Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

Nauwkeurige kwantitatieve metingen van eiwitten zijn cruciaal om de dynamische en ruimtelijke samenwerking tussen eiwitten te begrijpen om de ziekte terug te begrijpen naar de biologie. Het algemene doel van dit experiment is om een geïntegreerde kwantitatieve proteomics-workflow voor weefselmonsters te bieden, waarbij labelvrije en labelgebaseerde eiwitprofilering wordt gecombineerd voor het ontdekken van biomarkers. In deze studie hebben we het instrument Orbitrap Fusion gebruikt om de eiwitten te kwantificeren met behulp van labelgebaseerde en labelvrije benaderingen.

Weefsellysis is een van de meest cruciale stappen voor het succes van een LC-MS-MS experiment. Neem 30 mg weefsel in een kraal kloppende buis. Voeg na het wassen met de PBS 300 microliter ureumlysisbuffer toe met acht molair ureum, Tris, NaCl en MgCl2.

Gebruik een sonde sonicator om de inhoud van het weefsel te lyseren. Herhaal dit voor een andere cyclus. Als u intact weefsel aan de onderkant van de buis waarneemt, voegt u zirkoniumparels toe aan de buis en homogeniseert u het weefsel met behulp van een kralenklopper gedurende 90 seconden, met vijf minuten incubatie op ijs.

Centrifugeer de monsters ongeveer 6000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om het celafval van het supernatant te scheiden. Verzamel het supernatant in een verse buis en meng de oplossing gelijkmatig. Kwantificeer de eiwitconcentratie in het weefsellysaat met behulp van Bradford-reagens.

Meet hiervoor de OD van het monster op 595 nanometer en extrapoleer het met behulp van een standaardgrafiek zoals weergegeven op dit scherm. Voer na de eiwitkwantificering 10 microgram weefsellysaat uit op 12% SDS-PAGE-gel om de kwaliteit van lysaten te controleren. De eerste stap in de vertering in oplossing omvat de vermindering van disulfidebindingen, met behulp van TCEP.

Na de toevoeging van TCEP, incubeer de inhoud van de buis gedurende een uur bij 37 graden Celsius. De volgende stap omvat alkylering om te voorkomen dat de verminderde disulfidebindingen zich opnieuw vormen. Voeg een alkylerend middel zoals jodoacetamide toe en incubeer de tube in het donker gedurende 10 minuten.

Verlaag na incubatie de uiteindelijke concentratie van ureum tot minder dan één kies door te verdunnen met vier tot acht volumes verdunningsbuffer. Op dit punt is het raadzaam om de pH te controleren. De volgende stap omvat de toevoeging van trypsine aan de buis en het 's nachts incuberen van de buis voor een efficiënte spijsvertering.

Droog de volgende dag de verteerde peptiden in een vacuümconcentrator en ga verder met de ontsalingsstap. Om de ontsalting van peptiden uit te voeren, gebruikt u C18-fasetips. Activeer de C18-traptip door 50 microliter methanol toe te voegen, centrifugeer de tip gedurende twee minuten bij 1000 G.

Voeg nu 50 microliter acetonitril toe in 0,1% mierenzuur om de podiumpunt te wassen en centrifugeer de punt opnieuw. Reconstitueer de gedroogde verteerde peptiden in 50 microliter van 0,1% mierenzuur. Voeg de gereconstitueerde peptiden toe aan de geactiveerde fasepunt.

Herhaal deze stap minstens vier keer. Voeg om het monster te wassen 50 microliter 0,1% mierenzuur toe en herhaal de centrifugatiestap. Voeg voor de elutie van peptiden 50 microliter 40%ACN toe aan 0,1% mierenzuur en passeer het door de punt van het stadium door centrifugatie.

Herhaal deze stap met 50% en 60% ACN in 0,1% mierenzuur en vangt het filtraat op in een verse tube. Droog de ontsalde peptiden met behulp van een vacuümconcentrator. Voordat LC-MS-MS wordt uitgevoerd, kwantificeert u de peptiden met behulp van de Scopes-methode.

Laad hiervoor twee microliter gereconstitueerd monster in de put van een microdruppelplaat en meet de absorptie bij 205 nanometer en 280 nanometer. Bereken de concentratie met de formule die op deze dia wordt beschreven. Zodra de ontsalde peptiden zijn gedroogd, zijn ze klaar voor labelgebaseerde kwantificering.

Voor iTRAQ-etikettering moeten de gedroogde peptiden worden gereconstitueerd in 20 microliter oplossingsbuffer, verstrekt in de iTRAQ-etiketteringskit. Reconstitueer de etiketten door ethanol uit de injectieflacon in de kit toe te voegen en meng grondig. Het is raadzaam dat alle stappen worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.

Voeg de homogeen gemengde iTRAQ-labels toe aan hun respectievelijke buizen en laat de etiketteringsreactie plaatsvinden. Doof aan het einde van de reactie overtollig ongebonden label in de buis door water van MS-kwaliteit toe te voegen en incubeer gedurende een half uur tot een uur. Breng nu alle gelabelde inhoud over in een enkele buis en droog de gelabelde peptiden.

