Name: Directe bioprinting van 3D-meercellige borstsferoïden op endotheelnetwerken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Leer bioprinting van borstspheroïden op endotheelnetwerken voor 3D weefselmodellen. Deze methode versnelt drugsonderzoek en biedt een snel platform voor gepersonaliseerde geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door NIH 1R01HL140239-01 aan AMC. We willen het Cell Imaging Center van de Drexel University bedanken.

1. Borst epitheelcelgroei en testmedia
<ol><li>MCF10A borst epitheelcellen OPMERKING: De niet-tumorigeen vereeuwigde borstep epitheelcellijn is afgeleid van een patiënt met fibrocystische ziekte43. Cellen drukken geen oestrogeenreceptor uit.<ol>
<li>Om 20 μg/ml epidermale groeifactor (EGF) voor te bereiden, lost u 100 μg gelyophiliseerde EFG op in 500 μL steriele dH2O om 200 μg/ml EFG te maken. Voeg 500 μL van 200 μg/ml EFG toe aan 4,5 ml steriele 0,1% BSA in dH2O om een EGF-voorraadoplossing van 20 μg/ml te maken. Bewaren bereid 20 μg/ml EFG aliquots bij -20 °C gedurende maximaal 12 maanden.</li>
		<li>Om 500 μg/ml hydrocortison te bereiden, verdun 1 mg hydrocortison in 1 ml absolute ethanol (200 proof). Voeg 1 ml steriele DMEM F:12 toe aan dit mengsel om een 500 μg/ml hydrocortisonvoorraadoplossing te maken. Bewaar hydrocortison voorraad aliquots bij -80 °C gedurende maximaal 12 maanden.</li>
		<li>Om 10 μg/ml cholera-toxine te bereiden, lost u 1 mg choleratoxinelyophilized poeder op in 1 ml steriele dH2O om een 1 mg/ml cholera-toxinevoorraadoplossing te maken. Bewaar cholera toxine bouillon aliquots bij -80 °C gedurende maximaal 12 maanden.</li>
		<li>Voeg voor de bereiding van groeimedium 500 μL EFG (20 μg/ml), 500 μL hydrocortison (500 μg/ml), 5 μL choleratoxine (1 mg/ml), 500 μL runderecieline (10 mg/ml), 10 ml penicilline en streptomycine toe, en 25 ml paardenserum tot 500 ml DMEM F:12 voor een uiteindelijke concentratie van 20 ng/ml EFG, 500 ng/ml hydrocortison, 10 ng/ml choleratoxine, 10 ng/ml rundere insuline, 2% v/v penicilline en streptomycine en 5% v/v paardenserum. De concentratie antibiotica werd verhoogd tot 2% om rekening te houden met een verminderde steriliteit in het bioprintingproces; de antibioticaconcentratie kan echter worden verlaagd tot 1%.</li>
		<li>Om Assay Medium voor te bereiden, voegt u 500 μL hydrocortison (500 μg/ml), 5 μL choleratoxine (1 mg/ml), 500 μL rundere insulin (10 mg/ml), 10 ml penicilline en streptomycine toe, en 25 ml paardenserum tot 500 ml DMEM F:12 voor een uiteindelijke concentratie van 500 ng/ml hydrocortison, 10 ng/ml choleratoxine, 10 ng/ml boviene insuline, 2% v/v penicilline en streptomycine, en 5% v/v paardenserum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 OPMERKING: De triple-negatieve (zonder oestrogeenreceptor, progesteronreceptor en epidermale groeifactorreceptor 2) epitheelcellijn voor borstkanker wordt gemaakt van pleurale effusie van een vrouwelijke patiënt met gemetastaseerd mamma-adenocarcinoom44. Cellen vertegenwoordigen een agressieve, invasieve en slecht gedifferentieerde borstkanker.<ol>
<li>Om Groei- en Testmedium voor te bereiden, voegt u 50 ml foetaal runderserum, 10 ml penicilline en streptomycine en 25 ml paardenserum toe aan 500 ml DMEM voor een uiteindelijke concentratie 10% v/v foetaal runderserum, 2% v/v penicilline en streptomycine en 5% v/v paardenserum.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Borst epitheelcelcultuur
<ol><li>Zaad 500.000 MCF10A of MDA-MB-231 cellen in een 10 cm (P100) weefselkweekschaal met 10 ml MCF10A of MDA-MB-231 groeimedia. MCF10A- en MDA-MB-231-cellen bereiken >90% samenvloeiing in 48 uur.</li>
	<li>Om borsteperiële cellen te passeren, eerst cellen wassen met 10 ml warme PBS.</li>
	<li>Maak borsteperiële cellen los door 2 ml van 0,05% Trypsine-EDTA aan de schaal toe te voegen. Plaats de schaal gedurende20-25 minuten in een incubator van 37 °C, 5% CO 2.</li>
	<li>Voeg 5 ml MCF10A of MDA-MB-231 Groeimedium toe aan de ge trypsiniseerde cellen om de trypsine te neutraliseren. Pipetteer het celmediamengsel op en neer om cellen te resuspenderen en celclusters op te breken.</li>
	<li>Voeg de celsuspensie toe aan een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten op 1.200 x g. Adem de supernatant voorzichtig aan en resuspendeer de celkorrel in 5 ml MCF10A of MDA-MB-231 Groeimedium.</li>
	<li>Plaat 1 ml celsuspensie in 5 nieuwe 10 cm weefselkweekschalen samen met MCF10A of MDA-MB-231 Growth Medium. Plaats de gerechten in een incubator van 37 °C, 5% CO2. Cellen zijn klaar om binnen 2-3 dagen weer te worden doorgegang. MCF10A-cellen kunnen worden gehandhaafd tot passagenummer 35, waarna ze morfologische veranderingen vertonen. MDA-MB-231 cellen kunnen worden onderhouden tot passage nummer 24, waarna ze morfologische veranderingen vertonen.</li>
</ol>3. Borst epitheel sferoïde vorming
<ol><li>Vries 200 μL pipetpunten gedurende 30 minuten voordat u met de test begint. Houd de groeifactor reduced matrix oplossing (bijv. Matrigel) (10 mg/ml) gedurende het hele proces in het ijs.</li>
	<li>Pipetteer langzaam 30 μL ijskoude matrixoplossing met ijskoude pipetpunten van 200 μL in elke put van een 8-put kamerschuif. Begin vanaf de zijkanten en sleep de pipetpunt langs de hoeken en voeg een laatste druppel toe aan het midden van de put om een gelijkmatige coating van elke put te garanderen. Vermijd luchtbellen tijdens deze stap om een uniforme matrixoplossingslaag te garanderen. Gebruik nieuwe pipet tips voor elke put.</li>
	<li>Incubate kamer schuift in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 15-20 minuten om de matrixoplossing te polymeriseren.</li>
	<li>Resuspend trypsinized MCF10A cellen in MCF10A Assay Medium bij 200.000 cellen/ml of resuspend trypsinized MDA-MB-231 cellen in MDA-MB-231 Growth Medium bij 200.000 cellen/ml.</li>
	<li>Als u MCF10A-cellen gebruikt, bereidt u verse MCF10A Spheroid Growth Medium voor door 5 μL EFG (20 μg/ml) en 100 μL matrixoplossing toe te voegen aan 5 ml Assay Medium voor een uiteindelijke concentratie van 2% matrixoplossing.</li>
