Name: Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: Leer de productie en zuivering van recombinant menselijk IgG-GFP-fusie-eiwitten in Nicotiana benthamiana. Deze methode maakt visualisatie tijdens chromatografie mogelijk voor onderwijs en biotechnologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Maria Pia DiPalma voor het bewerken van de video. We danken ook het Office of Educational Outreach and Student Services aan de Arizona State University voor hun genereuze publicatie vergoeding bijstand. Onderzoek voor dit protocol werd ondersteund door de School of Life Sciences, Arizona State University.

1. Cultiveren N. benthamiana planten
<ol><li>Plaats grond turf pellets op een lade en giet eerder gekookt, nog warm (~ 40-45 °C), water over de turf pellets voor volledige expansie. Na pellets zijn volledig uitgebreid, plaats 2-3 N. benthamiana zaden op elke turf pellet met behulp van pincet.</li>
	<li>Giet ongeveer 0,5 in water om de bodem van de lade te bedekken. Label de lade met de opzaaidatum. Ga door met het water van de zaailingen dagelijks met de juiste hoeveelheden kunstmest. Meststof (water-oplosbare all-purpose plant food) concentratie is over het algemeen 2,5-2,8 g/L.</li>
	<li>Bedek de lade met een humidome top wanneer geplaatst in de groeikamer. Houd de ingezaaide turfkorrels in de groeikamer op 23-25 °C, met een fotoperiode van 16 uur en een relatieve luchtvochtigheid van 60%.</li>
	<li>Na een week, verwijder extra planten verlaten elke pellet met slechts een zaailing.</li>
	<li>Wanneer de planten 2-3 weken oud zijn, breng elke turfpellet over naar een individuele pot met vochtbeheersingsgrond. Deze demonstratie gebruikte Miracle-Gro vochtcontrole potgrond.</li>
	<li>Water dagelijks met 1 g/L meststof. Laat de grond nooit helemaal droog. Planten zijn klaar voor infiltratie wanneer ze 5-6 weken oud zijn.</li>
</ol>2. Voorbereiding van agrobacterium tumefaciens voor infiltratie
OPMERKING: GFP-IgG fusieconstructies kunnen worden verkregen zoals beschreven in dit artikel31. Het asGFP-gen werd verkregen en plant-geoptimaliseerd uit deze studie45. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd naast een Bunsen-brander, en basisaseptische technieken moeten worden toegepast om besmetting te voorkomen.
<ol><li>Streep A. tumefaciens EHA105 herbergen bonen gele dwerg virus (BeYDV)19 plant expressie vector voor elke constructie (asGFP-IgG, GFP-IgG, lichtketting) uit een glycerolvoorraad op LB agar (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g gistextract, 15 g/L agar, 50 μg/mL kanamycine) plaat.</li>
	<li>Kweek één dag in een 30 °C staande couveuse. Isoleer een enkele kolonie voor verificatie door standaard kolonie scherm PCR protocol.</li>
	<li>Gebruik geverifieerde kolonie voor elke constructie. Vul conische buis met 10 mL LB-media (10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g gistextract, 50 μg/mL). Voeg vervolgens 10 μL van 100 μg/mL kanamycine toe. Voeg 10 μL 2,5 μg/mL rifampicin toe om E. coli besmetting te voorkomen. Incubeer bij 30°C en 120-150 tpm 's nachts.</li>
	<li>De volgende dag, als de Agrobacterium cultuur wordt gegroeid tot OD600 = 0,6-0,9, kan het worden gebruikt voor infiltratie. Als het is overwoekerd (OD600 > 1), moet 1-2 mL worden overgebracht naar verse LB met antibiotica en worden geteeld tot de vereiste OD600. Afhankelijk van de concentratie van de oorspronkelijke cultuur kan het mogelijk twee dagen duren om te groeien tot OD600 = 0,6-0,9.</li>
	<li>Eenmaal op de juiste OD600, plaats de culturen in een centrifuge, en pellet de bacteriën door centrifugatie op 4.500 x g gedurende 20 min, kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Decanteer supernatant van beide monsters, en vervolgens resuspend elke pellet in 1x infiltratie buffer (10 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic zuur, 10 mM magnesiumsulfaat, aangepast aan pH 5.5 met KOH) om de definitieve OD600 = 0,4. Dit moet ongeveer 15-45 mL infiltratie buffer, afhankelijk van de oorspronkelijke cultuurdichtheid. Combineer gelijke volumes van elke IgG fusion construct met de lichtkettingconstructie om de uiteindelijke OD600 = 0,2 per constructie in elke buis te krijgen.</li>
</ol>3. Naaldloze spuit agroinfiltratie
<ol><li>Neem een rechtgetrokken paperclip en 5-6-weken oude N. benthamiana planten vanaf stap 1. Maak met behulp van de scherpe rand van de paperclip een kleine punctie in de eerste opperhuidlaag van het blad op het adaxiale oppervlak. Vermijd puncturing het helemaal door. LET OP: De onderste bladeren zijn gemakkelijker voor infiltratie, terwijl de bladeren aan de bovenkant van de plant zijn harder. Over het algemeen is de expressie van recombinante eiwitten het hoogst in de bladeren in het midden van een plant, en deze bladeren worden ook minder necrotisch.</li>
