Twee flow cytometrische benaderingen van NKG2D Ligand-oppervlaktedetectie om stamcellen te onderscheiden van bulksubpopulaties bij acute myeloïde leukemie
21 februari 2021
We presenteren twee verschillende kleuringsprotocollen voor NKG2D ligand (NKG2DL) detectie in menselijke primaire acute myeloïde leukemie (AML) monsters. De eerste benadering is gebaseerd op een fusie-eiwit, in staat om alle bekende en potentieel nog onbekende liganden te herkennen, terwijl het tweede protocol afhankelijk is van de toevoeging van meerdere anti-NKG2DL-antilichamen.
Dit protocol toont twee verschillende manieren om NKG2DLs op het oppervlak van AML-cellen te detecteren. De techniek biedt een snelle, gebruiksvriendelijke kleurmethode om alle bekende en mogelijk onbekende NKG2DLs te detecteren. Deze methode maakt het mogelijk om leukemische stamcellen te scheiden van bulk AML-cellen, waardoor het mogelijk is om deze cellen verder te karakteriseren.
Begin met het ontdooien van de biotine en de NKG2D fusie-eiwitbuizen op kamertemperatuur. Draai snel het NKG2D FC-poeder naar beneden en voeg vervolgens 500 microliters PBS toe om het poeder te reconstrueren en meng grondig met een P-1000 micropipet. Voeg 100 microliter van het NKG2DL-fusie-eiwit toe aan een biotinebuis om een eindconcentratie van 10 microgram per milliliter te verkrijgen en meng de oplossing grondig met een P-100 micropipet.
Om de AML-cellen te ontdooien, verwijdert u de cryovial bevattende primaire AML uit de vloeibare stikstofopslag en plaatst u deze onmiddellijk in een waterbad van 37 graden Celsius. Beweeg de buis voorzichtig heen en weer in het water, zodat de inhoud van de flacon kan ontdooien totdat er nog maar een klein ijskristal over is. Breng de ontdooide cellen onmiddellijk over in het medium met buis en spoel de flacon af met één milliliter medium.
Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 300 maal G en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren. Was de cellen met vijf milliliter RPMI-medium met 10% FCS en herhaal de centrifugeer. Resuspendeer de celkorrel met kleuringsbuffer tot een eindconcentratie van 0,5 maal 10 tot de zevende cel per milliliter.
Breng vervolgens 100 microliters van de celsuspensie over naar een celkweek 96 put U-bodemplaat en centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten op 300 keer G. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren. Bereid een mastermix van biotinylated NKG2D fusie-eiwit voor, zodat de cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 microliter per put met een uiteindelijke NKG2D-concentratie van 10 microgram per milliliter per put.
Voeg de bereide mastermix toe en resuspendeer de celkorrels met een pipet van 200 microliter. Incubeer en centrifugeer de plaat zoals beschreven in het teksthandschrift. Bereid een mastermix voor met streptavidin PE, zodat de cellen worden geresuspendeerd in een eindvolume van 50 microliter.
Voeg de mastermix toe aan de cellen en resuspend de pellets met een 300 microliter meerkanaals pipet. Gebruik na het centrifugeren van de plaat en het weggooien van het supernatant een 300 microliter meerkanaals micropipet om de celkorrels opnieuw te gebruiken in 200 microliters kleurbuffer plus 7-AAD. Analyseer vervolgens de cellen met behulp van een flowcytometrieapparaat.
De geanalyseerde AML-monsters zijn positief voor CD34 en NKG2DL, maar er bestaan ook negatieve subpopulaties, met in totaal vier verschillende populaties. De typische gatingstrategie begint met de selectie van de belangrijkste populatie cellen via hun FSC en SSC. Doubletten en dode cellen zijn uitgesloten in de downstream analyse.
De poorten worden aangepast met behulp van FMO-controles om een goede identificatie van positieve cellen te garanderen. De fluorescentieintensiteiten van cellen die positief zijn voor CD34 versus NKG2DL worden hier benadrukt. AML-cellen die positief zijn voor CD34 vertonen een lagere oppervlakte-expressie van NKG2DL, wat aangeeft dat NKG2DL-expressie geassocieerd is met een gebrek aan steelheid.
Drie primaire AML-monsters toonden 19,8, 49,8 en 89,4% positieve voorvallen voor de fusie-eiwitkleuring versus 20,4, 50,4 en 90,6% voor de gepoolde anti-NKG2DL-antilichaamkleuring. Aan de andere kant vertoonde enkele ligandkleuring een reeks positieve gebeurtenissen tot 92%, waarbij de percentages varieerden op basis van de ligand. Bij het proberen van deze methode is het erg belangrijk om snel te zijn bij het ontdooien van de primaire AML-cellen, omdat ze fragiel zijn en gemakkelijk kunnen sterven tijdens deze stap.
Na het uitvoeren van dit protocol kan een celsortering op basis van het NKG2DL-signaal worden uitgevoerd om de populaties verder te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft twee verschillende kleuringsmethoden voor het detecteren van NKG2D-liganden (NKG2DL's) op humane primaire monsters van acute myeloïde leukemie (AML). De technieken maken het mogelijk om leukemische stamcellen te scheiden van bulk-AML-cellen voor verdere karakterisering.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Oncologie
Achtergrond
- NKG2D-liganden zijn belangrijk voor immuunherkenning bij kanker.
