	<li>Identificeer baarmoederhoorns aan elke kant.</li>
	<li>Bepaal de kandidaat foetussen voor de operatie. OPMERKING: Werk niet op de foetussen die het dichtst bij de vagina liggen.</li>
	<li>Opereer op twee foetussen in elke baarmoederhoorn als er een even aantal foetussen aan elke kant zijn (4 meestal), en op 1 foetus in elke baarmoederhoorn als er een oneven aantal van de baarmoeder is (3 meestal).</li>
</ol>4. Tracheale occlusie
<ol><li>Gebruik 2,5x vergrotingsbril voor visualisatie.</li>
	<li>Plaats de baarmoederhoorn op een dwarse manier.</li>
	<li>Neem de pups, naar boven gericht, tussen twee vingers met behulp van de ogen van de pups en de staart als een gids om de foetus te positioneren.</li>
	<li>Oefen zachte druk uit op het hoofd van de pup om verlenging van het hoofd en dus visualisatie van de nek mogelijk te maken.</li>
	<li>Gebruik een 6.0 polypropyleen hechtdraad met een atraumatische naald om TO uit te voeren (Figuur 1). Houd de placenta aan de zijkant en ver van de in- en uitgangen van de naald.</li>
	<li>Steek de naald dwars door de zijkant van de baarmoeder, weg van de placenta door het 1/3rd voorste deel van de nek.</li>
	<li>Beweeg de naald voorzichtig tot de middellijn van de nek en richt deze naar het voorste deel en verlaat vervolgens de nek tussen de luchtpijp en tegenover de halsslagader en baarmoeder.</li>
	<li>Knoop de hechtdraad, zorg ervoor dat de integriteit van de membranen en de baarmoederwand behouden blijft en houd de navelstreng veilig tijdens het knopen.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61772/61772fig01.jpg"> Figuur 1: Tracheale occlusie. (A) De trans-uteriene hechting die door de nek gaat. (B) Schematische weergave van de structuren nadat de hechting door en voor de knoop gaat. Afkortingen: C = Halsslagader; J = Halsader; T =Luchtpijp; E = Slokdarm; V = Wervel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61772/61772fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
5. Buikwandsluiting
<ol><li>Vervang de baarmoederhoorn in de buik.</li>
	<li>Injecteer 2 ml warme steriele zoutoplossing in de buikholte voor sluiting.</li>
	<li>Plaats een lopende 5/0 polyglactine hechtdraad om de buikwand te sluiten en sluit de huid met een niet-lopende zijden hechtdraad.</li>
	<li>Breng intraperitoneaal 0,1 mg/kg buprenorfine aan voor analgesie en laat het herstel van de dam in een warme incubator toe.</li>
</ol>6. Oogst
<ol><li>Breng anesthesie aan op de zwangere moeder en oogst alle foetussen op E18,5 door middel van een keizersnede.</li>
	<li>Controleer de levensvatbaarheid van de foetussen door de bewegingen van de foetussen te bekijken.</li>
	<li>Gebruik ten minste twee verschillende technieken voor de euthanasie: koolstofdioxide-insufflatie en cervicale dislocatie.</li>
	<li>Verwijder de lichamen volgens de voorschriften van het veterinair laboratorium.</li>
	<li>Weeg alle foetussen.</li>
	<li>Voer een verticale incisie uit op de thorax voor thoracotomie om de longen te verwijderen.</li>
	<li>Ontleed de longen van embryo's en weeg ze om de totale verhouding tussen longen en lichaamsgewicht te berekenen (LBWR = (linkerlonggewicht + rechterlonggewicht)/lichaamsgewicht x100).</li>
</ol>7. Histologie
<ol><li>Bevries de weefsels in vloeibare stikstof, optimale snijtemperatuursamenstelling en droogijs.</li>
	<li>Snijd de monsters in secties van 10 μm met behulp van een cryostaat en monteer ze op met polylysine bedekte dia's.</li>
	<li>Bak de dia's 's nachts op 60 °C en bevlek de gebakken dia's met hematoxyline en eosine voordat u ze monteert voor beeldverwerving bij 10-20x vergroting met behulp van een breedveldmicroscoop.</li>
</ol>8. Weefselverwerking voor eiwit- en DNA-analyses
<ol><li>Bevries de ontlede foetale longen en homogeniseer ze in 300 μL radio-immuunrecipitatietestbuffer. Centrifugeer bij 4 °C gedurende 5 min bij 18.000 × g.</li>
	<li>Eiwit, DNA en RNA10,12extraheren en kwantificeren.</li>
</ol>