	<li>Vul een spuit van 1 mL, zonder naald, met de voorbereide Agrobacterium-oplossing vanaf stap 2. Bedek het gat gemaakt in de vorige stap met het einde van de spuit en langzaam duwen om de bacteriën te injecteren in het blad, terwijl het toepassen van zachte tegendruk van achter het blad. Let op het blad donkerder als de oplossing wordt geïnjecteerd zonder het toepassen van te veel druk op de spuit.</li>
	<li>Probeer het grootste deel van het blad gebied te infiltreren op een maximum van 3-4 keer – overmatige bladschade kan belemmeren eiwitopbrengst. Het geïnfiltreerde plantenblad zal meestal donker lijken vanuit het onderste zicht. OPMERKING: Deze bacteriële oplossing moet voldoende zijn voor ten minste 3-4 planten per constructie. Autoclave eventuele resterende bacteriële oplossing voor het weggooien.</li>
</ol>4. Groeien en observeren van de geïnfiltreerde N. benthamiana 
<ol><li>Plaats geïnfiltreerde planten terug in de groeikamer en blijf dagelijks water geven.</li>
	<li>Observeer de bladeren voor chlorose en necrose in geïnfiltreerde gebieden. Observeer planten voor GFP fluorescentie (als GFP aanwezig is) onder een lange en korte golf UV-lamp.</li>
	<li>Dag 4-5 toont de hoogste fluorescentie van beide GFP constructies in de bladeren. Oogst alle bladeren op 4-5 dpi (dagen na infiltratie) en weeg het totale bladmateriaal.</li>
	<li>Gebruik het onmiddellijk voor downstream verwerking of opslaan op -80 °C tot klaar voor gebruik.</li>
</ol>5. Eiwitextractie
<ol><li>Houd buffers en blender cups op ijs of op 4 °C voor gebruik.</li>
	<li>Bereid 2-3 mL ijskoude extractiebuffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 met HCl) per 1 g plantaardig materiaal. Voeg vlak voor de extractiebuffer 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) uit voorraad (100 mM) en 50 mM natriumascorbaat toe aan de extractiebuffer.</li>
	<li>Plaats plantaardig weefsel van stap 4 in de gepekwicht blender cup. Voeg een gemeten hoeveelheid gekoelde extractiebuffer toe aan de blenderbeker (zoals aangegeven in stap 5.2). Leg de blenderbeker op de blender. Neem een voorgesneden vel parafilm en strek het over de bovenkant van de blender cup. Meng tot homogeniteit met intervallen van 20 seconden, goed roeren tussen de mengcycli als dat nodig is.</li>
	<li>Breng gemengd materiaal over naar een beker. Voeg een roerstaaf toe en roer 30 minuten door 4 °C om de oplosbaarheid van eiwitten te verbeteren en neerslag van vaste stoffen mogelijk te maken.</li>
	<li>Plaats 2 lagen Miracloth over een schone beker op ijs en giet het extract erdoorheen om grote bladresten te verwijderen. Nadat al het extract is gegoten, vouw de Miracloth om het restblad extract te knijpen. Het extract moet donkergroen lijken zonder zichtbare deeltjes.</li>
	<li>Breng 50 μL van dit monster over naar een nieuwe buis van 1,5 mL en label "totaal extract" voor latere analyse. Breng het extract over in centrifugebuizen. Centrifugeren de rest van het plantenextract op 16.000 x g gedurende 20 min, 4 °C en breng het supernatant over op een conische buis.</li>
	<li>Filter het oplosbare extract met een spuitfilter van 50 mL en spuitglasvezelfilter (0,75 μm).</li>
	<li>Verzamel 50 μL van een monster na centrifugatie, label "oplosbaar extract" voor latere analyse.</li>
</ol>6. Eiwit G kolom chromatografie procedure
OPMERKING: Het protocol hier beschreven is voor zwaartekracht-flow chromatografie met behulp van Pierce Protein G agarose hars. Als u een andere hars gebruikt, raadpleegt u de instructies van de fabrikant voor aanpassingen. Laat de hars nooit droog lopen en voorkom dat alle vloeistof uitmondt. Recapituleren de uitlaat als dat nodig is.
<ol><li>Stel een polypropyleenkolom in met een monster van 20 mL.</li>
	<li>Schat de hoeveelheid drijfmest die nodig is, afhankelijk van het doelimmunlinetype en de affiniteit met de hars. Over het algemeen is 3 mL van totale drijfmest met 1,5 mL bedvolume voldoende voor de zuivering van meerdere milligram Ab.</li>
	<li>Giet voorzichtig de vereiste hoeveelheid opgesuspend drijfmest in de afgetopte kolom. Open de kolomuitlaat vanaf de onderkant van de kolom en laat deze leeglopen totdat het grootste deel van de buffer is verdwenen.</li>