	<li>Verwijder de kamerschuif voorgecoat met matrixoplossing uit de incubator. Voeg 50 μL MCF10A of MDA-MB-231 celsuspensie (10.000 cellen) toe aan elke put. Voeg bij gebruik van MCF10A-cellen 450 μL MCF10A Spheroid Growth Medium toe. Voeg bij gebruik van MDA-MB-231 cellen 450 μL MDA-MB-231 Groeimedium voorgemengd toe met 2% matrixoplossing (9 μL). Plaats de kamerschuif onmiddellijk in een incubator van 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Vervang het medium om de 44 dagen. Pipetteer voorzichtig 200 μL oude media uit één hoek van elke put met behulp van een pipettip van 200 μL. Kantel tijdens dit proces de kamerschuif op 45° om ervoor te zorgen dat de sferoïden niet worden verstoord. Voeg 200 μL vers bereide MCF10A Spheroid Growth Medium of MDA-MB-231 Growth Medium eerder gemengd met 2% matrixoplossing toe aan elke put in de hoek in druppels om ervoor te zorgen dat sferoïden aan de matrixlaag blijven hechten. Slechts ~ 50% van de media wordt vervangen, zodat alle cytokines geproduceerd door de sferoïden niet volledig uitgeput zijn. OPMERKING: MCF10A borst epitheel sferoïden duren tot 8 dagen om te polariseren en holle centra te vormen. MDA-MB-231 borst epitheel sferoïden duren tot 5 dagen om zich te vormen en hebben geen holle centra.</li>
</ol>4. Endotheelcelnetwerkvorming
<ol><li>Menselijke Navelstreng Ader Endotheelcel (HUVEC) Cultuur<ol>
<li>Voeg de inhoud van een enkele Endotheelgroei Medium-2 kit met insuline groeifactor, fibroblast groeifactor, vasculaire endotheel groeifactor, ascorbinezuur, epidermale groeifactor, heparine en gentamicine-amfotericine B, samen met 50 ml foetaal runderserum, 5 ml penicilline-streptomycine en 5 ml glutamine van 200 ml tot 500 ml endotheel basaal medium-2 (EBM-2) om volledig endotheelgroeimedium (EGM-2) te creëren.</li>
		<li>Zaai 500.000 endotheelcellen in een weefselkweekschaal van 10 cm in 10 ml EGM-2. Plaats cellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator totdat ze >80% confluency (ongeveer 48 uur) bereiken.</li>
		<li>Om cellen te passeren, wast u endotheelcellen met 10 ml warme PBS. Maak HUVEC los door 2 ml van 0,05% Trypsin-EDTA toe te voegen aan de weefselkweekschotel van 10 cm. Houd de cellen nauwlettend in de gaten door middel van fasecontrastmicroscopie. Cellen zijn klaar wanneer ze worden dichtgebald, maar blijven aan de schotel bevestigd.</li>
		<li>Haal de trypsine voorzichtig uit het gerecht. Voeg 8 ml EGM-2 toe aan de schaal. Was cellen van de schaal door de EGM-2 op en neer over het hele schoteloppervlak te spuiten.</li>
		<li>U kunt ook 5 ml EGM-2 toevoegen aan de ge trypsiniseerde cellen om de trypsine te neutraliseren. Pipetteer het celmediamengsel op en neer om cellen te resuspenderen en celclusters op te breken. Voeg de celsuspensie toe aan een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten op 1.200 x g. Adem de supernatant voorzichtig aan en resuspendeer de celkorrel in 10 ml EGM-2.</li>
		<li>Voeg 1 ml celsuspensie toe aan 9 ml EGM-2 in een weefselkweekschaal van 10 cm. Plaats de gerechten in een incubator van 37 °C, 5% CO2. Ruil 2/3 van het medium met verse EGM-2 om de 2 dagen. Cellen zijn binnen 3-5 dagen klaar om door te gaan. HUVEC kan worden onderhouden tot passage 8, waarna ze geen netwerken vormen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Endothelial Cell (HUVEC) Netwerkvorming</li>
	<li>Vries 200 μL pipetpunten gedurende 30 minuten voordat u met de test begint. Houd de groeifactor reduced matrix oplossing (10 mg/ml) gedurende het hele proces in het ijs.</li>
	<li>Pipetteer langzaam 30 μL ijskoude matrixoplossing met ijskoude pipetpunten van 200 μL in elke put van een 8-put kamerschuif. Begin vanaf de zijkanten en sleep de pipetpunt langs de hoeken en voeg een laatste druppel toe aan het midden van de put om een gelijkmatige coating van elke put te garanderen. Vermijd luchtbellen tijdens deze stap om een uniforme matrixoplossingslaag te garanderen. Gebruik nieuwe pipet tips voor elke put.</li>
	<li>Incubate kamer schuift in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 15-20 minuten om Matrigel te polymeriseren.<ol>
<li>Bevlek een schaal van 10 cm HUVEC met 10 μL rode cel tracker (1:1000) gedurende 30 minuten in 37 °C, 5% CO2 incubator.</li>
		<li>Was endotheelcellen met 10 ml warme PBS. Maak HUVEC los door 2 ml van 0,05% Trypsin-EDTA toe te voegen aan de weefselkweekschotel van 10 cm. Plaats de schaal in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 5 minuten om de cellen volledig los te maken.</li>
		<li>Voeg 5 ml EGM-2 toe aan het gerecht om de trypsine te neutraliseren. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 25 ml. Centrifugeer HUVEC gedurende 5 minuten op 1.200 x g. Aspirateer het supernatant en resuspendeer de celkorrel in 5 ml serumvrije EBM-2.</li>
		<li>Tel cellen met Trypan blauw om levensvatbare cellen te bepalen. Maak een 1 x 106 cel/ml oplossing.</li>
		<li>Voeg 100.000 HUVEC toe aan elke put met 200 μL serumvrije EBM-2. Als er meer cellen worden toegevoegd, creëren ze een oppervlaktemonolaag in plaats van een buizennetwerk.</li>
		<li>Incubeer HUVEC in een 37 °C, 5% CO2 incubator. Na 6 uur, beeld HUVEC netwerken door fase contrast microscopie. Netwerken zijn nu klaar voor cocultuur met borstsferoïden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Bioprinting Borst epitheel sferoïden op voorgevormde HUVEC Netwerken
OPMERKING: Voor het biofabricatieproces moet een biodepositiesysteem met twee sproeiers worden gebruikt. In dit geval had het systeem drie bewegingsarmen om ruimtelijke controle op micronschaal van materiaaldepositie mogelijk te maken, evenals twee schroefaangedreven motoren om bioink te deponeren van 10 ml spuiten. Het systeem moet worden gefunctionaliseerd met een hoog rendement deeltjesluchtfiltratiesysteem en UV-sterilisatiemogelijkheden om een steriele omgeving te behouden tijdens bioprinting. De bioprinter wordt een uur voor het drukproces UV gesteriliseerd.