<ol><li>Wright, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+PaedSurg+Research+Collaboration.+Management+and+outcomes+of+gastrointestinal+congenital+anomalies+in+low%2C+middle+and+high+income+countries%3A+protocol+for+a+multicentre%2C+international%2C+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study.</a> BMJ Open. 9, 030452(2019).</li>
<li>Aydin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approach+for+prenatally+diagnosed+congenital+anomalies+that+requires+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Clinics+Journal+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery.</a> Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).</li>
<li>Nolan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemorrhage+after+on-ECMO+repair+of+CDH+is+equivalent+for+muscle+flap+and+prosthetic+patch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch.</a> Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).</li>
<li>Aydin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+diaphragmatic+hernia%3A+the+good%2C+the+bad%2C+and+the+tough%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough.</a> Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).</li>
<li>Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+congenital+diaphragmatic+hernia-associated+musculoskeletal+deformities%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities.</a> Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).</li>
<li>Aydın, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+primary+repair+is+not+enough%3A+a+comparison+of+synthetic+patch+and+muscle+flap+closure+in+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia.</a> Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).</li>
<li>Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+fetal+tracheal+ligation+prevents+the+pulmonary+hypoplasia+associated+with+fetal+nephrectomy%3A+Possible+application+for+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia.</a> Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).</li>
<li>Mudri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+tracheal+occlusion+on+Wnt+signaling+in+a+rabbit+model+of+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia.</a> Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).</li>
<li>Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+occlusion%3A+a+review+of+obstructing+fetal+lungs+to+make+them+grow+and+mature%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+C%2C+Seminars+in+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature.</a> American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA%2C+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li>
<li>Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+animal+models+to+human+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).</li>
<li>Varisco, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+reversal+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+ephrin+signaling+following+tracheal+occlusion+in+rabbit+model+of+congenital+diaphragmatic+hernia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia.</a> Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Deze methode beschrijft een chirurgische procedure van foetale tracheale occlusie bij muizen en de impact ervan op de longontwikkeling. Er zijn enkele kritieke stappen in het protocol die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd voor een succesvolle TO. De warmte van het platform waarop de operatie plaatsvindt en de zoutoplossing die in de buikholte wordt geïntroduceerd, is cruciaal voor de progressie van de zwangerschap. Bovendien moet een lichte druk worden uitgeoefend op het hoofd van de pups om blootstelling van de nek te...

