Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen
22 januari 2021
Dit protocol presenteert een nieuw, robuust en reproduceerbaar kweeksysteem om driedimensionale sferoïden uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen te genereren en te laten groeien. De resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze aanpak om kankerstamcelbiologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.
Deze nieuwe methode van sferoïde culturen kan worden gebruikt om de tumorigeniciteit te bestuderen om de aanwezigheid van verschillende populaties van kankerstamcellen te analyseren en kan ook mooi worden toegepast door middel van hoog scherm voor nieuwe geneesmiddelen. Dit is een robuust en repetitief kweeksysteem voor het genereren van een groot aantal homogeen formaat sferoïden. Bovendien kunnen deze sferoïden worden gebruikt om kankerachtige stamcellen te bestuderen.
Deze methode is opgezet om chronische kankerbiologie te bestuderen, maar kan eenvoudig worden ingesteld om andere kankers te bestuderen door de 3D-cultuuromstandigheden te veranderen. Zorg ervoor dat u op bubbels in het medium let, om de plaat niet te veel te bewegen tijdens de vorming van sferoïden en wees voorzichtig bij het oogsten van de sferoïden in de zeef. Begin met het voorbehandelen van de putten van een 24-putplaat met 500 micro liter anti-aanhechtingsspouwoplossing per put.
Centrifugeer na een paar seconden de plaat in de rotor van de zwenkbak en spoel elke put af met 2 milliliter warm basaal medium. Let op de plaat onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de bellen volledig uit de microputten zijn verwijderd. Als er geen bellen worden waargenomen, spoelt u de putten opnieuw voordat u een milliliter warm DMEM keldermembraanmatrixmedium aan elke put toevoegt.
Om sferoïde vorming te induceren, zie de gewenste concentratie Caco-2 cellen in een 2D monolaag in een schaal van 10 centimeter in DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%antibiotica. Voor de cultuur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide in een bevochtigde atmosfeer. Wanneer een samenvloeiing van 80% is bereikt, wast u de cellen met vijf milliliter PBS voordat u de cultuur behandelt met twee milliliter Trypsine-EDTA gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.
Wanneer de cellen zijn losgekoppeld, neutraliseer de Trypsin met vier milliliter volledige DMEM. Verzamel na het tellen de cellen door centrifugeren en resuspend het palet in het juiste volume DMEM keldermembraanmatrixmedium om de gewenste concentratie cellen in één milliliter medium per put te bereiken. Voeg een milliliter cellen toe aan elke put van de prepaid 24 well plaat, gevolgd door de toevoeging van een milliliter DMEM keldermembraanmatrix medium aan elke put.
Centrifugeer na het zaaien onmiddellijk de plaat en gebruik een lichtmicroscoop om te controleren of de cellen gelijkmatig over de microputten zijn verdeeld. Plaats de plaat vervolgens 48 uur in de celkweek-incubator zonder de cellen te verstoren. Om de sferoïden te oogsten, gebruik je aan het einde van de incubatie een serologische pipet en de helft van het supernatant in elke put om de sferoïden voorzichtig uit hun microputten te verloederen.
Wanneer alle sferoïden zijn losgemaakt, gebruikt u de pipet om de 3D-culturen voorzichtig van elke put over te brengen naar een omkeerbare zeef van 37 micron bovenop een conische buis van 15 milliliter. Was elke put drie keer met één milliliter voorverwarmd basaal medium per wasbeurt om eventuele resterende sferoïden te verzamelen en voeg deze extra sferoïden toe aan de zeef. Controleer na de laatste wasbeurt de plaat onder de microscoop om te bevestigen dat alle sferoïden uit de microputten zijn verwijderd.
Draai vervolgens de zeef om over een nieuwe buis van 15 milliliter en was de bodem van de zeef met een vers DMEM keldermembraanmatrixmedium om de sferoïden in de buis te verzamelen. Sferoïden stijgen van 500 cellen tonen de meest homogene toename in grootte in de loop van de tijd. Met 500 en 600 cellen per sferoïde bepalen we het optimale aantal cellen waaronder een goede groei en lage variabiliteit kan worden bereikt.
De toevoeging van keldermembraanmatrix verbetert de sferoïde groei en homogeniteit. In lange termijn cultuur, de cellen verschijnen als dichte meerdere lagen op dag drie. Terwijl afgeplatte cellen gerangschikt in monolagen duidelijk zichtbaar zijn op dag 10.
Interessant is dat er vanaf dag vijf een lumen in de sferoïden verschijnt. Bovendien wordt een duidelijke toename van proliferatie van celkernantigeenpositieve cellen waargenomen op dag vijf en zeven die afneemt op dag 10. Verrassend genoeg wordt geactiveerde Caspace 3 alleen op dag drie en vijf in zeer weinig cellen waargenomen.
Terwijl hoge niveaus van Beta-catenine expressie worden waargenomen op elk moment punt. Het potentieel van de sferoïden om te differentiëren in Anterosieten blijkt uit hun Alkalische fosfatase en opgeloste dragerfamilie 2A5 mRNA expressie. Bovendien drukken deze sferoïden typische kankerstamcelmarkers uit en reageren ze op combinatiechemotherapiebehandelingen die routinematig worden toegediend aan colorectale kankerpatiënten.
Dus sferoïden bestaan uit verschillende celpopulaties. Ze kunnen dan mooi worden gebruikt om celspecifieke reacties op stimuli zoals refractors te analyseren en uiteindelijk voor medicijnreacties.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een robuust culturesysteem voor het genereren van driedimensionale sferoïden uit Caco2 colonadenocarcinoomcellen. Deze methode maakt het mogelijk om de biologie van kankerstamcellen en hun respons op chemotherapie te bestuderen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van kankerstamcellen is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve therapieën.
