Verwijdering en vervanging van endogene liganden uit lipidegebonden eiwitten en allergenen

Veel allergenen binden hydrofobe moleculen. Dit protocol maakt het mogelijk om deze liganden volledig te verwijderen en te vervangen, waardoor we hun impact op structuur en immunogeniciteit op een systematische manier kunnen bestuderen. Het gebruik van omgekeerde HPLC, in combinatie met thermisch gloeien, heeft twee voordelen.

Het verwijdert endogene liganden en het helpt liganden op te blazen om anders ontoegankelijke bindingssites te openen. Als we de factoren kunnen bepalen die bijdragen aan allergeniciteit, kunnen we mogelijk therapieën ontwerpen die deze factoren vermijden. Veel eiwitten binden lipide liganden, die sterk worden vastgehouden en zowel structuur als functie kunnen beïnvloeden.

Onze methode maakt het mogelijk om deze interacties systematisch te bestuderen. De beperkte oplosbaarheid en toegankelijkheid van veel lipidenladingen kan het laadproces belemmeren. Zorg ervoor dat u voorzichtig bent bij het voorbereiden van deze liganden en houd rekening met de noodzaak van systeemspecifieke aanpassingen.

Omdat het werken met hydrofobe en onoplosbare liganden een aanpassing is voor sommige allergologen en biochemici, kan het nuttig zijn om te zien hoe de monsters er in verschillende stadia uitzien. Breng na het klonen van expressie en zuivering 12 milliliter van de gespleten Bla g 1 aan op een centrifugaalfiltereenheid met een moleculair gewichtsafsnijding van minder dan 10 kilodalton voor meerdere centrifugaties in een zwenkemmerrotor totdat het totale volume is teruggebracht tot minder dan twee milliliter. Laad het resulterende concentraat op een 250 bij 10 millimeter HPLC-systeem dat is uitgerust met een C18 reverse-phase chromatografiekolom die is geëquilibreerd met 97% buffer A en 3% buffer B.Elute Bla g 1 bij een debiet van 1,5 tot 4 milliliter per minuut, zoals aangegeven in de tabel, met behulp van de fluorescentieabsorpantie op 280 nanometer om het elutieproces te bewaken.

Vanaf ongeveer 34 tot 40 minuten en een buffer B-concentratie boven 74% verzamelen niet meer dan vier milliliter van elke Bla g 1 fractie. Aliquot de gepoolde Bla g 1 fractie in glazen reageerbuizen. Bedek de buizen met paraffinefolie en perforer de film met twee gaten.

Vries vervolgens de monsters een uur in bij min 80 graden Celsius en gebruik een lyophilizer om de resulterende gedelipide eiwitmonsters te drogen. Om de verwachte Bla g 1-opbrengst te bepalen, moet een gevette gelipide test aliquot opnieuw worden opschorten in vijf milliliter refolding buffer. Verwarm het mengsel in een bekerglas van 500 milliliter met 250 milliliter water tot 95 graden Celsius op een hete plaat met roeren en intermitterend vortexen.

Houd de oplossing 30 tot 60 minuten op 95 graden voordat u het waterbad langzaam op kamertemperatuur laat komen. Wanneer de oplossing is afgekoeld, passeert u het gegloeide Bla g 1 lipidenmengsel door een spuitfilter van 0,22 micron om deeltjes te verwijderen en gebruikt u een nieuw centrifugaalfilter met een 10 kilodalton-afsnijding om het gefilterde eiwit drie keer in PBS te bufferen om eventuele resterende vrije vetzuren en organisch oplosmiddel te verwijderen. Beoordeel vervolgens de eiwitconcentratie met behulp van een standaard eiwitanalysetest om de verwachte opbrengst voor de resterende Bla g 1-aliquots te bepalen.

Om de Apo-Bla g 1 te reconstrueren, moet de Bla g 1-aliquots opnieuw worden opschorten in vijf milliliter refolding buffer per aliquot en de monsters worden gegloeid zoals aangetoond. Om de Bla g 1 met fosfolipiden te laden, voegt u 10 milligram van de gewenste lading toe aan een glazen reageerbuis en lost u op in chloroform en verdampt u de chloroform om een lipidefilm te produceren. Voeg vervolgens PBS toe aan de buis om een uiteindelijke fosfolipideconcentratie van 20 millimollar te produceren.

