Name: Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Leer peptidoglycaan-analyse met vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica. Deze methode verhoogt de nauwkeurigheid en vermindert de werklast bij het bestuderen van bacteriële celprocessen en antimicrobiële resistentie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Dr. Jennifer Geddes-McAlister en Dr. Anthony Clarke bedanken voor hun bijdragen aan het verfijnen van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies van CIHR toegekend aan C.M.K (PJT 156111) en een NSERC Alexander Graham Bell CGS D toegekend aan E.M.A. Cijfers werden gemaakt op BioRender.com.

<ol><li>Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+structure+and+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan structure and architecture.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).</li>
<li>Pazos, M., Peters, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan.</a> Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).</li>
<li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+regulation+of+peptidoglycan+synthesis+to+bacterial+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology.</a> Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).</li>
<li>Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+strategies+to+preserve+cell+wall+integrity+against+environmental+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2064(2018).</li>
<li>Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+pathogenic+staphylococci+so+lysozyme+resistant%3F+The+peptidoglycan+O-acetyltransferase+OatA+is+the+major+determinant+for+lysozyme+resistance+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).</li>
<li>Brott, A. S., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+O-acetylation+as+a+virulence+factor%3A+its+effect+on+lysozyme+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system.</a> Antibiotics. 8 (3), 94(2019).</li>
<li>Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+assay+for+D-Ala-D-Lac%3A+A+key+intermediate+for+vancomycin+resistance+in+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci.</a> Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).</li>
<li>Arthur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vivo+incorporation+of+D-lactate+into+peptidoglycan+precursors+of+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).</li>
<li>Mardarowicz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolierung+und+Charakterisierung+des+Murein-Sacculus+von+Brucella%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Naturforsdig%22%5BJournal%5D)">Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella.</a> Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The composition of the murein of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).</li>
<li>Glauner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+quantification+of+muropeptides+with+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).</li>
<li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycomics+reveals+compositional+changes+in+peptidoglycan+between+biofilm-+and+planktonic-derived+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).</li>
<li>van der Aart, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+the+peptidoglycan+composition+in+Streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290(2018).</li>
<li>Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+automated+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).</li>
<li>Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+the+enzymes+catalyzing+the+O-acetylation+of+bacterial+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides.</a> Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).</li>
<li>Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+analysis+of+peptidoglycan+by+high-performance+anion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).</li>
<li>Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sodium+dodecyl+sulfate+in+microliter-volume+biochemical+samples+by+visible+light+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy.</a> Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).</li>
<li>Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+fragmentation+of+Escherichia+coli+sacculi+by+sonication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication.</a> Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+false+discovery+rate%3A+A+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%3A+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+in+untargeted+metabolomics%3A+state+of+the+art+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23(2015).</li>
<li>Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+and+modeling+of+mass+spectrometry-based+metabolomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1D+and+2D+annotation+enrichment%3A+a+statistical+method+integrating+quantitative+proteomics+with+complementary+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).</li>
<li>Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+biosynthesis+by+desleucyl-oritavancin%3A+A+quantitative+peptidoglycan+composition+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278(2017).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+pattern+of+the+murein+sacculus+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).</li>
<li>Espaillat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemometric+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+reveals+atypical+modifications+that+empower+the+cell+wall+against+predatory+enzymes+and+fly+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).</li>
<li>Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+peptidoglycan+structural+parameters+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).</li>
<li>Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+structural+divergence+among+Thermus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Cell wall structural divergence among Thermus spp.</a> FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).</li>
<li>Torrens, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+peptidoglycans+from+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+recovered+from+chronic+and+acute+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 0868(2019).</li>
<li>Antignac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+analysis+of+the+peptidoglycan+of+the+human+pathogen+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).</li>
<li>De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+composition+of+a+highly+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+strain.+The+role+of+penicillin+binding+protein+2A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muropeptides+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+their+role+as+elicitors+of+%CE%B2-lactam-antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).</li>
<li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan Structure.</a> Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).</li>
<li>Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+of+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dit protocol beschrijft een methode om peptidoglycaan uit bacterieculturen te zuiveren, te verwerken voor LC-MS-detectie en de samenstelling te analyseren met behulp van bio-informaticatechnieken. Hier richten we ons op Gram-negatieve bacteriën en zal een kleine aanpassing nodig zijn om analyse van Gram-positieve bacteriën mogelijk te maken.
De bereiding van muropeptiden is vrijwel hetzelfde gebleven sinds het voor het eerst werd geproduceerd in de jaren 1960 9,11,15.<s...

