Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie

Antilichamen worden routinematig gebruikt in laboratoriumtechnieken en hun therapeutische en diagnostische toepassingen breiden zich snel uit. Snelle en nauwkeurige antigeen-antilichaam bindende karakterisering is van cruciaal belang voor deze toepassingen. Massafotometrie meet snel bindende affiniteiten met extreem kleine hoeveelheden materiaal.

Er is geen etikettering of immobilisatie vereist en informatie over eiwitreligie en zuiverheid kan worden verkregen uit hetzelfde experiment. Dit protocol kan niet alleen worden gebruikt om antilichamen te bestuderen, maar ook om sterke eiwit-eiwitbindingen te meten voor eiwitten met een moleculaire massa groter dan 50 kilodaltons. Begin met het gebruik van soft-tip tangen en wasflessen om achtereenvolgens 24 bij 50 millimeter coverslips van boven naar beneden te spoelen met gedestilleerd water, ethanol, gedestilleerd water, isopropanol en gedestilleerd water.

Na de laatste wasbeurt droog je de covers met een stroom schone stikstof in dezelfde richting om besmetting van de tangen te voorkomen. Spoel 24 bij 24 millimeter coverslips met gedestilleerd water en ethanol zoals aangetoond, gevolgd door drogen met een stroom van schone stikstof. Na het drogen, plaats een 24 bij 24 millimeter coverslip op een stuk aluminiumfolie en plaats stroken van dubbelzijdige tape op de coverslip.

Snijd vervolgens de 24 bij 24 millimeter coverslip uit de folie en druk de folie voorzichtig op de werkende kant van de 24 bij 50 millimeter coverslip. Om antilichaam-antigeenmonsters voor te bereiden op de affiniteitsmetingen, filtert u ten minste twee milliliter PBS door een spuitfilter van 0,22 micron om stofdeeltjes en aggregaten te verwijderen en de antilichaam- en antigeenvoorraden te centrifugeren. Meet de 280 nanometer UV-absorptie van de antilichamen en antigeenvoorraden om hun werkelijke concentraties te bepalen en bereid een titratiereeks van antilichaam-antigeenmengsels voor op het juiste bereik van antigeenconcentraties in een eindvolume van 50 microliter per monster.

Vervolgens de antigeen-antilichaammengsels ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur uitbroeden om de bindingsreactie in staat te stellen chemisch evenwicht te bereiken. Om de antilichaam-antigeen affiniteit te beoordelen door middel van massa fotometrie, breng een druppel microscoop onderdompeling olie aan op het instrument doel en plaats de flow kamer op het stadium van de microscoop. Voeg 10 microliter gefilterde PBS toe aan het ene uiteinde van het kanaal van de stroomkamer.

De buffer komt het kanaal binnen door capillaire actie. Gebruik in het tabblad Focus control van de software voor het verzamelen van gegevens de grove trapbeweging op en neer om de eerste aanpassingen aan te brengen en op scherpte te klikken om de uitlezing van het scherptesignaal weer te geven. Gebruik de fijne op- en neerverstellingsknoppen om de scherptewaarde te maximaliseren en klik op scherpstelling en vergrendelfocus om de focustrackingfunctie te activeren.

Een afbeelding van een schone dia moet een signaalwaarde hebben die gelijk is aan of lager is dan 0,05%Load 20 microliters van het eerste antilichaam-antigeenmonster zoals aangetoond, waarbij de vloeistof van het andere uiteinde wordt bedekt met een klein stukje vlekpapier. Klik onmiddellijk na het laden op record om het juiste aantal frames te verkrijgen dat gelijk is aan 100 seconden aan gegevens. Voer aan het einde van de periode voor het verzamelen van gegevens een bestandsnaam voor de gegevens in en klik op OK en vervolgens op voorbeeld om het bestand op te slaan.