<ol><li>Maak borst epitheel sferoïden en HUVEC netwerken zoals eerder beschreven. Schat het aantal borsteptoneelsferoïden in elke put door sferoïden te tellen in representatieve fasecontrastmicroscopiebeelden.</li>
	<li>Snijd 0,5 cm van het uiteinde van een pipettip van 1000 μL. Gebruik de gesneden pipettip om alle sferoïden voorzichtig uit de 8-put kamerschuif en in een buis van 50 ml te spuiten. Resuspend sferoïden in het geselecteerde bioink bij 100 sferoïden/100 μL. OPMERKING: Hogere sferoïdconcentraties kunnen leiden tot clustering van sferoïden en kunnen visualisatie van interacties tussen de sferoïden en de endotheelnetwerken voorkomen.</li>
	<li>Geef het sferoïdmengsel door een celzeef van 70 μm om grote of geclusterde sferoïden te verwijderen.</li>
	<li>Laad de samengevoegde sferoïden in een steriele spuit van 10 ml en sluit deze af met een steriele naald van 25 meter. Bevestig de spuit aan het biodepositiesysteem.</li>
	<li>Aspirateer het medium van de HUVEC-netwerken in de 8-put kamerschuif.</li>
	<li>Extrudeer 100 μL borsteperiële sferoïden op 6 putten van HUVEC-netwerken met een debiet van 1 ml/min. Onderhoud 2 putten van HUVEC-netwerken als besturing.</li>
	<li>Voeg 400 μL MCF10A Spheroid Growth Medium toe als u MCF10A-sferoïden gebruikt die op HUVEC-netwerken zijn afgedrukt of voeg 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium toe dat eerder werd gemengd met 2% matrixoplossing bij gebruik van MDA-MB-231-sferoïden die op HUVEC-netwerken zijn afgedrukt. Het respectieve sferoïde groeimedium moet worden gebruikt in HUVEC-controleputten.</li>
	<li>Incubeer coculturen in een incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 – 96 uur zonder mediaverandering. Coculturen blijven maximaal vier dagen levensvatbaar in het oorspronkelijke medium.</li>
</ol>6. Confocale Microscopie
<ol><li>Immunofluorescentie en PBS-Glycine Wasbufferpreparaat<ol>
<li>Bereid immunofluorescentie (IF) buffer 10x voorraadoplossing door toevoeging van 2,5 g natrium azide, 5 g runderserumalbumine, 10 ml Triton X-100 en 2,05 ml Tween-20 in 500 ml 10x PBS. Pas de pH aan op 7,4. Bewaar de voorraadoplossing tot een jaar bij 4 °C om sedimentatie te voorkomen.</li>
		<li>Creëer een werkende IF-buffer door 50 ml 10x IF-buffer te verdunnen in 450 ml steriel gedeïoniseerd water. Bewaar de werkoplossing maximaal een week op kamertemperatuur.</li>
		<li>Bereid 10x PBS-Glycine buffervoorraadoplossing door 37,5 g glycine toe te voegen aan 500 ml 10x PBS. Pas de pH aan op 7,4. Bewaar de voorraadoplossing tot 6 maanden bij 4 °C om sedimentatie te voorkomen.</li>
		<li>Creëer een werkende PBS-Glycine oplossing door 50 ml 10x PBS-Glycine buffer te verdunnen in 450 ml steriel gedeïoniseerd water. Bewaar de werkoplossing tot een week op 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Label Bioprinted Samples and Image door Confocal Microscopy<ol>
<li>Aspirate medium uit bioprinted 3D coculturen en spoel 3 keer met warme PBS. Fixeer bioprinted 3D coculturen met 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel monsters 3 keer gedurende 20 minuten met 1x PBS-Glycine.</li>
		<li>Blokmonsters met IF-buffer gemengd met 10% geitenserum gedurende 90 minuten (primair blok), gevolgd door 40 minuten met IF-buffer plus 10% geitenserum en Affinipure Fab-fragment (1:100, secundair blok).</li>
		<li>Als u MCF10A-sferoïden gebruikt, etiketteert u monsters met een primair antilichaam voor integrin α6 (1:100) in secundaire blokkeringsbuffer 's nachts bij 4 °C, gevolgd door een Alexa Fluor 488 secundair antilichaam (1:200) en Hoescht 33342 (1:1000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. MCF10A-cellijnen drukken hoge niveaus van integrin α6 uit, wat essentieel is voor het tonen van sferoïde polarisatie en morfologie.</li>
		<li>Als u MDA-MB-231-sferoïden gebruikt, die lage niveaus van integrin α6 uitdrukken, label dan monsters met Alexa Fluor 488 falloidine (1:100) en Hoescht 33342 (1:1000) in secundaire blokkeringsbuffer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Phalloidine maakt actine filamentvisualisatie mogelijk, zodat sferoïde amorfe en invasieve morfologie kan worden beoordeeld.</li>
		<li>Was monsters met 1X PBS-glycine 3 keer gedurende 20 minuten.</li>
		<li>Bereid monsters voor op montage door de kamerschuif te verwijderen met behulp van het gereedschap van de fabrikant. Voeg een kleine druppel antifade-oplossing toe aan elke put. Plaats op elke kamerschuif een afdeklip van 22 mm x 60 mm en sluit de randen voorzichtig af met een heldere nagellak.</li>
		<li>Beeldmonsters met behulp van een confocale microscoop als Z-stapels van ~ 10 plakjes in stappen van 5 μm. Comprimeer indien gewenst Z-vlakken in één vlak met behulp van de opdracht Extended Focus in celbeeldsoftware.</li>
		<li>Kwantificeer sferoïde hechting aan endotheelnetwerken met afbeelding J. Het aantal aangehachtigde sferoïden kan worden gekwantificeerd met behulp van de analyseplugin met de juiste deeltjesgrootte en circulariteit. Normaliseer het aantal gekoppelde sferoïden aan het afbeeldingsgebied.</li>
		<li>Om reproduceerbaarheid te garanderen, kwantificeert u het aantal aangehuwde sferoïden in 4 x 4 betegelde afbeeldingen van coculturen. Als het sferoïde getal statistisch significant lager is dan andere experimenten, moet het experiment worden herhaald.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol is het eerste in zijn soort dat sferoïden bioprint in hun 3D-architectuur voor co-cultuur met endotheelcellen ook in hun 3D-architectuur. Kritieke protocolstappen omvatten de eerste vorming van borsteperiële sferoïden en HUVEC-netwerken. Extreme voorzichtigheid moet worden betracht bij het voeden van epitheelsferoïden, omdat ze gemakkelijk worden verstoord door de matrixoplossing. Evenzo moeten borsteperiële sferoïden met zorg worden behandeld wanneer ze van de matrixoplossing worden gepijpt en in de netwerk...