Peptidoglycan (PG) is een bepalend kenmerk van bacteriën dat dient om de celmorfologie te behouden, terwijl het structurele ondersteuning biedt voor eiwitten en andere cellulaire componenten 1,2. De ruggengraat van PG bestaat uit afwisselend β-1,4-gebonden N-acetyl muramic acid (MurNAc) en N-acetyl glucosamine (GlcNAc)1,2. Elke MurNAc bezit een kort peptide gebonden aan het ᴅ-lactylresidu dat kan worden gekruist met aangrenzende disacharide-gekoppelde peptiden (figuur 1A,B). Deze crosslinking produceert een mesh-achtige structuur die de hele cel omvat en vaak een sacculus wordt genoemd (figuur 1C). Tijdens PG-synthese worden voorlopers gegenereerd in het cytoplasma en door flippasen over het cytoplasmamembraan getransporteerd. Voorlopers worden vervolgens opgenomen in de volwassen PG door transglycosylase en transpeptidase-enzymen, die respectievelijk de glycosidische en peptidebindingen produceren3. Eenmaal geassembleerd, zijn er echter tal van enzymen geproduceerd door de bacteriën die de PG wijzigen en / of afbreken om een aantal cellulaire processen uit te voeren, waaronder groei en deling. Bovendien is aangetoond dat verschillende modificaties van de PG aanpassingen geven die specifiek zijn voor de stam, groeiomstandigheden en omgevingsstress, die betrokken zijn bij celsignalering, antimicrobiële resistentie en immuunontwijking van de gastheer4. Een veel voorkomende modificatie is bijvoorbeeld de toevoeging van een C6-acetylgroep op de MurNAc die resistentie verleent door de toegang tot de glycaan-β-1,4-bindingen te beperken tot door de gastheer geproduceerde lysozymenzymen die PG 4,5,6 afbreken. Bij Enterokokken verleent substitutie van de terminale ᴅ-Ala van de peptide-sidechain door ᴅ-Lac een grotere resistentie tegen de antimicrobiële vancomycine 7,8.
De algemene procedure voor PG-isolatie en -zuivering is relatief ongewijzigd gebleven sinds deze in de jaren 1960 werd beschreven9. Bacteriële membranen worden opgelost door warmtebehandeling met SDS, gevolgd door enzymatische verwijdering van gebonden eiwitten, glycolipiden en overblijvend DNA. De gezuiverde intacte sacculus kan vervolgens worden verteerd tot de afzonderlijke componenten door hydrolyse van de β-1,4 koppeling tussen GlcNAc en MurNAc. Deze vertering produceert GlcNAc-MurNAc-disachariden met intacte structurele wijzigingen en/of crosslinks en worden muropeptiden genoemd (figuur 1B).
Compositieanalyse van PG werd aanvankelijk uitgevoerd door middel van hogedrukvloeistofchromatografische scheiding (HPLC) om elk muropeptide te zuiveren, gevolgd door handmatige identificatie van muropeptiden10,11. Dit is sindsdien vervangen door vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS), die de detectiegevoeligheid verhoogt en de handmatige werklast van het zuiveren van elk individueel muropeptide vermindert. De tijdrovende en complexe aard van de handmatige identificatie van muropeptiden is echter een beperkende factor gebleven, waardoor het aantal uitgevoerde studies is afgenomen. In de afgelopen jaren met de opkomst van "omic" -technologieën, is geautomatiseerde LC-MS-functie-extractie een krachtig hulpmiddel geworden, waardoor snelle detectie en identificatie van individuele verbindingen in complexe monsters uit zeer grote datasets mogelijk is. Zodra de kenmerken zijn geïdentificeerd, vergelijkt bioinformatische software statistisch de variatie tussen monsters met behulp van differentiële analyse, waarbij zelfs minimale verschillen tussen de complexe dataset worden geïsoleerd en grafisch aan de gebruiker worden weergegeven. De toepassing van feature extraction software voor de analyse van PG samenstelling is nog maar net begonnen te worden onderzocht 12,13,14 en gekoppeld aan bioinformatica analyse 12. In tegenstelling tot proteomische analyse, die profiteert van de direct beschikbare eiwitdatabases die peptidefragmentatie voorspellen, waardoor volledig geautomatiseerde identificatie mogelijk is, bestaat er momenteel geen fragmentatiebibliotheek voor peptidoglycomics. Functie-extractie kan echter worden gekoppeld aan bekende en voorspelde structurele databases om muropeptide-identificatie te voorspellen12. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van LC-MS-gebaseerde functie-extractie in combinatie met een muropeptidebibliotheek voor geautomatiseerde identificatie en bioinformatische differentiële analyse van PG-samenstelling (figuur 2).