	<li>Giet onmiddellijk 10 mL wasbuffer 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 met HCl) bovenop. Laat het uitlekken en herhaal deze wasstap 2x.</li>
	<li>Pas het gefilterde monster van stap 5 op de kolom toe en verzamel de doorstroom, 50 μL stroomdoor voor latere analyses. Sla de rest van de flowthrough op voor het geval de Ab zich niet aan de hars bindt. OPMERKING: Het opnieuw toepassen van de doorstroom naar een nieuwe kolom resulteert meestal niet in een goede opbrengst; daarom wordt geadviseerd om te beginnen met nieuw bladmateriaal.</li>
	<li>Was de hars twee maal met 10 mL 1x PBS om niet-specifieke binding te verminderen. Indien gewenst, aliquot 50 μL van wassen als de buffer afvoeren door de kolom om te controleren of het doel Ab niet is geëuterd met een wasbuffer.</li>
	<li>Stel vijf buizen op en label ze met 125 μL steriele 1 M Tris-HCl bij pH 8. Dit is om de Abs te neutraliseren in de zure elutie buffer om mogelijke structurele veranderingen te voorkomen. U ook 30 μL van 2 M Tris-basis toevoegen om een minder verdund monster te krijgen. LET OP: Tijdens elutie kan UV-licht worden gebruikt voor visualisatie. Dit hoeft niet te worden gedaan voor de duur van de elutie. Als UV wordt gebruikt, moet u de juiste BESCHERMINGsmiddelen dragen om schade aan ogen en huid te voorkomen. Een UV-licht hoeft niet te worden gebruikt tijdens de elutiestap.</li>
	<li>Elute de Abs door het toepassen van 5 mL elutie buffer (100 mM glycine, pH 2.5 met HCl) op de kolom en verzamel 1 mL fracties op elke aangewezen buis van de vorige stap.</li>
	<li>Regeneratie van de kolom onmiddellijk door 20 mL wasbuffer aan te brengen, gevolgd door 10 mL wasbuffer. Zorg ervoor dat de hars langere tijd niet in een zure omgeving wordt achtergelaten. Elutions moeten fluorescerend lijken, vaak wordt de hoogste fluorescentie gezien in de tweede elutie, maar kan variëren van extractie tot extractie.</li>
	<li>Voor opslag, was de hars met 10 mL van 20% ethanol in PBS en laat het halverwege uitlekken. Recapituleren de top, dan de onderkant van de kolom, en rechtop te houden op 4 °C. OPMERKING: Over het algemeen kunnen eiwit G-harsen tot 10 keer worden hergebruikt zonder significant verlies van efficiëntie. Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant voor specifieke details.</li>
	<li>Bepaal de Ab-concentratie met behulp van een spectrofotometer door absorptie op 280 nm te meten, met behulp van de elutiebuffer als blanco. Bewaar de eluates in -80 °C en aliquot 50 μL van elke fractie op een aparte buis voor verdere analyse.</li>
</ol>7. SDS-PAGINA voor GFP-Ig fusiedetectie
<ol><li>Maak alle voorbeelden voor het instellen van de SDS-PAGINA.<ol>
<li>Voeg 4 μL monsterbuffer toe (6x verminderende monsterbuffer: 3,0 mL glycerol, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 mL van 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg bromofolblauw); (6x niet-reducerende monsterbuffer: 3,0 mL glycerol, 1 g SDS, 7 mL van 4x Tris (pH 6.8) 0,5 M, 1,2 mg bromofenolblauw) tot 20 μL van elk monster (totaal extract, oplosbaar extract, flowthrough, wash, all elutions fractie) voor analyse. Zorg ervoor dat buisdoppen stevig worden vastgemaakt.</li>
		<li>Behandel alleen het verminderen van monsters gedurende 5 minuten in een kokend waterbad, en zet vervolgens monsters gedurende 5 minuten op ijs. Spin monsters in een microcentrifuge voor ~ 5 s en laad 20 μL van elk monster in de volgorde van de collectie in de gelputten. Laad 3 μL eiwitladder in een aparte put.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer de SDS-PAGE gel uit op een constante 100 V op de gewenste eiwitbandscheiding; het duurt ongeveer 1,5 uur. Controleer de ladder als een indicator van eiwitscheiding.</li>
	<li>Visualiseer de gel onder de UV om GFP-fluorescentie te observeren.</li>
	<li>Bevlek desgewenst de gel met Coomassie-vlek om het totale eiwit in elk monster te beoordelen. U ook westerse vlekken uitvoeren om doeleiwit te evalueren met behulp van specifieke Abs. OPMERKING: Zowel Coomassie kleuring als westelijke vlek kunnen worden uitgevoerd door de standaardprotocollen47,48tevolgen.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol kan worden gebruikt voor de visuele verificatie van alle recombinant Ab of recombinant eiwit geproduceerd in N. benthamiana planten, met inbegrip van die vereisen tijdelijke blootstelling aan zure omgevingen voor kolom zuivering doeleinden42,43,44. Bovendien kan de fusie van asGFP naar andere eiwitten in verschillende expressiesystemen een nuttig hulpmiddel zijn voor experimentele visualisatie en onderwijs....