Congenitale diafragmatische hernia (CDH) komt voor bij 1:2500 zwangerschappen en resulteert in pulmonale hypoplasie en neonatale pulmonale hypertensie1,2,3,4,5,6. Foetale tracheale occlusie (TO) is een gevestigde prenatale therapie bij ernstige CDH-patiënten waarbij fetoscopie nodig is in de 26-30e zwangerschapsweek waarin een ballon net boven de carina wordt geplaatst en vervolgens in de 32e zwangerschapsweek wordt verwijderd. Deze tijdelijke TO induceert foetale longgroei en verbetert de overleving. Congenitaal High Airway Obstruction Syndrome is een dodelijke aandoening geassocieerd met longhyperplasie, die chirurgen inspireerde om kunstmatige occlusie van de luchtpijp uit te voeren om het vasthouden van het uitgescheiden epitheelvocht te bevorderen. Deze occlusie verhoogde de lichtgevende druk en veroorzaakte longgroei7. De occlusie moet echter worden omgekeerd om epitheliale celrijping mogelijk te maken.
Verschillende diermodellen van CDH en TO - schapen, konijnen, ratten en muizen - zijn ontwikkeld om de pathofysiologie van CDH en TO te begrijpen. Ze hebben allemaal hun eigen voor- en nadelen, zoals de moeilijkheidsgraad van de techniek, de grootte van het dier, de kosten, hoge sterftecijfers en de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Hoewel de chirurgische techniek die wordt gebruikt voor het schapenmodel erg lijkt op die bij mensen en kan worden omgekeerd, zijn de belangrijkste nadelen van dit model de kosten van het dier, de lange zwangerschapsperiode en het beperkte aantal operaties mogelijk. Het konijnenmodel heeft een kortere draagtijd en is goedkoper dan het schapenmodel. Het konijnenmodel is echter onomkeerbaar8,9. Het muriene model heeft de laagste kosten, het hoogste aantal foetussen per zwangerschap, het best gekarakteriseerde genoom en algemeen beschikbare hulpmiddelen voor cellulaire en moleculaire analyses. Een belangrijk nadeel is echter het gebrek aan reversibiliteit van de TO, waardoor volledig begrip van de impact van TO wordt voorkomen. Hierin wordt een methode gepresenteerd die alle voordelen van de eerder genoemde modellen combineert en een eenvoudig, potentieel omkeerbaar en minimaal invasief knaagdier TO-model creëert.

<table><tbody><tr><td>Buprenorfine&nbsp;</td><td>Par Pharmaceutical</td><td>NDC 42023-179-05</td><td>Voor regionale anesthesie</td></tr><tr><td>Isofluraan&nbsp;</td><td>&nbsp;Halocarbon Life Sciences</td><td>NDC 66794-017-25</td><td>Voor algemene anesthesie</td></tr><tr><td>Vergrootglas</td><td>USA Medical-Surgical</td><td>SLR-250LBLK</td><td>Minimaal 2,5x</td></tr><tr><td>Nikon 90i microscoop</td><td>Nikon</td><td>3417</td><td>Gemotoriseerde fluorescentie</td></tr><tr><td>Nucleospin weefselkit&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel, Düren, Duitsland</td><td>740952.5</td><td>DNA-isolatie</td></tr><tr><td>Pierce BCA-eiwitbepalingskit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher, IL, USA</td><td>23225</td><td>Eiwitkwantificering</td></tr><tr><td>Polyglactin-naad</td><td>Ethicon</td><td>VCP451H</td><td>4-0, 24 mm, snijdend</td></tr><tr><td>Polylysine-dia's&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>48382-117</td><td>Microscoop-adhesiedia's</td></tr><tr><td>Polypropyleen-naad</td><td>Ethicon</td><td>Y432H</td><td>6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint</td></tr><tr><td>RIPA-buffer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Missouri, USA</td><td>R0278-50ml</td><td>Eiwitisolatie</td></tr><tr><td>Zijdena naad</td><td>Ethicon</td><td>VCP682G</td><td>4-0, 24 mm, snijdend</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15596026</td><td>RNA-isolatie</td></tr></tbody></table>

transuterine foetale tracheale occlusie model in muizen

Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice

Foetale tracheale occlusie (TO), een gevestigde behandelingsmodaliteit, bevordert foetale longgroei en overleving bij ernstige aangeboren diafragmatische hernia (CDH). Na TO verhoogt het vasthouden van de afgescheiden epitheelvloeistof de lichtdruk en induceert het longgroei. Verschillende diermodellen zijn gedefinieerd om de pathofysiologie van CDH en TO te begrijpen. Ze hebben allemaal hun eigen voor- en nadelen, zoals de moeilijkheidsgraad van de techniek, de grootte van het dier, de kosten, hoge sterftecijfers en de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Hierin wordt een nieuw trans-uterien model van muriene foetale TO beschreven. Zwangere muizen werden verdoofd en de baarmoeder werd blootgesteld via een laparotomie in de middellijn. De luchtpijp van geselecteerde foetussen werd geligeerd met een enkele trans-uteriene hechting achter de luchtpijp, een halsslagader en een halsslagader. De dam werd gesloten en mocht herstellen. Foetussen werden vlak voor de bevalling verzameld. Long-lichaamsgewichtverhouding bij TO-foetussen was hoger dan die bij controlefoees. Dit model biedt onderzoekers een nieuw hulpmiddel om de impact van zowel TO als verhoogde luminale druk op de longontwikkeling te bestuderen.