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 &micro;m)</td><td>Agilent</td><td></td><td>LC-MS data acquisitie</td></tr><tr><td>Heating mantle controller, Optichem</td><td>Fisher</td><td>50-401-788</td><td>voor 4% SDS boil</td></tr><tr><td>Heating Mantle, 1000mL Hemispherical</td><td>Fisher</td><td>CG1000008</td><td>voor 4% SDS boil</td></tr><tr><td>Incubator, 37&deg;C</td><td></td><td></td><td>voor sacculi zuivering en MS monster voorbereiding</td></tr><tr><td>Leibig condenser, 300MM 24/40,</td><td>Fisher</td><td>CG121805</td><td>voor 4% SDS boil</td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td></td><td>voor lyofilisatie van sacculi</td></tr><tr><td>Magentic stirrer</td><td>Fisher</td><td>90-691-18</td><td>voor 4% SDS boil</td></tr><tr><td>mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530</td><td>Aglient</td><td></td><td>LC-MS data acquisitie</td></tr><tr><td>microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 &micro;m</td><td>Fisher</td><td>50-197-9573</td><td>reiniging van monster voor MS injectie</td></tr><tr><td>Retort stand</td><td>Fisher</td><td>12-000-102</td><td>voor 4% SDS boil</td></tr><tr><td>Retort clamp</td><td>Fisher</td><td>S02629</td><td>voor 4% SDS boil</td></tr><tr><td>round bottom flask - 1 liter pyrex</td><td>Fisher</td><td>07-250-084</td><td>voor 4% SDS boil</td></tr><tr><td>Sonicator model 120</td><td>Fisher</td><td>FB120</td><td>voor sacculi zuivering</td></tr><tr><td>Sonicator - micro tip</td><td>Fisher</td><td>FB4422</td><td>voor sacculi zuivering</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td></td><td>sacculi was stappen</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge bottles, Ti45</td><td>Fisher</td><td>NC9691797</td><td>sacculi was stappen</td></tr><tr><td>Water supply</td><td>City</td><td></td><td>voor water gekoelde condenser</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemdraw</td><td>Cambridgesoft</td><td></td><td>moleculaire editor voor muropeptide fragmentatie voorspelling</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>weergave van lijsten van geannoteerd muropeptide, abundantie, isotopische patronen, enz.</td></tr><tr><td>MassHunter Acquisition</td><td>Aglient</td><td></td><td>het uitvoeren van QTOF instrument</td></tr><tr><td>MassHunter Mass Profiler Professional</td><td>Aglient</td><td></td><td>bioinformatica differentiële analyse</td></tr><tr><td>MassHunter Personal Compound Database and Library Manager</td><td>Aglient</td><td></td><td>muropeptide m/z MS database</td></tr><tr><td>MassHunter Profinder</td><td>Aglient</td><td></td><td>recursieve functie extractie</td></tr><tr><td>MassHunter Qualitative analysis</td><td>Aglient</td><td></td><td>weergave van MS en MS/MS chromatogrammen</td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>grafiek software</td></tr><tr><td>Perseus</td><td>Max Plank Institute of Biochemistry</td><td></td><td>1D annotatie</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Fisher</td><td>A637</td><td></td></tr><tr><td>Amylase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6380</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Fisher</td><td>BP168-1</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27001-500ML-R</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS tuning mix - HP0321</td><td>Agilent</td><td>G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen gas (>99% zuiverheid)</td><td>Praxair</td><td>NI 5.0UH-T</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid</td><td>Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Pronase E from Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>S0489</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452890</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate (dibasic)</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate (monobasic)</td><td>Fisher</td><td>S369</td><td></td></tr><tr><td>Stains-all</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9379</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is een belangrijk onderdeel van bacteriële celwanden en een gemeenschappelijk cellulair doelwit voor antimicrobiële stoffen. Hoewel aspecten van de peptidoglycaanstructuur redelijk bewaard zijn gebleven in alle bacteriën, is er ook een aanzienlijke variatie tussen Gram-positieven / negatieven en tussen soorten. Daarnaast zijn er tal van variaties, modificaties of aanpassingen aan de peptidoglycaan bekend die binnen een bacteriesoort kunnen optreden als reactie op groeifase en/of omgevingsprikkels. Deze variaties produceren een zeer dynamische structuur waarvan bekend is dat deze deelneemt aan vele cellulaire functies, waaronder groei / deling, antibioticaresistentie en het vermijden van gastheerverdediging. Om de variatie binnen peptidoglycaan te begrijpen, moet de algehele structuur worden opgesplitst in zijn constitutieve delen (bekend als muropeptiden) en worden beoordeeld op algemene cellulaire samenstelling. Peptidoglycomics maakt gebruik van geavanceerde massaspectrometrie in combinatie met krachtige bioinformatische data-analyse om de peptidoglycaansamenstelling in detail te onderzoeken. Het volgende protocol beschrijft de zuivering van peptidoglycaan uit bacterieculturen, de verwerving van muropeptide-intensiteitsgegevens via een vloeistofchromatograaf-massaspectrometer en de differentiële analyse van peptidoglycaansamenstelling met behulp van bio-informatica.