Industrie rapporten geven aan dat dertien van de twintig meest brutowinst drugs in de Verenigde Staten waren biologische (eiwit-gebaseerde geneesmiddelen), waarvan negen waren antilichamen. Vanaf 2019 waren er meer dan 570 antilichaam (Ab) therapieën in verschillende klinische ontwikkelingsfasen1,2,3. De huidige wereldwijde ab-omzet bedraagt meer dan 100 miljard USD en de monoklonale ab (mAb) therapeutische markt zal naar verwachting tot 300 miljard USD genereren in 20251,4. Met zo'n hoge vraag en verwachte stijgingen van de inkomsten, onderzoekers hebben gewerkt aan manieren om Ab therapeutics te produceren op een steeds grotere schaal, met een hogere kwaliteit en lagere kosten te ontwikkelen. Plantaardige expressiesystemen hebben verschillende voordelen ten opzichte van traditionele zoogdiercellijnen voor de betaalbare en grootschalige productie van Ab therapeutics5,6. Voor de productie van eiwittherapeutisch in planten ("moleculair pharming") zijn geen dure bioreactoren of celkweekfaciliteiten nodig, net als traditionele zoogdiercelkweektechnieken7,8. Planten kunnen geen menselijke ziekteverwekkers oplopen, waardoor potentiële besmetting tot een minimalisering wordtgeminimaliseerd 9. Zowel voorbijgaande als transgene plantaardige eiwitexpressie kan worden gebruikt als goedkopere alternatieven voor zoogdier- of bacteriële productiesystemen10. Hoewel transgene planten de voorkeur hebben voor de productie van gewassen, kan recombinante eiwitproductie met behulp van deze methode weken tot maanden duren. Vooruitgang in tijdelijke expressie met behulp van virale vectoren door middel van spuit of vacuüm agroinfiltratie zorgen voor een kleine en grootschalige productie, respectievelijk, van het gewenste eiwit in de dagen11,12,13,14. De productie van mAbs tegen ebola, Dengue en Zika, en tal van andere recombinante eiwitten, zijn snel en efficiënt geproduceerd en gezuiverd met behulp van tijdelijke expressie in N. benthamiana planten15,16,17,18,19. Deze omstandigheden maken tijdelijke plantaardige expressie een aantrekkelijke optie voor het ontwikkelen van meerdere Ab therapeutica en de methoden die in dit protocol20 wordenaangetoond .
MAb's van de eerste generatie waren van murineafscheiding, wat resulteerde in niet-specifieke immunogeniciteit bij gebruik in menselijke proeven21. Na verloop van tijd, chimeric, gehumaniseerd, en uiteindelijk, volledig menselijke Abs werden geproduceerd om immunogeniciteit veroorzaakt door Ab therapeutica te verminderen. Helaas veroorzaken sommige van deze Abs nog steeds gastheer immunogeniciteit als gevolg van verschillen in glycosylation21. Ontwikkelingen in de installatietechniek hebben gezorgd voor de wijziging van Ab glycans, wat essentieel is omdat de stabiliteit en functie van een Ab aanzienlijk kunnen worden beïnvloed door zijn glycosylation staat22. De vooruitgang heeft de productie in plantaardige systemen van hoog-niveauuitdrukking van gehumaniseerde mAbs mogelijk gemaakt, die menselijke glycanen en resulterend de gewenste biologische eigenschappen van een massa-geproduceerde menselijk farmaceutisch19,21bevatten .
Naast recombinant Abs, Ab fusie moleculen (Ab fusies) zijn onderzocht voor verschillende doeleinden in de afgelopen decennia. Ab fusies bestaan vaak uit een Ab of Ab fragment gefuseerd tot een molecuul of eiwit en zijn ontworpen om reacties uit te lokken van immuun effector cellen23. Deze moleculen zijn gemaakt als potentiële therapeutische interventies voor de behandeling van verschillende pathologieën zoals kanker en auto-immuunziekten24,25,26,27. Recombinant immune complexs (RICs) zijn een andere klasse van Ab fusies die zijn gebruikt als vaccin kandidaten28. RICs maken gebruik van het vermogen van het immuunsysteem om de Fc-regio's van Ab-fusies te herkennen en blijken de immunogeniciteit te verbeteren in combinatie met andere vaccinplatforms29,30,31.
Green Fluorescent Protein (GFP) is een bioluminescent eiwit afkomstig van de kwal Aequorea Victoria, die groen licht uitzendt wanneer opgewonden door ultraviolet licht32,33. In de loop der jaren is het gebruik van GFP als visuele marker van genexpressie uitgebreid van expressie in Escherichia coli tot tal van eiwitexpressiesystemen, waaronder N. benthamiana-planten 34,35,36,37,38. Zichtbare markers, zoals GFP, hebben overvloedige implicaties in het onderwijzen en leren van wetenschappelijke concepten. Tal van instapstudenten beschrijven moeilijkheden bij het begrijpen van wetenschappelijke concepten wanneer het idee dat wordt onderwezen niet met het blote oog zichtbaar is, zoals de concepten van moleculaire biologie en aanverwante gebieden39. Visuele markers, zoals GFP, kunnen zo bijdragen aan de verwerking van informatie met betrekking tot de wetenschappelijke processen en kunnen helpen de moeilijkheden te verminderen die studenten rapporteren bij het leren van tal van wetenschappelijke concepten.
Hoewel GFP vaak wordt gebruikt als een marker om gen en expressie in vivoaan te geven, is het moeilijk om het te visualiseren in de downstream processen bij het gebruik van zure omstandigheden. Deze omstandigheid is voornamelijk omdat GFP zijn structuur en resulterende fluorescentie niet behoudt bij een lage pH40. Tijdelijke zure omgevingen zijn vaak nodig in verschillende zuiveringsprocessen, zoals eiwit G, eiwit A, en eiwit L chromatografie, vaak gebruikt voor Ab zuivering41,42,43,44. GFP-mutanten zijn gebruikt om fluorescentie onder zure omstandigheden45,46te behouden .
Hierin beschrijven we een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinante IgG fusie-eiwitten in N. benthamiana planten. We produceerden traditionele GFP gefuseerd naar de N-terminus van een gehumaniseerde IgG zware keten, het creëren van een GFP-IgG fusie. Tegelijkertijd ontwikkelden we de fusie van een plant codon-geoptimaliseerde sequentie voor een zuur-stabiele GFP (asGFP) naar de N-terminus van een gehumaniseerde IgG zware keten, het creëren van een asGFP-IgG fusie. De voordelen van het produceren van GFP-IgG omvatten de mogelijkheid om de aanwezigheid van een doeleiwit tijdens expressie te visualiseren, terwijl asGFP-IgG het mogelijk maakt om de aanwezigheid van recombinant eiwit te zien in niet alleen de expressie- en extractiestappen, maar ook in de zuiveringsstappen van het eiwit. Dit protocol kan worden aangepast voor de productie, zuivering en visualisatie van een reeks GFP-fusie-eiwitten geproduceerd in N. benthamiana en gezuiverd met behulp van chromatografietechnieken die een lage pH vereisen. Het proces kan ook worden afgestemd op verschillende hoeveelheden bladmateriaal. Terwijl Abs en fusie-eiwitten gelabeld met GFP of asGFP zijn niet bedoeld om te worden gebruikt voor therapieën, deze methoden kunnen nuttig zijn als controles tijdens experimenten en kan ook verder worden gebruikt als een leermiddel voor moleculaire en cellulaire biologie en biotechnologie, zowel in-persoon en vrijwel.