- 3D-sferoïdculturen bootsen in vivo tumoromgevingen na.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende soorten kanker.
- Robuustheid en reproduceerbaarheid zijn essentieel voor de experimentele validiteit.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor de sferoïdcultuur van Caco2-cellen.
- Om de tumorigeniciteit en de populaties kankerstamcellen te onderzoeken.
- Om high-throughput screening voor nieuwe geneesmiddelen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Voorbehandeling van de wells met een anti-adherent spoelmiddel.
- Zorgvuldige hantering om bellen tijdens de vorming van sferoïden te vermijden.
- Oogsten van sferoïden met behulp van een zeef.
- Monitoring van de kweekcondities voor optimale groei.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van homogeen gevormde sferoïden.
- Aangetoonde toepasbaarheid voor het bestuderen van kankerstamcellen.
- Potentieel voor toepassingen bij drugscreening.
- Aanpasbaarheid aan andere kankertypen door het wijzigen van de kweekcondities.
Conclusies
- Deze methode biedt een nieuw instrument voor kankeronderzoek.
- Het vergroot het begrip van de dynamiek van kankerstamcellen.
- Toekomstige studies kunnen dit systeem benutten voor therapeutische ontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit 3D-sferoïdemodel beantwoordt aan de dringende behoefte aan preklinische systemen die tumorheterogeniteit en fenotypen van kankerstamcellen (CSC) nabootsen, waardoor een meer voorspellende evaluatie van therapeutische targets en drugrespons in colorectaal kankeronderzoek mogelijk wordt. Door een reproduceerbaar platform te bieden voor langdurige CSC-verrijking en de beoordeling van de respons op chemotherapie, ondersteunt deze methode validatie van targets in een vroeg stadium en inspanningen voor lead-identificatie met een verbeterd translationeel vertrouwen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de heterogeniteit en het tumorigeniteitsvermogen van CSC's te onderzoeken via differentiële proliferatiepatronen en lumen-achtige structuren binnen sferoïden.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door verrijking van CSC's die gevestigde markers tot expressie brengen, wat bijdraagt aan het mechanistisch verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert sferoïden van homogene grootte vanuit gedefinieerde celinputs, waardoor een gestandaardiseerd systeem ontstaat voor kwantitatieve analyse van de drugrespons.
- Operationele waarde: Compatibel met high-throughput screening-workflows vanwege de robuustheid, reproduceerbaarheid en het gemak van het oogsten van sferoïden met behulp van zeefmethoden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert de expressie van CSC-markers en de respons op klinisch relevante combinatiechemotherapie, wat preklinische modellering van behandelingsresistentie en -gevoeligheid mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Behoudt CSC-fenotypes gedurende langdurige kweek, wat longitudinale studies naar drugsefficiëntie en mechanismen van tumorrecidieven ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelwit hypothesen via lead-identificatie tot preklinische validatie, in het bijzonder voor oncologieprogramma's die gericht zijn op CSC-gerichte therapieën en resistentiemechanismen.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert de verduidelijking van signaalpaden en biologische risicoreductie door het modelleren van CSC-niches en differentiële medicijnresponsen in een 3D-context.
- Screening: Maakt standaardisatie van assays mogelijk door de vorming van grootte-homogene sferoïden, wat betrouwbare screening van verbindingen tegen CSC-verrijkte populaties ondersteunt.
- Analyses: Biedt kwantitatieve resultaten via CSC-markerexpressie, proliferatiemarkers (PCNA) en apoptosemarkers (geactiveerd Caspase-3) om behandelcondities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Borgt preklinische continuïteit door de respons op chemotherapie te modelleren in een ziekterevante systeem dat de heterogeniteit van colorectaal adenocarcinoom weerspiegelt.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Aanpasbaar aan andere kankertypen door het wijzigen van de 3D-kweekcondities, waardoor het fungeert als een herbruikbaar platform voor diverse oncologische ontdekkingsprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door CSC-gestuurde tumorheterogeniteit en functionele stamceleigenschappen vast te leggen die ontbreken in 2D-modellen.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gestandaardiseerde seeding, anti-adherentie voorbehandeling en oogsten via strainers, waardoor de variabiliteit bij de generatie van sferoïden wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door vroege beoordeling van CSC-targeterende verbindingen en resistentiemechanismen mogelijk te maken, wat het biologische risico in een later stadium verlaagt.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van leads op basis van CSC-modulatie en data over chemotherapie-respons uit een fysiologisch relevant model.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in 3D-celkweektechnieken, waaronder anti-adhesie oppervlaktebehandeling en zorgvuldige hantering om belvorming tijdens de initiatie van sferoïden te voorkomen.
- Afhankelijk van toegang tot basaalmembraanmatrix (bijv. Matrigel) en standaard celkweekapparatuur, waaronder centrifuges, strainers (37 micron) en omgekeerde microscopen voor monitoring.
- Vereist cross-team standaardisatie van de zaaidichtheid (500–600 cellen/sferoïde) en incubatietijden om homogeniteit en reproduceerbaarheid tussen experimenten te waarborgen.
- Adaptatie naar andere kankertypen vereist optimalisatie van de basaalmembraanconcentratie en kweekduur op basis van cellijn-specifieke adhesie en sferoïdevormingskinetiek.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van voorzichtig hanteren tijdens het oogsten om disruptie van sferoïden te vermijden en potentiële variabiliteit in de timing van lumenvorming tussen batches.