De verhoogde detectiegevoeligheid van MS-machines in combinatie met krachtige piekherkenningssoftware heeft de mogelijkheid verbeterd om stofsamenstellingen van complexe monsters tot in de kleinste details te isoleren, te bewaken en te analyseren. Met behulp van deze technologische vooruitgang zijn recente studies over de samenstelling van peptidoglycaan begonnen met het gebruik van geautomatiseerde LC-MS-functie-extractietechnieken 12,13,14,24 ten opzichte van oudere HPLC-gebaseerde methodologie<...

Dit protocol omvat een gedetailleerde analyse van de peptidoglycaansamenstelling met behulp van vloeistofchromatografie massaspectrometrie in combinatie met geavanceerde functie-extractie en bio-informatica-analysesoftware.

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Peptoglycomics maakt gebruik van geavanceerde massaspectrometrie gecombineerd met krachtige bio-informatica gegevensanalyse om de samenstelling van peptidoglycan in detail te onderzoeken. Het gebruik van bio-informatica algoritmen maakt het mogelijk om massaspectrometrische gegevens tegelijkertijd te analyseren, extraheren en vergelijken over een verzameling gegevensbestanden, waardoor de werklast wordt verminderd en de nauwkeurigheid wordt verhoogd. Het begrijpen van de verschillende variaties en modificaties van peptidoglycan heeft implicaties voor het begrijpen van cellulaire processen, inclusief groei en deling, immuunevasie van de gastheer en antimicrobiële resistentie.We bevelen aan om eerst een kleine subset van monsters voor te bereiden en te analyseren om vertrouwd te raken met het protocol en als pilotproject om de experimentele parameters te beoordelen. Aangezien massaspectrometrie gegevensanalyse software vaak varieert in de definities die worden gebruikt bij het beschrijven van functies en kenmerken, zal visuele demonstratie gebruikers helpen om dit protocol toe te passen op verschillende platforms. Voor extractie van peptidoglycan sacculi, resuspendeer bevroren cel pellets op ongeveer een tot 10 van het oorspronkelijke kweekvolume in 20 millimolair natriumfosfaat bij vier graden Celsius voordat u de cel suspensie druppelsgewijs toevoegt aan kokend 8%SDS in 20 millimolair natriumfosfaat tot een eindvolume van één op één.Houd een zachte kook aan gedurende 30 minuten tot drie uur met roeren om volledige membraandeassociatie te verzekeren. De resulterende mix moet volledig helder zijn zonder resterende celklompjes of viscositeit. Wanneer de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, verzamel de sacculi door ultracentrifugering, gevolgd door vijf tot zeven wasbeurten in ongeveer 50 milliliter kamertemperatuur 20 millimolair natriumfosfaat per was tot de was buffer een SDS concentratie heeft van ongeveer 0,001% zoals bepaald door colorimetrische kleurstof.Na de laatste was, resuspendeer de sacculi in 5 tot 10 milliliter kamertemperatuur 20 millimolair natriumfosfaat en vul het monster aan met 50 microgram per milliliter amylase, DNase en RNase in 10 millimolair magnesiumsulfaat voor een incubatie van een uur met agitatie of nutatie bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, verteer de reactie een nacht met 100 microgram per milliliter pronase bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend na ultracentrifugering, kook het monster een uur in 25 milliliter 2%SDS en 20 millimolair natriumfosfaat in een stoomboot.Aan het einde van de incubatie, was het monster vijf tot zeven keer met 50 milliliter kamertemperatuur twee keer gedestilleerd water zoals gedemonstreerd. Wanneer de SDS concentratie ongeveer 0,001% bereikt, resuspendeer de pellet in een voldoende hoeveelheid twee keer gedestilleerd water om een sacculi suspensie te verkrijgen en was de container. Na overnacht opslag bij min 