<table><tbody><tr><td>5 mL spuit</td><td>elke</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL spuit</td><td>elke</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>Blender met bekers</td><td>elke</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>219482101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethyleendiamine)tetraazijnzuur</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E-6760</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>elke</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>G-Biosciences</td><td>BTNM-0037</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G7126-500G</td><td></td></tr><tr><td>HCl (Zoutzuur)</td><td>EMD MILLIPORE CORPORATION</td><td>HX0603-4</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsblok</td><td>elke gerenommeerde leverancier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Jiffy-7 727 met gat turfpellets</td><td>Hummert International</td><td>14237000</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>K-120-100</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Kaliumchloride)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (Kaliumfosfaat)</td><td>J.t.baker</td><td>3248-05</td><td></td></tr><tr><td>KOH (Kaliumhydroxide)</td><td>VWR</td><td>BDH0262</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>MES (2-(N-Morpholino)ethaansulfonzuur)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Millipore</td><td>4 75855-1R</td><td></td></tr><tr><td>Vochtigheidscontrole potmix</td><td>Miracle-Gro</td><td>755783</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (Natriumfosfaat)</td><td>J.t.baker</td><td>3827-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Natriumchloride)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203274C</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana zaden</td><td>elke gerenommeerde leverancier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Fenylmethylsulfonylfluoride)</td><td>G-Biosciences</td><td>786-787</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen kolom</td><td>elke</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610394</td><td></td></tr><tr><td>Proteïne G-hars</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20399</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>R-120-25</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Natriumdodecylsulfaat)</td><td>G-Biosciences</td><td>DG093</td><td></td></tr><tr><td>Natriumascorbaat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7631-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>elke gerenommeerde leverancier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Titan3 0,75 µm glasvezelfilter</td><td>ThermoScientific</td><td>40725-GM</td><td></td></tr><tr><td>Schaal voor turfpellets met koepel</td><td>elke</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-Base</td><td>J.t.baker</td><td>4109-02</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M108-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>17221</td><td></td></tr><tr><td>UV-lamp</td><td>elke</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wateroplosbare universele plantenvoeding</td><td>Miracle-Gro</td><td>2000992</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>9182</td><td></td></tr></tbody></table>