Deze studie onderzocht 37 foetussen: 20 (54,1%) vs. 17 (45,9%) als controle. Omdat de luchtpijp niet kon worden afgesloten bij 4 foetussen in de TO-groep, werden ze uitgesloten van het onderzoek. Er was geen significant verschil in mortaliteit in beide groepen: 4 foetussen (25%) in de TO-groep en 2 foetussen (12%) in de controlegroep (p=0,334, odds ratio (OR) 2,5, 95% betrouwbaarheidsinterval (CI) 0,39-16,05). Het gemiddelde lichaamsgewicht, het longgewicht en de verhouding tussen longen ...

Verschillende diermodellen van congenitale diafragmatische hernia en foetale tracheale occlusie bieden voor- en nadelen met betrekking tot ethische kwesties, kosten, chirurgische moeilijkheidsgraad, grootte, overlevingspercentages en beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen. Dit model biedt een nieuw hulpmiddel om de impact van zowel tracheale occlusie als verhoogde luminale druk op de longontwikkeling te bestuderen.

Transuterine foetale tracheale occlusie model in muizen

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). ...

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn omkeerbaarheid, verlaging van de kosten van de dieren en onderhoud en een kortere zwangerschapsperiode. Bovendien wordt de diersterfte verminderd omdat hysterectomie niet nodig is. En er zijn bredere mogelijkheden voor genetisch onderzoek.Deze techniek kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de pathofysiologie van de aangeboren diafragmatische hernia. Het kan ook worden toegepast om andere ziekten in de long te begrijpen, zoals koeien en longhypoplasie. Begin met de muizen de volgende dag van 18:00 tot 09:00 uur in dezelfde kooi te laten paren.Om E0 te bepalen, observeer de vaginale plug met een homogene, buitenste zone bevestigd aan de vaginale wand en een binnenste zone die vezelig is en voeg wat spermatozoa toe die verstrengelde massa's vormen gemengd met de vezels van het plugmateriaal. Registreer het gewicht van de muizen op het moment van de paring en op E10 om een voortdurende zwangerschap te garanderen en voer de operatie uit op E16.5. Steriliseer de instrumenten die tijdens de operatie zullen worden gebruikt.Verwarm het operatieplatform voor op 24 graden Celsius en bereid warme zoutoplossing voor voorafgaand aan de operatie. Creëer een warme omgeving voor herstel en laat nat voedsel achter in de kooi voor de vroege voeding. Reinig het buikoppervlak met alcohol en povidonjodium en behoud steriele omstandigheden tijdens de operatie.Voer een verticale incisie uit voor de laparotomie van zwangere moeders en snijd alle lagen afzonderlijk. Identificeer de baarmoederhoorns aan elke kant en bepaal de kandidaat-foetussen voor de operatie. Opereren op twee foetussen in elke baarmoederhoorn als er een even aantal foetussen aan elke kant is.En op één foetus in elke baarmoederhoorn als er een oneven getal is. Met behulp van 2x vergrotingsbril voor visualisatie, plaats de baarmoederhoorn op een transversale manier. Plaats de jongen naar boven tussen twee vingers met behulp van de ogen en de staart als leidraad.Oefen zachte druk uit op het hoofd van de pup om verlenging van het hoofd en visualisatie van de nek mogelijk te maken. Voer tracheale occlusie of TO uit met behulp van een atraumatische naald en een 6 bij 0 polypropyleen hechtdraad. Houd de placenta aan de zijkant en ver van de in- en uitgangen van de naald.Steek de naald dwars door de zijkant van de baarmoeder, weg van de placenta door het voorste deel van de nek. Beweeg de naald vervolgens voorzichtig naar de