Als u de gegevens van de massafotometrie wilt analyseren, opent u het interessant bestand en klikt u op analyseren. Klik op laden om de kalibratiefunctie te laden en klik op bestand en sla resultaten op om de geanalyseerde gegevens op te slaan. Open de ingelaste gebeurtenissen om de relatieve concentraties van elke soort in het monster te verkrijgen.

csv-bestand, kopieer de gegevens in kolom M in de juiste plotten en analyse software, en gebruik de plot statistieken histogram functie om de moleculaire massaverdeling plot. Dubbelklik op het histogram om het venster ploteigenschappen te openen, de automatische opslaglocatie uit te schakelen en een opslaglocatiegrootte van 2,5 kilodaltons te selecteren. Als u de opslaglocatiecentra wilt maken en gegevens wilt tellen, klikt u op toepassen en gaan.

Als u het histogram wilt aanpassen met Gaussische functies, selecteert u de opslaglocatiecentra en telt u kolommen en klikt u op de analysepieken en de basislijnvakfunctie voor meerdere piekpast. Dubbelklik om de geschatte piekposities op het distributieperceel aan te geven en klik op open NL fit. Controleer de vaste selectievakjes voor de XC-piekcentra en stel hun waarden in op de verwachte moleculaire massa's van het vrije antilichaam en de enkele en dubbele antigeen-antilichaamcomplexen.

Controleer de optie delen op de breedteparameters en klik op pasvorm. De ingerichte piekhoogtewaarden van de Gaussische componenten vertegenwoordigen de relatieve concentratie van elke soort in het monster. Gebruik vervolgens de vergelijking om de concentratiefractie van elke soort te berekenen op basis van de piekhoogtewaarden.

Als u evenwichtsconstanten wilt berekenen met behulp van een spreadsheetprogramma, opent u de dissociatieconstantcalculatie. xlsx-werkblad. In dit werkblad kunnen de geel gemarkeerde celwaarden in rijen 1 tot en met 10 worden gewijzigd om de constante berekeningen van het evenwicht uit te voeren.

Voer de geschatte dissociatieconstantewaarden in nanomolar-eenheden in de cellen B1 en B2 in. Als de geschatte dissociatieconstantewaarden niet bekend zijn, blijven de standaardwaarden in de cellen B1 en B2 ongewijzigd. Voer de totale antilichaam- en totale antigeenconcentraties in nanomolar-eenheden in de cellen D2 en E2 in en voer de berekende fractiewaarden voor elke soort in de cellen F2, G2 en H2. Voeg bij het uitvoeren van een globale analyse van de titratie de juiste gegevensfractiewaarden toe aan rijen 2 tot en met 10. Selecteer in het venster parameters van de oplosser cel B15 voor het ingestelde doelvak en de cellen B1 tot B2 voor het vak Variabele cellen.

Selecteer de min-knop voor de optie naar en schakel het selectievakje Niet-negatieve variabelen maken in en selecteer GRG nonlinear als oplosmethode en klik op oplossen. De constante waarden van de best passende dissociatie worden weergegeven in de cellen B1 en B2. En de uiteindelijke som van de kwadraatfouten wordt weergegeven in cel B15. In dit representatieve experiment werd een titratiereeks uitgevoerd met het anti-menselijke trombineantilichaam bij een vaste concentratie van 25 nanomolar en 0, 7,5, 15, 30, 60 en 120 nanomolar menselijke alfa-trombinconcentraties om de moleculaire massaverdelingen van de antigeen-antilichaammengsels en het concentratiemonster alleen te verkrijgen.

Best fit piekhoogte parameters van de Gaussische componenten werden genormaliseerd om soorten concentratie fracties te verkrijgen. De concentratiefractiewaarden waren vervolgens wereldwijd geschikt om de antigeen-antilichaambindende affiniteiten te verkrijgen. De experimentele concentratiefracties en de globale pasvormresultaten voor het vrije antilichaam, het enkele antigeen-antilichaamcomplex en het dubbele antigeencomplex kunnen dan worden uitgezet.

Om nauwkeurige KD-waarden te verkrijgen, moeten eiwitconcentraties zorgvuldig worden geselecteerd om alle reactiesoorten te bevolken. We raden u aan een titratieserie te bereiden met behulp van een reeks antigeenconcentraties. Na het monteren van de gegevens kan de foutprojectiemethode worden gebruikt om de montagefout te verkrijgen, maar het is beter om het experiment te herhalen en de standaardafwijkingen van de gemiddelde bindingsaffiniteitswaarden te berekenen.