Na het reconstitueren van de monsters in 0,1% mierenzuur, opent u de autosampler van NanoLC en plaatst u de monsters in de autosampler. Zodra de monsters in de autosampler zijn geplaatst, is het belangrijk om de juiste parameters in te stellen voor vloeistofchromatografie en massaspectrometrie. Hier beschrijven we de parameters voor zowel labelvrije kwantificering als iTRAQ-gebaseerde kwantificering met behulp van LC-MS.

In het geval van labelvrije kwantificering is een gradiënt van 120 minuten gebruikt omdat een enkel ongefractioneerd monster wordt geïnjecteerd. Deze duur kan worden verhoogd of verlaagd op basis van de complexiteit van de steekproef. In dit experiment is een stroom van 300 nanoliter per minuut ingesteld met de volgende gradiënt voor oplossing B, in dit geval 80% acetonitril in 1% mierenzuur.

Op dezelfde manier kunnen we een verloop instellen voor een iTRAQ-experiment. Omdat de monsters niet-gefractioneerd zijn, is een gradiënt van 90 minuten gebruikt. De MS-parameters voor zowel labelvrije kwantificering als iTRAQ-labelgebaseerde kwantificering zijn hier te zien.

De eerste stap omvat het instellen van de toepassingsmodus door op de algemene parameters te klikken. Selecteer de peptidemodus en stel de duur van de methode in volgens de LC-gradiënt die wordt gebruikt. Definieer de scanparameters voor het experiment.

Door op de MS-OT optie te klikken, worden de parameters zichtbaar. Het detectortype dat in gebruik is, is ingesteld op Orbitrap. De andere optie die op dit instrument beschikbaar is, omvat een ionenval.

De resolutie is ingesteld op 60.000 en men kan kiezen tussen verschillende beschikbare opties, afhankelijk van de behoefte en het type van het experiment. Het massabereik is normaal en het scanbereik is ingesteld van 375 tot 1700. De andere parameters zijn standaard voor MS Application.

De intensiteitsdrempel is ingesteld en de laadstatus is ingesteld in het bereik van twee tot zes. Dynamische uitsluiting is ingesteld op 40 seconden en de massatolerantie is teruggebracht tot 10. De volgende set parameters omvat de MS-MS-parameters.

De isolatiemodus is geselecteerd met quadrupool, het isolatievenster is ingesteld op twee, de isolatieverschuiving is uitgeschakeld en het activeringstype is meestal HCD voor het proteomics-experiment. Botsingsenergie kan worden opgelost of worden ondersteund. Gelabelde monsters vereisen hogere botsingsenergieën, daarom is het voor iTRAQ-experimenten raadzaam dat de botsingsenergie wordt ingesteld op 35, terwijl deze voor LFQ-experimenten kan worden ingesteld op 30.

Het detectortype dat hier wordt gebruikt, is Orbitrap. De scanbereikmodus is automatisch. De andere parameters zijn standaard voor iTRAQ-experimenten en labelvrije kwantitatieve experimenten.

Als u op de samenvatting klikt, krijgt u een overzicht van alle LC- en MS-parameters die voor het experiment zijn gebruikt. U kunt elke parameter bekijken en de proeflezing uitvoeren. Zodra dat is gebeurd, klikt u op het bestand en slaat u het op als een methodebestand.

Zodra u hebt opgeslagen, kunt u de methode uitvoeren en krijgt u de ONBEWERKT-bestanden. En dan kunnen die onbewerkte bestanden worden geanalyseerd met behulp van Proteome Discoverer-software. Deze figuur toont de sequentiedekking van BSA in drie technische replicaties, die 91% is in de drie replicaties.

Dit geeft de reproduceerbaarheid van het instrument aan. Nu toont deze figuur de uniformiteit in het aantal peptide spectrale matches, peptiden en eiwitten geïdentificeerd in drie verschillende biologische monsters, wat opnieuw een idee geeft over de reproduceerbaarheid van het instrument. Hier vertegenwoordigt het Venn-diagram de gemeenschappelijke en exclusieve eiwitten die zijn geïdentificeerd in drie verschillende monsters in labelvrije experimenten en op labels gebaseerde experimenten.

Deze staafdiagrammen tonen het aantal peptidespectrale matches, peptidegroepen, totale eiwitten, eiwitgroepen en eiwitaantal na 1% FDR, geïdentificeerd in LFQ- en iTRAQ-experiment. Weefselproteomica van biologische monsters stelt ons in staat om nieuwe potentiële biomarkers te verkennen die verband houden met verschillende stadia van ziekteprogressie. Het beschreven protocol voor kwantitatieve proteomische analyse van weefsel biedt reproduceerbare goede dekkingsgegevens.

Het gebruik van technische replicaties zorgt voor een goede reproduceerbaarheid, zelfs als de monsters op verschillende tijdstippen worden uitgevoerd. Hier hebben we de analyse van weefselmonsters aangetoond met behulp van twee kwantificeringsmethoden: labelvrije en labelgebaseerde proteomics. De selectie van kwantitatieve proteomische technieken kan afhangen van het aantal monsters, de beschikbaarheid van MS-platforms en de biologische vraag die moet worden aangepakt.