Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Peptoglycomics maakt gebruik van geavanceerde massaspectrometrie gecombineerd met krachtige bio-informatica gegevensanalyse om de samenstelling van peptidoglycan in detail te onderzoeken. Het gebruik van bio-informatica algoritmen maakt het mogelijk om massaspectrometrische gegevens tegelijkertijd te analyseren, extraheren en vergelijken over een verzameling gegevensbestanden, waardoor de werklast wordt verminderd en de nauwkeurigheid wordt verhoogd. Het begrijpen van de verschillende variaties en modificaties van peptidoglycan heeft implicaties voor het begrijpen van cellulaire processen, inclusief groei en deling, immuunevasie van de gastheer en antimicrobiële resistentie.

We bevelen aan om eerst een kleine subset van monsters voor te bereiden en te analyseren om vertrouwd te raken met het protocol en als pilotproject om de experimentele parameters te beoordelen. Aangezien massaspectrometrie gegevensanalyse software vaak varieert in de definities die worden gebruikt bij het beschrijven van functies en kenmerken, zal visuele demonstratie gebruikers helpen om dit protocol toe te passen op verschillende platforms. Voor extractie van peptidoglycan sacculi, resuspendeer bevroren cel pellets op ongeveer een tot 10 van het oorspronkelijke kweekvolume in 20 millimolair natriumfosfaat bij vier graden Celsius voordat u de cel suspensie druppelsgewijs toevoegt aan kokend 8%SDS in 20 millimolair natriumfosfaat tot een eindvolume van één op één.

Houd een zachte kook aan gedurende 30 minuten tot drie uur met roeren om volledige membraandeassociatie te verzekeren. De resulterende mix moet volledig helder zijn zonder resterende celklompjes of viscositeit. Wanneer de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, verzamel de sacculi door ultracentrifugering, gevolgd door vijf tot zeven wasbeurten in ongeveer 50 milliliter kamertemperatuur 20 millimolair natriumfosfaat per was tot de was buffer een SDS concentratie heeft van ongeveer 0,001% zoals bepaald door colorimetrische kleurstof.

Na de laatste was, resuspendeer de sacculi in 5 tot 10 milliliter kamertemperatuur 20 millimolair natriumfosfaat en vul het monster aan met 50 microgram per milliliter amylase, DNase en RNase in 10 millimolair magnesiumsulfaat voor een incubatie van een uur met agitatie of nutatie bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, verteer de reactie een nacht met 100 microgram per milliliter pronase bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend na ultracentrifugering, kook het monster een uur in 25 milliliter 2%SDS en 20 millimolair natriumfosfaat in een stoomboot.

Aan het einde van de incubatie, was het monster vijf tot zeven keer met 50 milliliter kamertemperatuur twee keer gedestilleerd water zoals gedemonstreerd. Wanneer de SDS concentratie ongeveer 0,001% bereikt, resuspendeer de pellet in een voldoende hoeveelheid twee keer gedestilleerd water om een sacculi suspensie te verkrijgen en was de container. Na overnacht opslag bij min 80 graden Celsius, liofiliseer het bevroren monster voordat u de sacculi verdunt tot een 10 milligram peptidoglycan per milliliter twee keer gedestilleerd water concentratie.

Voor LC-MS analyse, start een nieuw project in de instrumentsoftware en wijs de geschikte LC-MS QTOF gegevensbestanden toe aan de experimentele conditie van belang. Voer de gegevensverwerking wizard batch recursieve functie-extractie uit en stel de gegevensverwerkingsfilters in om overeen te komen met de parameters van de LC-MS condities en instrumentatie om groepen nauwkeurig te identificeren en mass-to-charge pieken te verifiëren die individuele muropeptiden vertegenwoordigen. Bekijk de resultaten aan het einde van de functie-extractie.

Als een aanzienlijk aantal functies niet in een groep kon worden gealigneerd, pas dan de recursieve filterparameters aan om de detectievenster te verbreden of beperken zoals nodig. Exporteer vervolgens de gegevens als een compound uitwisselingsbestand. Voor differentiële spectrale functie-analyse, start een nieuw project in het systeemsoftware en volg de instructies voor gegevensimport.

Tijdens de gegevensanalyse, selecteer de significantie en fold change voor differentiële analyse en stel de basislijngegevens in op de mediane intensiteit over alle gegevensbestanden. Zodra de analyse is voltooid, bekijk de resulterende grafische en statistische analyses om muropeptiden te identificeren die een significante verandering in abundantie tussen de geteste experimentele condities aantonen. Onder de projectnavigator, klik rechts op de verschillende analyses en selecteer een export optie om de functie details als een tsv bestand op te slaan.

Zorg ervoor om meerdere analyses op te slaan om alle relevante gegevens te verkrijgen. Binnen de differentiële analyse software, onder resultaten interpretatie, selecteer ID browser, voeg een bibliotheek van verwachte muropeptide structuren toe en selecteer vergelijkbare parameters als gedemonstreerd voor de functie-extractie om een voorspelde muropeptide annotatie voor elke geïdentificeerde functie te produceren. Om de voorspelde muropeptide annotatie handmatig te bevestigen, vergelijk de mass-to-charge ratio pieken van het tandem massaspectrometrie chromatogram met de voorspelde mass-to-charge ratio van alle mogelijke fragmentaties van een bekende muropeptide structuur.

Gebruik een moleculaire editor om de voorspelde muropeptide structuur te tekenen met behulp van de massa fragmentatie tool om de mass-to-charge ratio van de massaspectrometrie fragmenten te tonen wanneer elke binding individueel of in combinatie wordt gebroken, vervolgens vergelijk alle mogelijke fragmentaties van de muropeptide structuur met het tandem massaspectrometrie chromatogram. Om de muropeptide annotatie te bevestigen, moeten de mass-to-charge ratio pieken van meerdere fragmenten worden gevonden in het tandem massaspectrometrie chromatogram met een zeer minimale mass-to-charge ratio uitlijningsvenster. Om de globale veranderingen in muropeptide modificaties te beoordelen, bewerk het tsv bestand van de statistisch significante hoge fold change muropeptiden om een enkele kolom voor elke muropeptide modificatie toe te voegen.

Vul deze kolom met een aanduiding voor elke geannoteerd muropeptide en upload het gewijzigde tsv bestand naar Perseus. Onder annoteer rijen, klik categorisch op annoteer rijen en voeg gegevensbestanden toe aan elke experimentele parameter. Klik vervolgens onder test op twee steekproef tests om een student's T test uit te voeren en klik 1D om 1D annotatie uit te voeren.

Een verhoogde detectiesensitiviteit van massaspectrometrie machines gekoppeld aan krachtige piek herkenningssoftware heeft het vermogen verbeterd om stofsamenstellingen van complexe monsters in zeer