3D in vitro vasculaire tumormodellen zijn essentiële hulpmiddelen voor mechanistische studie van kankergroei en uitzaaiingen. Met name voor borstkanker organiseren borsteptheelcellen die in Matrigel worden gekweekt zich in gepolariseerde sferoïden die meer lijken op de in vivo mammary acinus-architectuur1,2,3,4,5,6,7,8. 3D borst epitheelcelcultuur beïnvloedt ook celfunctie, met 3D culturen die verschillen in epidermale groeifactor (EGF) receptormodulatietonen 8,9; oncogene functie, met inbegrip van ErbB210; groei en apoptose die11,12signaleren ; en chemotherapieresistentie13,14. Vasculaire endotheelcellen reageren op dezelfde manier anders op omgevingsprikkels in 3D versus traditionele 2D-cultuur15,16,17,18. Veel van het begrip van vasculaire endotheel- en borsteperiële interacties komt echter voort uit de 2D-cultuur met behulp van geconditioneerde medium- of Transwell-inserts, of 3D-modellen waarin de twee celtypen fysiek gescheiden zijn19,20,21,22,23. Deze co-cultuurmodellen bieden beperkt fysiologisch inzicht, omdat zowel 3D-cultuur als celcelcontact van cruciaal belang zijn voor vasculaire endotheel - borsteperiële celinteracties24,25,26.
3D kankermodellen zijn vervaardigd met behulp van een verscheidenheid aan technieken, waaronder hangende druppel sferoïde vorming, bioprinting, magnetische assemblage en cultuur binnen hydrogels of op ontworpen steigers5,27,28,29. Meer recent werden 3D-tumormodellen gemaakt met meerdere celtypen gerangschikt in hun respectieve 3D-structuren. In een voorbeeld van een tumor-op-een-chip platform, kanker, endotheel, entromale cellen werden gemengd in een matrix en vervolgens geïnjecteerd in de drie centrale weefselkamers in een polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat. De weefselkamers werden begrensd door twee buitenste kanalen die een slagader en venule vertegenwoordigden. Na 5-7 dagen cultuur vormden endotheelcellen een microvasculaire netwerk en verspreidden kankercellen zich om kleine tumoren in de buurt van de vasculatuur te vormen. Dit platform werd vervolgens gebruikt om drugs en drugscombinaties te screenen30. Er zijn extra tumor-op-een-chipplatforms gecreëerd om uitzaaiingen en kankertypen te bestuderen met specifieke mechanische stimuli (bijv. mechanische belasting in de longen)31,32. Deze platforms omvatten echter over het algemeen niet zowel vasculatuur als kanker in hun respectieve 3D-structuren.
Biofabrication toont grote belofte in het bevorderen van 3D in vitro vascularized tumormodellen, aangezien het strakke ruimtelijke controle over cellocatie mogelijk maakt. Ondanks de groei van bioprinting in het afgelopen decennium, richten weinig studies zich specifiek optumoren 33,34. In een voorbeeld werd 3D-printen van HeLa-cellen in een gelatine/alginaat/fibrinogeenhydrogel gebruikt om een in vitro baarmoederhalskankermodel te maken. Tumorcellen werden bioprinted als individuele cellen en vervolgens toegestaan om sferoïden te vormen, die een hogere proliferatiesnelheid, verhoogde matrix metalloproteinase expressie en een hogere chemoresistance vertoonden dan cellen in 2D-cultuur35. In deze studies werden, net als in vele andere36,37, gescheiden celsuspensies bioprinted, en vervolgens werden de celculturen voorzien van de vereiste mechanische en biochemische signalen om de cellen in staat te stellen een 3D-structuur te vormen. Cellulaire zelfassemblage kan echter dagen of weken duren, kan complexe ruimtelijke en temporele omgevingssignalen vereisen of kan niet optreden wanneer twee celtypen naast elkaar worden gekweekt. Bijvoorbeeld, borst epitheelcellen geïnduceerde celdood in endotheelcellen in 2D co-cultuur, en dissociated borst epitheelcellen vormden geen 3D sferoïden toen bioprinted in alginaat/gelatine hydrogels38. Dissociated borst epitheel of kankercellen vormden sferoïden in bioinks op basis van alginaat alleen wanneer ze in cirkelvormige PDMS-mallen waren ingesloten. In andere gevallen werden sferoïden gevormd met behulp van hangende druppels in cirkelvormige putplaten met ultralage bevestiging en vervolgens gemengd in bioinks op basis van alginaat39,40.
We beschrijven nu een alternatieve 3D weefsel biomanufacturing methode in dit protocol. In plaats van gedissocieerde cellen te zaaien en te wachten tot deze cellen de 3D-structuren vormen, beschrijven we hoe we 3D-tumorsferoïden op een vasculair buisnetwerk kunnen maken en bioprinten om een tumorcocultuurmodel te creëren dat bijna onmiddellijk kan worden gebruikt. Tumorsferoïden kunnen in vitro worden gekweekt of afkomstig zijn van menselijke weefsels (organoïden). Op dezelfde manier kunnen vasculaire buizen worden gekweekt of kunnen worden afgeleid van adiposeweefsel microvasculaire fragmenten. Bioinks kan variëren van biologisch inactief alginaat tot het zeer biologisch actieve Matrigel41. Aangezien dit 3D tumor co-cultuurmodel met een verscheidenheid van celstructuren en bioinks kan worden gecre ërd, kan het veelvoudige celtypes, extracellulaire matrices, en chemokine gradiënten15,42omvatten. Hoewel in de huidige formulering de endotheelnetwerken niet kunnen worden doordrongend, kunnen toekomstige iteraties deze methode integreren met microfluïden of -on-chip-systemen. Bioprinting 3D borst epitheel sferoïden op endotheelnetwerken maakt snelle biofabrication van menselijke borstmodellen voor drug testen en gepersonaliseerde precisie geneeskunde27.