productie van igg fusion proteins transiently uitgedrukt in nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

De grote vraag naar antilichamen als therapeutische interventies voor verschillende infectieuze, metabole, auto-immuun-, neoplastische en andere ziekten creëert een groeiende behoefte aan het ontwikkelen van efficiënte methoden voor recombinante antilichaamproductie. Vanaf 2019 waren er meer dan 70 door de FDA goedgekeurde monoklonale antilichamen en is er een exponentieel groeipotentieel. Ondanks hun belofte, beperkende factoren voor wijdverbreid gebruik zijn productiekosten en complexiteit. Mogelijk bieden fabrieken goedkope, veilige en gemakkelijk schaalbare eiwitproductiestrategieën. Planten zoals Nicotiana benthamiana kunnen niet alleen complexe zoogdiereiwitten correct vouwen en assembleren, maar kunnen ook kritische post-translationele wijzigingen toevoegen die vergelijkbaar zijn met die van celculturen van zoogdieren. In dit werk, met behulp van native GFP en een zuur-stabiele variant van groene fluorescerende eiwitten (GFP) versmolten met menselijke monoklonale antilichamen, waren we in staat om de gehele voorbijgaande antilichaam expressie en zuivering proces van N. benthamiana planten visualiseren. Afhankelijk van het doel van het experiment kan native GFP-fusie zorgen voor een eenvoudigere visualisatie tijdens de expressiefase in de planten, terwijl zuur-stabiele GFP-fusie visualisatie mogelijk maakt tijdens downstreamverwerking. Deze schaalbare en eenvoudige procedure kan worden uitgevoerd door een enkele onderzoeker om milligram hoeveelheden zeer zuivere antilichaam of antilichaam fusie eiwitten te produceren in een kwestie van dagen met behulp van slechts een paar kleine planten. Een dergelijke techniek kan worden uitgebreid tot de visualisatie van elk type antilichaam zuiveringsproces en mogelijk vele andere eiwitten, zowel in plantaardige als andere expressiesystemen. Bovendien kunnen deze technieken profiteren van virtuele instructies en worden uitgevoerd in een academisch laboratorium door undergraduate studenten met minimale eerdere ervaring met moleculaire biologie technieken, het verstrekken van een basis voor project-based exploratie met real-world toepassingen.