80 graden Celsius, liofiliseer het bevroren monster voordat u de sacculi verdunt tot een 10 milligram peptidoglycan per milliliter twee keer gedestilleerd water concentratie.Voor LC-MS analyse, start een nieuw project in de instrumentsoftware en wijs de geschikte LC-MS QTOF gegevensbestanden toe aan de experimentele conditie van belang. Voer de gegevensverwerking wizard batch recursieve functie-extractie uit en stel de gegevensverwerkingsfilters in om overeen te komen met de parameters van de LC-MS condities en instrumentatie om groepen nauwkeurig te identificeren en mass-to-charge pieken te verifiëren die individuele muropeptiden vertegenwoordigen. Bekijk de resultaten aan het einde van de functie-extractie.Als een aanzienlijk aantal functies niet in een groep kon worden gealigneerd, pas dan de recursieve filterparameters aan om de detectievenster te verbreden of beperken zoals nodig. Exporteer vervolgens de gegevens als een compound uitwisselingsbestand. Voor differentiële spectrale functie-analyse, start een nieuw project in het systeemsoftware en volg de instructies voor gegevensimport.Tijdens de gegevensanalyse, selecteer de significantie en fold change voor differentiële analyse en stel de basislijngegevens in op de mediane intensiteit over alle gegevensbestanden. Zodra de analyse is voltooid, bekijk de resulterende grafische en statistische analyses om muropeptiden te identificeren die een significante verandering in abundantie tussen de geteste experimentele condities aantonen. Onder de projectnavigator, klik rechts op de verschillende analyses en selecteer een export optie om de functie details als een tsv bestand op te slaan.Zorg ervoor om meerdere analyses op te slaan om alle relevante gegevens te verkrijgen. Binnen de differentiële analyse software, onder resultaten interpretatie, selecteer ID browser, voeg een bibliotheek van verwachte muropeptide structuren toe en selecteer vergelijkbare parameters als gedemonstreerd voor de functie-extractie om een voorspelde muropeptide annotatie voor elke geïdentificeerde functie te produceren. Om de voorspelde muropeptide annotatie handmatig te bevestigen, vergelijk de mass-to-charge ratio pieken van het tandem massaspectrometrie chromatogram met de voorspelde mass-to-charge ratio van alle mogelijke fragmentaties van een bekende muropeptide structuur.Gebruik een moleculaire editor om de voorspelde muropeptide structuur te tekenen met behulp van de massa fragmentatie tool om de mass-to-charge ratio van de massaspectrometrie fragmenten te tonen wanneer elke binding individueel of in combinatie wordt gebroken, vervolgens vergelijk alle mogelijke fragmentaties van de muropeptide structuur met het tandem massaspectrometrie chromatogram. Om de muropeptide annotatie te bevestigen, moeten de mass-to-charge ratio pieken van meerdere fragmenten worden gevonden in het tandem massaspectrometrie chromatogram met een zeer minimale mass-to-charge ratio uitlijningsvenster. Om de globale veranderingen in muropeptide modificaties te beoordelen, bewerk het tsv bestand van de statistisch significante hoge fold change muropeptiden om een enkele kolom voor elke muropeptide modificatie toe te voegen.Vul deze kolom met een aanduiding voor elke geannoteerd muropeptide en upload het gewijzigde tsv bestand naar Perseus. Onder annoteer rijen, klik categorisch op annoteer rijen en voeg gegevensbestanden toe aan elke experimentele parameter. Klik vervolgens onder test op twee steekproef tests om een student's T test uit te voeren en klik 1D om 1D annotatie uit te voeren.Een verhoogde detectiesensitiviteit van massaspectrometrie machines gekoppeld aan krachtige piek herkenningssoftware heeft het vermogen verbeterd om stofsamenstellingen van complexe monsters in zeer