<table><tbody><tr><td>37&deg;C incubator, 5% CO2 en 95% vochtigheid</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>Cel incubatie</td></tr><tr><td>3D Bio printer</td><td>op maat gemaakt</td><td>Geen</td><td>Gebaat voor bioprinting</td></tr><tr><td>8-well kamer slides</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>53106-306</td><td>voor het zaaien van sferoïden</td></tr><tr><td>25-gauge naald</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>Z192406-100EA</td><td>bioprinting spuitnaald</td></tr><tr><td>Absolute ethanol (200 proof)</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>E7023-500ML</td><td>herstelling van media componenten</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&prime;)2 fragment geiten anti-muis IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115006020</td><td>secundaire blok - Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>Secundaire antilichaam - Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Runder insuline</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>I-035-0.5ML</td><td>MCF10A Media additief</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>A2153-500G</td><td>Blokkeerd agent - Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Falcon 70 &micro;m Cell Strainer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>352350</td><td>Verwijder grote of geclusterde sferoïden</td></tr><tr><td>CellTracker&trade; Red CMTPX Dye</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>C34552</td><td>Pre-stain voor HUVEC buizen</td></tr><tr><td>Compact Centrifuge</td><td>Hermle- Labnet, Edison, NJ</td><td>Z206A</td><td>Voor cel centrifugaties</td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A Media additief</td></tr><tr><td>Conische buizen 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>62406-200</td><td>Verzamelen en hersuspensie van cellen</td></tr><tr><td>Countess II-FL Celteller</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AMQAF1000</td><td>cellen tellen</td></tr><tr><td>Glazen pipetten (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>cel resuspensie</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>11320033</td><td>MCF10A basale media</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 basale media</td></tr><tr><td>Endotheel basaal medium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC basale media</td></tr><tr><td>Endotheel groei medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3162</td><td>Begaat met een Bulletkit (bevattende groeifactoren)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>Labeling MDA-MB-231 sferoïden</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Cytiva, Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>HUVEC/MDA-MB-231 media additief</td></tr><tr><td>Geiten serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16210064</td><td>Immunofluorescence labeling component</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>G8898-500G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>Kernvlek immunofluorescence</td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16050130</td><td>MCF10A Media additief</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>H0888-5G</td><td>MCF10A Media additief</td></tr><tr><td>Menselijke umbilicale vene endotheliale cellen (HUVECs)</td><td>Cel toepassingen, San Diego, CA</td><td>200-05f</td><td>Endotheel cel lijnen</td></tr><tr><td>Integrine &alpha;6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>Immunofluorescence sferoïde labeling component</td></tr><tr><td>Live Dead assay</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>L3224</td><td>Live en dode cel stain assay voor cel levensvatbaarheid</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocale microscoop</td><td>Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>Gebaat om cellen te visualiseren</td></tr><tr><td>Matrigel - growth factor gereduceerd 10 mg/ml</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>Sferoïde vorming</td></tr><tr><td>MCF10A cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>Borstcel lijn</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Borstcel lijn</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>158127-500G</td><td>cel fixatief</td></tr><tr><td>Penicilline en streptomycine</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additief</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde saline 1X (PBS)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>7001106</td><td>Was buffer voor cellen voor trypsinisatie</td></tr><tr><td>Fosfaat buffer saline 10X</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AM9625</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>P36934</td><td>immunofluorescence bevestigingsmiddel</td></tr><tr><td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A/ assay media component</td></tr><tr><td>Natrium Azide</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>S2002-25G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Steriele spuit (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>75846-757</td><td>bioprinting proces</td></tr><tr><td>Weefsel kweek schaal (10cm)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25382-166</td><td>monolayer cel kweek</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>T8787-250ML</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Trypan blauw 0.4%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>celteller additief</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td>cel losmaking</td></tr><tr><td>Tween -20</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>85113</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Vasculair Endotheel Groei Factor (VEGF165)</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>HUVEC buis additief</td></tr><tr><td>Volocity 6.3 cel beeldvormingssoftware</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z stack compressor</td></tr></tbody></table>