Deze studie toont een eenvoudige en snelle methode aan om recombinante eiwitten te produceren en te visualiseren in downstream processen. Met behulp van N. benthamiana en volgens het meegeleverde protocol, recombinante eiwitproductie hier beschreven kan worden bereikt in minder dan een week. De algemene workflow van plantenexpressie, extractie en zuivering wordt weergegeven in figuur 1. De stadia van plantengroei van 2 weken oude zaailingen, 4 weken oude planten en 6 weken oude plan...

We beschrijven hier een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in Nicotiana benthamiana. Dit protocol kan worden uitgebreid tot zuivering en visualisatie van tal van eiwitten die kolomchromatografie gebruiken. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan het persoonlijke en virtuele college onderwijs laboratorium, het verstrekken van project-based exploratie.

Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Dit is een demonstratie van een eenvoudige methode voor expressie, extractie, en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in tabak gerelateerde Nicotiana benthamiana planten. Dit protocol kan worden gebruikt voor zuivering en visualisatie van door planten geproduceerde antilichamen, antilichaamfusies en de meeste eiwitten die kunnen worden gezuiverd door middel van kolomchromatografie. Dit protocol stelt onderzoekers en studenten van universitaire werklaboratoria in staat om GFP-gelabelde eiwitten te visualiseren in de meeste stappen van het eiwitproductieproces.Plaats grond turf pellets op een lade en giet eerder gekookt, nog steeds warm water over de turf pellets voor volledige expansie. Pellets zal een paar minuten duren om volledig uit te breiden. Nadat pallets volledig zijn uitgebreid, plaats twee tot drie Nicotiana benthamiana zaden op elke turf pellet met behulp van pincet.Nadat dit is gedaan, moet je ongeveer 0,5 centimeter water gieten om de bodem van de lade te bedekken. Vergeet niet om de lade te labelen met de zaaidatum. Ga door met het water van de zaailingen dagelijks met de juiste hoeveelheden kunstmest.De lade moet worden bedekt met een vochtige o

production-igg-fusion-proteins-transiently-expressed-nicotiana

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende...

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.

Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.

Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in Nicotiana benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. Hierin is beschreven van een gedetailleerd protocol voor snelle (5 dagen) preparative-schaal productie van triterpenen en analogen met behulp van dit krachtige plantaardige platform.

Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal

Dit is bedoeld als een kennismaking met klem opnemen patch van Xenopus laevis oöcyten. Het omvat vitelline membraan verwijderen, de vorming van een gigaohm afdichting (gigaseal), en de optionele conversie van de patch naar buiten-out topologie.

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Leer de productie en zuivering van recombinant menselijk IgG-GFP-fusie-eiwitten in Nicotiana benthamiana. Deze methode maakt visualisatie tijdens chromatografie mogelijk voor onderwijs en biotechnologisch onderzoek.

Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana

Meer video's verkennen