- Acute myeloïde leukemie (AML) vormt een uitdaging voor de celkarakterisering.
- Huidige methoden kunnen leukemische stamcellen mogelijk niet effectief onderscheiden.
- Nieuwe kleuringsprotocollen kunnen de detectiecapaciteiten verbeteren.
Doel van de studie
- Om efficiënte kleuringsprotocollen te ontwikkelen voor de detectie van NKG2DL.
- Om de scheiding van leukemische stamcellen van bulk-AML-cellen te vergemakkelijken.
- Om de karakterisering van AML-monsters te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een fusie-eiwit voor de herkenning van NKG2DL's.
- Toepassing van meerdere anti-NKG2DL-antilichamen.
- Ontdooien en reconstitueren van biotine en NKG2D-fusie-eiwit.
- Mengen van oplossingen om de gewenste concentraties voor kleuring te bereiken.
Belangrijkste resultaten
- Beide protocollen detecteren effectief bekende en onbekende NKG2DL's.
- De scheiding van leukemische stamcellen uit bulk-AML-cellen wordt bereikt.
- De methoden zijn gebruiksvriendelijk en snel.
- Een verbeterde karakterisering van AML-cellen is mogelijk.
Conclusies
- Nieuwe kleuringsprotocollen verbeteren de detectie van NKG2DL's.
- Deze methoden kunnen bijdragen aan het begrip van de biologie van AML.
- Verder onderzoek kan voortbouwen op deze technieken voor therapeutische inzichten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het onderscheid tussen leukemische stamcellen en bulk-AML-populaties blijft een kritieke uitdaging bij de validatie van targets en de ontwikkeling van preklinische modellen. De mogelijkheid om NKG2DL-negatieve subpopulaties met stamceleigenschappen te isoleren, maakt mechanische risicoreductie van therapeutische hypothesen mogelijk en ondersteunt het voorspellende vertrouwen in vroege discovery-workflows. Deze aanpak informeert direct de portfoliotriage door ziekterelevante systemen met een hoger tumorigenisch potentieel te identificeren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door leukemische stamcellen te isoleren op basis van de oppervlakte-expressie van NKG2DL.
- Operationele waarde: Biedt een snelle, gebruiksvriendelijke methode om stamcelachtige subpopulaties te onderscheiden van gedifferentieerde AML-cellen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele validatie van stamceleigenschappen in NKG2DL-negatieve fracties.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve flowcytometrie-uitlezingen om de expressie van NKG2DL te vergelijken tussen ligand-specifieke en pan-ligand kleuringsbenaderingen.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, gestandaardiseerde kleuringsprotocollen die compatibel zijn met de voorbereiding van high-throughput screening.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de voorbereiding van gevalideerde biologische systemen mogelijk voor downstream compound screening en studies naar target engagement.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de afstemming van translationele biomarkers door de onderdrukking van NKG2DL te koppelen aan mechanismen voor immuunontwijking in LSC's.
- Operationele waarde: Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de isolatie van ziekte-initierende cellen mogelijk te maken.
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door de NKG2DL-status te gebruiken om AML-subpopulaties met een differentieel tumorigenetisch potentieel te stratificeren.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot leadidentificatie en preklinische evaluatie, door de isolatie van mechanistisch gedefinieerde subpopulaties mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door NKG2DL-negatieve LSC's te scheiden van NKG2DL-positieve bulk AML-cellen.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde, kwantitatieve oppervlakte-detectie die compatibel is met screeningplatforms op basis van flowcytometrie.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (percentage positieve events, fluorescentie-intensiteit), waardoor vergelijking van kleuringsmethoden en subpopulatiefrequenties mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door de isolatie van LSC's mogelijk te maken voor functionele validatie in ziekte-relevante modellen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Creëert een herbruikbare capaciteit voor stamcelverrijking die toepasbaar is op AML-monsters en aanpasbaar is voor andere kankertypes met vergelijkbare immuunontwijkingsmechanismen.
Operationele en bedrijfsonderneming impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid bij de verrijking van stamcellen, vermindering van mechanistische ambiguïteit bij de identificatie van LSC's.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van NKG2DL-detectie over meerdere AML-monsters.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen bij targetvalidatie, kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicovermindering, verminderd biologisch risico in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van het verrijkingspotentieel van LSC's en het immuunontwijkende fenotype.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie, celkleuring en het hanteren van primaire AML-monsters.
- Afhankelijk van toegang tot flowcytometers, centrifugatieapparatuur en reagentia, waaronder biotine, NKG2D-fusie-eiwit, streptavidine PE en 7-AAD.
- Maakt standaardisatie tussen teams van gating-strategieën, FMO-controles en compensatie-instellingen noodzakelijk voor consistente resultaten.
- Vereist overwegingen voor aanpassing bij toepassing op verschillende modelsystemen vanwege variabiliteit in NKG2DL-expressiepatronen.
- Praktische beperkingen omvatten de fragiliteit van primaire AML-cellen tijdens het ontdooien, waardoor snelle verwerking noodzakelijk is om de levensvatbaarheid te behouden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Biotinylation of the NKG2D Fusion Protein and Thawing of Primary AML Cells
2:00
Staining of Primary AML Cells with the Biotinylated NKG2D Fusion Protein
3:24
Results: Gating Strategy and Staining Protocol Comparison
4:49
Conclusion