semi-quantitative-analysis-peptidoglycan-liquid-chromatography-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Rekening houdend met speeksel bemonstering voor toekomstige klinische toepassing, is een lolly-achtige ultrafiltratie (LLUF) probe gemaakt om te passen in de menselijke mondholte. Directe analyse van onverteerd speeksel door nanoLC-LTQ massaspectrometrie werd aangetoond dat LLUF sondes om grote eiwitten en een hoge overvloed eiwitten te verwijderen, en maak een lage overvloedige peptiden meer aantoonbaar.

Bemonstering Human Inheemse Speeksel peptidoom Met behulp van een Lollipop-Like Ultrafiltratie Probe: vereenvoudigen en te verbeteren Peptide Detection voor Klinische massaspectrometrie

De bacteriële celwand bestaat uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door peptiden. Ultra Performance Liquid Chromatography biedt een hoge resolutie en doorvoer voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycan samenstelling. We presenteren een procedure voor de isolatie van celwanden (sacculi) en hun daaropvolgende voorbereiding voor analyse via UPLC.

Isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor compositorische analyse door Ultra Performance Liquid Chromatography

De alomtegenwoordige tweede boodschapper c-di-GMP controleert de groei en het gedrag van veel bacteriën. We hebben een nieuwe Capture Compound Mass Spectrometry-gebaseerde technologie ontwikkeld om c-di-GMP-bindende eiwitten biochemisch te identificeren en te karakteriseren in vrijwel elke bacteriesoort.

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Massa-spectrometrie gebaseerde phyloproteomics (MSPP) werd gebruikt om een verzameling van Campylobacter jejuni ssp typen. Doylei isoleert De stam in vergelijking met multilocus volgorde typen (MLST).

subtypering van<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolaten, met behulp massaspectrometrie-gebaseerde PhyloProteomics (MSPP)

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Een protocol wordt beschreven voor de handmatige synthese van oligo-peptoids gevolgd door sequentieanalyse door massaspectrometrie.

Synthese en analyse van de Spectrometrie van de massa van Oligo-peptoids

De verrijking van bacteriële lipoproteins met behulp van een fase van de niet-ionogene oppervlakteactieve stof partitioneren methode wordt beschreven voor direct gebruik in TLR testen of andere toepassingen. Verdere stappen zijn gedetailleerd voor te bereiden al lipopeptides van N-terminale structurele karakterisering door massaspectrometrie.

Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie

Hier presenteren wij onbevooroordeelde kwantificering van site-specific eiwit acetylation en/of succinylation bezetting (stoichiometrie) van een volledige Proteoom door middel van een analyse van de ratiometric van endogene aangebrachte wijzigingen na kwantitatieve chemische acylering met behulp van stabiele isotoop-geëtiketteerden anhydriden. In combinatie met de Spectrometrie van de massa van de gevoelige gegevens-onafhankelijke acquisitie, worden nauwkeurige site bezetting metingen verkregen.

Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname

We presenteren een protocol met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie te identificeren en te kwantificeren belangrijke cellulaire lipiden in Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke lipideklassen binnen een gistcel is veelzijdig, robuust en gevoelig.

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Open zoeken maakt de identificatie van glycopeptiden versierd met voorheen onbekende glycaansamenstellingen mogelijk. In dit artikel wordt een gestroomlijnde aanpak voor het uitvoeren van open zoekopdrachten en daaropvolgende glycaangerichte glycopeptide-zoekopdrachten gepresenteerd voor bacteriële monsters met behulp van Acinetobacter baumannii als model.

De toepassing van open zoekgebaseerde benaderingen voor de identificatie van Acinetobacter baumannii O-gebonden glycopeptiden

Leer peptidoglycaan-analyse met vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica. Deze methode verhoogt de nauwkeurigheid en vermindert de werklast bij het bestuderen van bacteriële celprocessen en antimicrobiële resistentie.

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Meer video's verkennen