Verwarm de fosfolipide boven de faseovergangstemperatuur van de lipidelading om de lipidefilm te rehydrateren en vortex totdat de oplossing troebel wordt. Voeg vervolgens de phospho lipidelading toe om een 20x molaire overmaat aan liganden te produceren ten opzichte van Bla g 1 op basis van de verwachte opbrengst. Er kan zich een precipitant vormen.

Vortex om te mengen voordat het eiwit wordt gegloeid zoals aangetoond. Om de verwijdering of lading van lading door fosfor-31 NMR te bevestigen, gebruikt u een centrifugaalfilter om het monster te concentreren tot meer dan 100 micromoler, zoals aangetoond. Bereid referentiefosfolipidemonsters van bekende concentraties in PBS-buffer voor zoals aangegeven, en verdun de Bla g 1-eindreferentie in een verhouding van 1:1 met cholaatbuffer tot een totaal volume van ongeveer 600 microliter.

Gebruik een breedbandsonde om eendimensionale, 31-fosfor NMR-spectra van de collaat-solubilized Bla g 1-monsters en referentiefosfolipidenormen te verkrijgen, en vergelijk de Bla g 1 31 fosfor NMR-spectra met die verkregen voor fosfolipidereferentiemonsters om de verwijdering van endogene gebonden liganden en/of de binding van de gewenste liganden op basis van de chemische verschuivingen van de zichtbare pieken te bevestigen, en vergelijk vervolgens de piekintensiteit van de fosfolipide referentiemonsters. Met behulp van affiniteitschromatografie kan recombinant GST Bla g 1 gemakkelijk worden geïsoleerd tot een hoog zuiverheidsniveau, waardoor een opbrengst van twee tot vier milligram per liter celkweek ontstaat. Nachtelijke incubatie met TEV-protease bij vier graden Celsius is voldoende om de GST-tag te verwijderen, waardoor het eindproduct ongeveer 24 kilodalton oplevert.

Het toepassen van de Bla g 1 op een omgekeerde fase C18 kolom levert een onderscheidend elutieprofiel op, met twee grote pieken bij 50% buffer B en een tweede grote piek bij 75% buffer B.Fosfor-31 NMR spectra van Apo-Bla g 1 vertonen geen detecteerbare fosfolipiden. Een standaardcurve kan uit de NMR worden geproduceerd met behulp van referentiemonsters van bekende DSPC-concentraties. Het vergelijken van de fosfor 31 signaalintensiteit verkregen uit DSPC Bla g 1 met deze standaardcurve kan worden gebruikt om de bindende stoichiometrie van de lipiden-per-eiwit op te leveren.

Cirkelvormige dichroïsmespectra voor Apo-en lipide-geladen Bla g 1 tonen minima van 220 en 210 nanometer, indicatief voor een overwegend alfa-spiraalvormige structuur. Circulaire thermische denaturatietesten op basis van dichroïsme tonen ook een coöperatief verlies van alfa-spiraalvormige secundaire structuur, wat wijst op een gevouwen bolvormig domein. Bovendien toont de analyse van de resulterende smelttemperaturen een significante toename aan van nMix ligandbinding, consistent met Bla g 1 verkregen uit zijn natuurlijke allergenenbron.

Het succes van dit protocol hangt af van het vermogen om zowel de beperkte oplosbaarheid van hydrofobe liganden als de ontoegankelijke aard van de Bla g 1 bindingsholte te overwinnen. Deze procedure legt de basis voor immunologische studies, zoals T-cel proliferatietesten, om het effect van lipide liganden op sensibilisatie en de moleculaire mechanismen waardoor dit gebeurt te beoordelen. Door deze procedure te koppelen aan verdere biofysische assays, hebben we aangetoond dat de binding van hydrofobe liganden de bla g 1-stabiliteit verbetert, met mogelijke downstream implicaties voor epitoopgeneratie en allergeniciteit.