directe bioprinting van 3d-meercellige borstsferoïden op endotheelnetwerken

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting ontpopt zich als een veelbelovend hulpmiddel om 3D-menselijke kankermodellen te fabriceren die kritieke kenmerken van in vivo weefselarchitectuur beter samenvatten. In de huidige laag-voor-laag extrusie bioprinting worden individuele cellen geëxtrudeerd in een bioink samen met complexe ruimtelijke en temporele signalen om hiërarchische weefsel zelfassemblage te bevorderen. Deze biofabricatietechniek is echter gebaseerd op complexe interacties tussen cellen, bioinks en biochemische en biofysische signalen. Zelfassemblage kan dus dagen of zelfs weken duren, kan specifieke bioinks vereisen en kan niet altijd optreden wanneer er meer dan één celtype bij betrokken is. Daarom ontwikkelden we een techniek om voorgevormde 3D borsteperiële sferoïden direct te bioprinten in een verscheidenheid aan bioinks. Bioprinted voorgevormde 3D borst epitheel sferoïden hielden hun levensvatbaarheid en gepolariseerde architectuur na het afdrukken. We hebben bovendien de 3D-sferoïden geprint op vasculaire endotheelcelnetwerken om een co-cultuurmodel te creëren. Zo creëert de nieuwe bioprintingtechniek snel een meer fysiologisch relevant 3D-menselijk borstmodel tegen lagere kosten en met een hogere flexibiliteit dan traditionele bioprintingtechnieken. Deze veelzijdige bioprinttechniek kan worden geëxtrapoleerd om 3D-modellen van andere weefsels in extra bioinks te maken.