middellijn van de nek. Richt het naar het voorste deel.Verlaat vervolgens de nek tussen de luchtpijp en tegenover de halsslagader en baarmoeder. Knoop de hechtdraad en zorg ervoor dat de integriteit van de membranen en de baarmoederwand behouden blijft. Vervang de baarmoederhoorn in de buik en injecteer twee milliliter warme steriele zoutoplossing in de buikholte voor sluiting.Plaats een lopende 5 bij 0 polyglactine hechtdraad om de buikwand te sluiten. En sluit de huid met een niet-lopende zijden hechtdraad. Breng intraperitoneaal 0,1 microgram buprenorfine aan voor analgesie en laat het moederwater herstellen in een warme incubator.Merk op dat het geopereerde dier zichzelf kan voeden en alleen in zijn individuele kooi kan houden. Oogst alle foetussen per E18.5 per ceasareaanse sectie en controleer hun levensvatbaarheid door hun bewegingen te bekijken. Weeg alle foetussen.Voer een verticale incisie uit op de thorax voor een thoracotomie om de longen te ontleden. En weeg ze om de totale verhouding tussen longen en lichaamsgewicht te berekenen. Vries het weefsel in vloeibare stikstof, optimale snijtemperatuurverbinding en droogijs.Snijd de monsters in secties van 10 micrometer met behulp van een cryostaat en monteer ze op met polylysine bedekte dia's. Bak de dia's een nacht op 60 graden Celsius en bevlek de gebakken dia's met hematoxyline en eosine. Afbeelding van de dia's bij 10 tot 20x vergroting, met behulp van een widefield microscoop.Voor eiwit- en DNA-analyses, snap bevriezen het weefsel en homogeniseerde het in 300 microliters radio-immuunrecipitatie assay buffer. Centrifugeer gedurende vijf minuten op 18, 000 x g en 4 graden Celsius. Vervolgens eiwitten, DNA en RNA extraheren en kwantificeren.Het gemiddelde lichaamsgewicht, het longgewicht en de LBWR waren hoger in de TO-groep dan in de controlegroep. Long-DNA-hoeveelheden en de DNA-eiwitverhouding waren hoger in de TO-groep. Er werd geen verschil waargenomen in long-RNA en de eiwithoeveelheden waren lager in de TO-groep dan in de controlegroep.Histologische analyses van de E18.5-controlelongen toonden het late of vroege sacculaire stadium van longontwikkeling aan met zich ontwikkelende luchtruimten en verdikt interstitium tussen epitheeloppervlakken. De longen in de TO-groep hadden centrale en distale luchtruimen verwijd met subjectief hogere aantallen kernen. Bij het proberen van dit protocol, We fixeren de hechtingen op een manier dat de ogen van de foetus zichtbaar zijn en de nek wordt verlengd, zodat de naald de aangepaste structuren niet verstoort.Het verwijderen van de structuren naar de wedergeboorte van de foetus in de nitrilventilator en knock-outmodellen van CDH zullen de toekomstige toepassingen van deze techniek zijn.

transuterine-fetal-tracheal-occlusion-model-in-mice

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video laat zien en vergelijkt twee experimentele modellen te bestuderen van de ontwikkeling van obliteratieve luchtwegaandoeningen (OAD) in muizen, de heterotope en orthotope tracheale transplantatie model.

Heterotope en orthotope Tracheale transplantatie in Muizen worden gebruikt als modellen voor de ontwikkeling van de obliterans luchtwegaandoeningen Study

Dwars aorta vernauwing (TAC) in de muis is een veel gebruikte experimenteel model om de mechanismen die ten grondslag liggen cardiale hypertrofie en hartfalen ontwikkeling te bestuderen. Hier beschrijven we de procedures aan vernauwen de aorta naar een reproduceerbare mate van cardiale hypertrofie in muizen te creëren.

