Transillumination-Assisted Dissectie van specifieke stadia van de muis seminifereuze epitheelcyclus voor downstream immunostaininganalyses

Deze methode vergemakkelijkt de identificatie en dissectie van stadium-specifieke seminiere tubulaire segmenten waardoor het mogelijk wordt om zeer specifieke stappen in de spermatogenese te bestuderen. De stadia van de seminiere epitheliale cyclus kunnen worden herkend in verse, niet-gefixeerde buisjes en daarom kunnen we alleen de stadia van belang selecteren voor downstream analyses. Het vereist enige oefening om de stadia te leren herkennen op basis van hun transverlichtingspatronen, maar dit protocol zou uw succes moeten garanderen.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Opeyemi Olotu, die een Ph.D.-kandidaat is in mijn laboratorium. Begin door een volwassen mannelijke muis van ten minste 8 weken oud in rugligging te plaatsen en het ventrale buikgedeelte te desinfecteren met 70%ethanol. Gebruik steriele schaar om een v-vormige incisie in het buik-bekkengebied te maken en gebruik steriele pincetten om aan de epididymale vetkwab te trekken om de testikels te lokaliseren.

Gebruik schaar om de testikels te dissecteren en plaats de weefsels in een steriele 100-millimeter petrischaal met PBS zodra ze zijn geoogst. Gebruik schaar met een fijne punt om een snede in de tunica albuginea te maken, het dikke vezelige membraan dat de testikels omhult, en gebruik pincetten om de tunica open te scheuren en de buisjes eruit te forceren. Plaats de gedecapsuleerde seminiere buisjes in een nieuwe petrischaal en voeg voldoende steriele PBS toe om de bodem van de schaal te bedekken.

Gebruik vervolgens de pincetten om de buisjes voorzichtig uit elkaar te trekken zonder de weefsels te beschadigen. Voor het dissecteren van de buisjes, plak de schaal op het werktafel van een dissectiescoop en zet de transverlichting aan. Gebruik fijne pincetten om de bundeltjes buisjes voorzichtig te verplaatsen om bekend te raken met de lichtabsorptie en verstrooiingspatronen van de verschillende stadia.

Gebruik vervolgens pincetten met een haakvormige punt om een buisje van belang op te tillen en gebruik microdissectieschaar om een segment van een geschikte lengte te snijden. Nadat de stadium-specifieke buisjessegmenten zijn gesneden, gebruik een pipet om een segment van belang te verzamelen in een volume van 10 microliters PBS en plaats het segment op een microscoopglaasje. Druk voorzichtig een dekglas van 20 bij 20 millimeter op het buisje zonder de cellen te veel te verpletteren en plaats het glaasje op de tafel van een fasecontrastmicroscoop.

Plaats een filterpapier op de rand van het dekglas om het spreiden van de cellen in een monolaag te vergemakkelijken en gebruik het 40-voudige objectief om de celstadia te verifiëren. Zodra de cellen een ronde monolaag hebben gevormd aan beide uiteinden van het buisje, dompel het glaasje gedurende 10 seconden in een container met vloeibare stikstof. Gebruik een scalpel om het dekglas van de cellen af te vlikken en plaats het glaasje onmiddellijk in 90%ethanol gedurende 2 tot 5 minuten.

Laat het vervolgens drogen en bewaar het glaasje op kamertemperatuur gedurende maximaal enkele dagen. Voor het geheel-mont immunokleuring van de seminiere buisjes, gebruik een pipet om segmenten van belang over te brengen in een 15-milliliter conische buis met ijskoud PBS op ijs. Laat de segmenten bezinken en verwijder voorzichtig het PBS.

Voeg 10 milliliter vers ijskoud PBS toe en meng door inversie. Laat de buisjes enkele minuten bezinken voordat u de supernatant opnieuw verwijdert zoals gedemonstreerd. Wanneer alle supernatant is verwijderd, fixeer de buisjes in 5 milliliter paraformaldehyde gedurende vijf uur bij 20 tot 30 omwentelingen per minuut bij 4 graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie, laat de buisjes enkele minuten bezinken voordat u het monster drie keer wast in vers PBS bij 4 graden Celsius gedurende 10 minuten per wasbeurt met rotatie. Na de laatste wasbeurt, gebruik een pipet van 1 milliliter om 10 tot 20 gefixeerde buisjessegmenten over te brengen in een 2-milliliter buis met ronde bodem. Wanneer de segmenten zijn bezonken, vervang de supernatant met 1 milliliter 2%BSA en 10%FBS in PBSX voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur en 20 tot 30 omwentelingen per minuut.

Aan het einde van de blokkerende incubatie, was de monsters met 1 milliliter PBSX. Voordat u de buisjes labelt met 250 microliter primaire antilichaam, verdun het in 1%BSA in PBSX gedurende twee uur bij kamertemperatuur bij 20 tot 30 omwentelingen per minuut. Aan het einde van de incubatie, was de buisjes drie keer in PBSX zoals gedemonstreerd voordat u de monsters labelt met 250 microliter van de juiste secundaire antilichamen gedurende een uur, beschermd tegen licht bij kamertemperatuur en 20 tot 30 omwentelingen per minuut.

Aan het einde van de incubatie, was de buisjes drie keer voordat u de buisjes in een kleine hoeveelheid supernatant op een microscoopglaasje decanteerd. Gebruik vervolgens gel-loading tips om de buisjes in lineaire stroken te rangschikken en laat het overtollige buffer weglopen. Voeg vervolgens 1 tot 2 druppels montagemedium toe voordat u het glaasje monteert met een dekglas.

Onder transverlichting zien stadia 7 tot 8 er homogeen donker uit omdat ze een groot aantal volledig gecondenseerde, verlengende spermatiden bevatten die zijn uitgelijnd op het apicale oppervlak van het epitheel. Nadat volwassen spermatozoa zijn vrijgekomen in het lumen tijdens spermiogene, ziet het buisje er zeer licht uit in stadia 9 tot 10 vanwege de afwezigheid van gecondenseerde, verlengende spermatiden binnen het epitheel. Deze lichte zone wordt gevolgd door de zwakke zone, waarvan de vlekkige uiterlijk voortkomt uit de organisatie van verlengende spermatiden met gecondenseerd chromatine in bundels.

Deze bundels worden zeer prominent in de daaropvolgende sterke vlekzone. Spermatid-bundels migreren naar Sertoli-celkernen die zich dicht bij de basale lamina bevinden, wat wordt weerspiegeld als een gestreept uiterlijk van buisjes van