Borsteperiële cellen moeten zichzelf organiseren in 3D-sferoïden na 5-8 dagen cultuur op matrixoplossing en in kweekmedium met 2% matrixoplossing. Niet-tumorigeen mcf10a borst epitheel sferoïden moeten rond lijken en hebben een hol centrum, met integrin α6 gepolariseerd aan de buitenste rand van de sferoïde(figuur 1, inzet toont holle centra). Zeer invasieve MDA-MB-231 epitheelcellen van borstkanker vormen onregelmatige sferoïden. Sferoïden moeten worden gebruikt wanneer ze een diameter van ...

Het doel van dit protocol is om borsteptheelcellen rechtstreeks bioprinten als meercellige sferoïden op voorgevormde endotheelnetwerken om snel 3D-borst-endotheel co-cultuurmodellen te creëren die kunnen worden gebruikt voor geneesmiddelenscreeningsstudies.

Directe bioprinting van 3D-meercellige borstsferoïden op endotheelnetwerken

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Ons protocol vergemakkelijkt het afdrukken van voorgevormde 3D-cellulaire structuren zoals borstpiteelsferoïden waardoor de snelle vorming van biologisch relevante modellen en een verscheidenheid aan bio-inkten mogelijk wordt. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de bioprinting van 3D-tumorsferoïden op een vaatnetwerk mogelijk maakt dat bijna onmiddellijk kan worden gebruikt voor elk experimenteel onderzoek. Deze 3D biogedrukte weefselmodellen bieden een snel in vitro platform dat kan worden uitgebreid voor gepersonaliseerde precisiegeneeskunde.Deze zeer veelzijdige 3D-bioprintingmethode kan worden toegepast op andere fysiologische systemen waarin 3D-interacties met de vaatwand belangrijk zijn. Voor de vorming van borstpiteelsferoïden, bevriest u eerst 200 microliter pipettenpunten gedurende 30 minuten en plaatst u de groeifactor gereduceerde matrixoplossing op ijs. Wanneer de punten bevroren zijn, gebruikt u voor elke put van een achtputten kamerschijfvinger een nieuw ijskoud pipettenpunt en voegt u 30 microliter van de ijskoude matrixoplossing toe aan de zijkant en langs de hoeken van elke put van een achtputten kamerschijfvinger, en voegt u een laatste druppel toe aan het centrum om een gelijkmatige coating te garanderen.Wanneer alle putten zijn gecoat, incubeer de schijf gedurende 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Terwijl de matrix aan het polymeriseren is, schorst u MCF 10A cellen op in MCF 10A assaymedium bij een twee keer 10 tot de vijf cellen per milliliter concentratie. Aan het einde van de incubatie, voegt u 50 microliter cellen en 450 microliter MCF 10A sferoïdgroeimedium toe aan elke put en brengt u de schijf onmiddellijk terug naar de incubator.Elke vier dagen, kantelt u de kamerschijfvinger naar een hoek van 45 graden om 200 microliter supernatanten te vervangen door vers sferoïdgroeimedium per put. Voor de vorming van een HUVEC netwerk, bereidt u een matrixoplossing gecoate achtputten kamerschijfvinger zoals aangetoond en pre-kleurt u een 10 centimeter schaal van HUVECs met 10 microliter rode celtracker dye gedurende 30 minuten in de celcultuur incubator. Aan het einde van de incubatie, wast u de endotheelcellen met 10 milliliter warm PBS voordat u ze behandelt met twee milliliter van 0,05% trypsine EDTA.Na vijf minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, neutraliseert u de trypsine met vijf milliliter endotheelgroeimedium twee en brengt u de cellen over naar een 25 milliliter conische buis voor centrifugatie. Schropt u het pellet op in vijf milliliter serumvrij endotheel basaal medium twee voor het tellen en verdunt u de cellen tot een een keer 10 tot de zes cellen per milliliter concentratie. Voeg dan een keer 10 tot de vijf HUVECs toe aan elke put en plaats de plaat in de celcultuur incubator gedurende zes uur.Na vijf tot acht dagen van cultuur, telt u het aantal sferoïds in elke put in representatieve fasecontrast microscopie beelden en gebruikt u een 1.000 microliter pipettenpunt met de laatste 0,5 centimeter van de punt verwijderd om voorzichtig alle sferoïds uit elke put van de achtputten kamerschijfvinger te verzamelen in een 50 microliter buis. Schropt u sferoïds op in een geschikte bio-ink bij een concentratie van 100 sferoïds per 100 microliter inkt en laadt u de gepoolde sferoïds in een 10 milliliter steriele spuit. Rust de spuit uit met een 25 gauge steriele naald en bevestig de spuit aan het biodepositiesysteem.Verwijder het medium uit elke put van het HUVEC netwerk en extrudeert u 100 microliter borstpiteelsferoïden in elk van de zes putten van de HUVEC netwerk kamerschijfvinger bij een stroomsnelheid van één milliliter sferoïds per minuut. Voeg dan 400 microliter MCF 10A sferoïdgroeimedium toe aan elke put en plaats de co-cultures in de celcultuur incubator gedurende 24 tot 96 uur. Na vijf tot acht dagen van cultuur zoals aangetoond, moeten niet-tumorigene MCF 10A borstpiteelsferoïden rond verschijnen met een hol centrum met Integrine alpha-6 gepolariseerd naar de buitenrand van de sferoïd.Het belangrijkste om te onthouden tijdens het uitvoeren van dit protocol is om voorzichtig met de sferoïds om te gaan voordat u gaat printen om clustering te voorkomen. Na bioprinting en co-cultuur kunnen tumorcelviabiliteit, proliferatie, migratie en andere biochemische interacties met het endotheelnetwerk worden gemeten met en zonder een farmacologische behandeling. we hebben aangetoond dat medicijntesten al twee uur na co-cultuur bioprinting kunnen worden gestart en hebben de toevoeging van sferoïds aan endotheelnetwerken getest met het antikankermiddel paclitaxel.