Dwars Aorta Vernauwing in Muizen

Transgene muizen zijn zeer nuttig in het toeschrijven van een fysiologische functie van genen. Als zodanig onderzoek in het algemeen, en functionele studies van de luchtwegen, in het bijzonder, hebben ondergaan een opmerkelijke verschuiving in de richting van muismodellen. Hier voorzien...

In vitro metingen van Tracheale Vernauwing bij muizen

We hebben een nieuwe chirurgische aanpak voor intratracheale toediening van bioactieve stoffen in de muis foetus. De levering route is efficiënter in het foetale richten muizenlongen dan de gebruikelijke intra-amniotische injectie. Deze procedure is tot op heden niet beschreven in een muismodel.

A Novel chirurgische benadering voor intratracheale toediening van bioactieve stoffen in een Foetale Muis Model

This video demonstrates the transuterine tracheal occlusion procedure of a mouse fetus in a pregnant mouse. This model can be used to study the impact of occluded trachea on lung development.

Modeling Transuterine Fetal Tracheal Occlusion in Murine Model: A Surgical Procedure for Ligation of the Fetal Trachea Within a Pregnant Mouse

We hebben een eenvoudige, betrouwbare en relatief goedkope methode voor endotracheale intubatie bij muizen via directe laryngoscopie behulp van een otoscoop met een 2,0 mm speculum ontwikkeld. Deze techniek is atraumatische en kan worden gebruikt voor herhaalde metingen in chronische experimenten. We vinden het superieur aan tracheostomie of eerder gerapporteerde niet-chirurgische technieken.

Luchtpijpintubatie in Muizen<em&gt; Via</em&gt; Directe laryngoscopie behulp van een otoscoop

Hier presenteren we een protocol van Transverse aorta vernauwing (TAC) via een laterale Thoracotomie. Deze techniek is een minimaal invasieve, gesloten borst chirurgische ingreep gericht om overbelasting van de druk en hartfalen in muizen met behulp van TAC laboratorium standaardinstellingen te simuleren.

Een gesloten-borst-Model voor het opwekken van transversale aorta vernauwing in muizen

Graft stenose vormt een kritische obstakel in weefsel ontworpen airway vervanging. Om te onderzoeken cellulaire mechanismen ten grondslag liggen aan stenose, gebruiken we een lymfkliertest model van weefsel ontworpen tracheale vervanging met geplaatste beenmerg mononucleaire cellen (BM-MNC). Hier, detail we onze protocol, met inbegrip van de steiger productie, BM-MNC isolatie, graft zaaien en implantatie.

Zaaien en implantatie van een Biosynthetic weefsel-engineered tracheale Graft in een muismodel

Het doel van dit artikel is het beschrijven van een verfijnde methode van intubatie van de laboratoriummuis. De methode is niet-invasief en daarom ideaal voor studies die seriële controle van de ademhalingsfunctie en/of instillatie van behandelingen in de long vereisen.

Herhaalde Orotracheale intubatie bij muizen

Een muischirurgisch model om reperfusie (IR) -letsel in de linkerlong te creëren met behoud van ventilatie en het vermijden van hypoxie.

Een muismodel van orotracheale intubatie en beademde longischemie reperfusiechirurgie

Het muizen intrapulmonale tracheale transplantatie (IPTT) model is waardevol voor het bestuderen van obliteratieve luchtwegaandoeningen (OAD) na longtransplantatie. Het biedt inzicht in longspecifiek immunologisch en angiogeen gedrag bij luchtwegvernietiging na allotransplantatie met een hoge reproduceerbaarheid. Hier beschrijven we de IPTT-procedure en de verwachte resultaten.

Intrapulmonale tracheale transplantatie bij muizen: een model voor het onderzoeken van obliteratieve luchtwegaandoeningen na longtransplantatie

Leer de transuterine foetale tracheale occlusietechniek in muizen voor onderzoek naar congenitale hernia diafragmatica en longontwikkeling. Deze omkeerbare methode vermindert sterfte en kosten.

Transuterine foetale tracheale occlusie model in muizen

Meer video's verkennen