direct-bioprinting-3d-multicellular-breast-spheroids-onto-endothelial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video explains the 3D magnetic bioprinting of co-cultured pancreatic cancer cells and fibroblasts. Pancreatic cancer cells and activated pancreatic fibroblast cells are co-cultured and magnetized using a biocompatible nanoparticle assembly, to generate spheroids, under the influence of magnetic forces.

Magnetically Bioprinted 3D Spheroid Co-cultures: A Method for Co-culturing Cancerous Cells and Fibroblasts

Een Cartesische bioprinter werd ontworpen en gemaakt om multi-materiaal depositie in nauwkeurige, reproduceerbare geometrieën mogelijk te maken, terwijl ook controle van omgevingsfactoren wordt toegestaan. Met behulp van de driedimensionale bioprinter kunnen complexe en levensvatbare constructies worden afgedrukt en gemakkelijk worden gereproduceerd.

Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer

Dit protocol beschrijft 3D bioprinting van hartweefsel zonder het gebruik van biomaterialen. 3D bioprinted cardiac patches vertonen mechanische integratie van component sferoïden en zijn zeer veelbelovend in hartweefselregeneratie en als 3D-modellen van hart-en vaatziekten.

Het creëren van cardiale weefsels die mechanische integratie van sferoïden tonen met behulp van 3D bioprinting

Wij bieden een veralgemeende protocol gebaseerd op een strategie van de bioprinting microfluidic voor een vezelige vasculaire bed, waar een secundaire celtype verder zou kunnen worden uitgezaaid in de interstitiële ruimte van deze vezelige structuur voor het genereren van gevacuoliseerd weefsels en organoids engineering.

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Het protocol wordt beschreven hoe een perfusable vasculaire netwerk in een sferoïde ingenieur. Van de sferoïde omliggende communicatie is bedacht om te induceren angiogenese en de sferoïde verbinden met de microchannels in een microfluidic apparaat. De methode staat de perfusie van het sferoïde, die een langverwachte techniek in driedimensionale culturen is.

Perfusable vasculaire netwerk met een Model van het weefsel in een Microfluidic-apparaat

Wij ontwikkeld een heterogene borst kanker model bestaande uit vereeuwigd tumor en fibroblast cellen ingebed in een bioprintable alginaat/gelatine bioink. Het model recapituleert de tumor in vivo communicatie en vergemakkelijkt de vorming van meercellige tumor spheroïden, inzicht in de mechanismen van tumorvorming rijden oplevert.

Bioprintable alginaat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemen induceren sferoïde celvorming

Gepresenteerd hier is een eenvoudig te gebruiken, Core/shell, driedimensionale bioprinten set-up voor één stap fabricage van holle steigers, geschikt voor weefsel engineering van vasculaire en andere buisvormige structuren.

Kern/shell druk steigers voor weefsel engineering van buisvormige constructies

Kruisverwijzing tussen borstepitheelcellen en endotheelcellen draagt belangrijk bij aan de progressie van borstkanker, tumorgroei en metastase. In deze studie zijn sferoïden gemaakt van borstkankercellen samen met vasculaire en / of lymfatische endotheelcellen en tonen hun toepasbaarheid aan als een in vitro systeem voor borstkankeronderzoek.

Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel in vitro model voor borstkankeronderzoek

Ontworpen flappen vereisen een geïntegreerd functioneel vasculair netwerk. In dit protocol presenteren we een methode voor het fabriceren van een 3D-geprinte weefselflap met een hiërarchisch vasculair netwerk en de directe microchirurgische anastomosen naar de dijbeenslagader van ratten.

Fabricage van engineered vasculaire flappen met behulp van 3D-printtechnologieën

We presenteren een protocol voor high-throughput productie van vasculaire kanalen met flexibele afmetingen en gewenste patronen op een standaard plaat met zes putjes met behulp van 3D-bioprinttechnologie, ook wel vessels-on-a-plate (VOP) genoemd. Dit platform heeft het potentieel om de ontwikkeling van therapieën voor de aandoeningen die verband houden met gecompromitteerd endotheel te bevorderen.

High-throughput bioprinting-methode voor het modelleren van vasculaire permeabiliteit in standaard zeswellsplaten met maat- en patroonflexibiliteit

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Leer bioprinting van borstspheroïden op endotheelnetwerken voor 3D weefselmodellen. Deze methode versnelt drugsonderzoek en biedt een snel platform voor gepersonaliseerde geneeskunde.

Directe bioprinting van 3D-meercellige borstsferoïden op endotheelnetwerken

Meer video's verkennen