Name: Een niet-coderende kleine RNA MicC draagt bij aan virulentie in buitenmembraaneiwitten in Salmonella enteritidis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Leer hoe je een micC-deletiemutant maakt in Salmonella enteritidis met behulp van het λ-Red-recombinatiesysteem. Deze methode vereenvoudigt gen-inactivatie voor microbiologisch en vaccinonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Chinese National Science Foundation (nrs. 31972651 en 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), een project gefinancierd door de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Research Council. De dierverzorgings- en gebruikscommissie van de Yangzhou University keurde alle experimenten en procedures goed die op de dieren werden toegepast (SYXK2016-0020).
1. Bacteriestammen, plasmiden en kweekomstandigheden
<ol><li>Gebruik de bacteriën en plasmiden die in tabel 1 worden vermeld.</li>
	<li>Kweekbacteriën in LB-bouillon of op LB-agarplaten bij 37 °C, in aanwezigheid van 50 μg/ml ampicilline (Amp), indien van toepassing.</li>
	<li>Kweekstammen die temperatuurgevoelige plasmiden bevatten, worden gebruikt voor deletiemutantconstructie bij 30 °C.</li>
</ol>2. Kloon micC gen van S. Enteritidis stam 50336
<ol><li>Gebaseerd op de upstream en downstream sequentie van micC gen van S. Typhimurium stam SL1344, ontwerp primers vmicC-F en vmicC-R om een fragment met micC gen te versterken door PCR met behulp van SE50336 genomisch DNA als sjabloon.</li>
	<li>Meng 5 μL van 10x PCR-reactiebuffer, 2 μL dNTP-mengsel (2,5 mM), 1 μL vmicC-F- en vmicC-R-primers, respectievelijk, 5 μL sjabloon, 1 μL Taq DNA-polymerase en 35 μL ddH2O samen voor PCR.</li>
	<li>Gebruik de volgende PCR-reactieomstandigheden:pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 4 minuten; 94 °C gedurende 30 s, 53 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 min gedurende 25 cycli en verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Sequentieer het PCR-product om de micC-gensequentie te verkrijgen.</li>
</ol>3. Constructie van de micC-deletiemutant
OPMERKING: De micC-negatieve mutant van Salmonella Enteritidis stam 50336 werd geconstrueerd met behulp van λ-Rood-gemedieerde recombinatie zoals eerder beschreven13,14. De gebruikte primers staan vermeld in tabel 2.
<ol><li>Amplify chlooramfenicol cassette met homologie fragmenten van micC gen.<ol><li>Ontwerp micC-F en micC-R primers om de chlooramfenicol (Cm) cassette te versterken van plasmide pKD3, inclusief 50 bp homologie extensies van de 5' en 3' van het micC gen.</li>
		<li>Pak het pKD3-plasmide uit als de PCR-sjabloon.</li>
		<li>Meng 5 μL van 10x PCR reactiebuffer, 2 μL van dNTP mengsel (2,5 mM), 1 μL van micC-F en micC-R primers, respectievelijk, 5 μL van template, 1 μL van Taq DNA polymerase en 35 μL van ddH2O samen als PCR reactie mengsel</li>
		<li>Versterk de Cm-cassette met de volgende PCR-reactieomstandigheden: pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 4 minuten; 94 °C gedurende 1 min, 52 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 min gedurende 10 cycli; 94 °C gedurende 1 min, 63 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 minuut gedurende 25 cycli en verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Detecteer de grootte van het PCR-product door agarosegel-elektroforese. Zuiver en herstel PCR-product met DNA-gelherstelkit en bepaal de concentratie van DNA met een spectrofotometer. LET OP: PCR moet twee keer worden uitgevoerd. Het eerste PCR-product werd verdund in een verhouding van 1:200 en gebruikt als sjabloon voor de secundaire PCR, om de interferentie van verdere recombinatie door pKD3-plasmide te elimineren.</li>
	</ol></li>
	<li>Construct 1e recombinante stam 50336ΔmicC::cat
	<ol><li>Meng 100 μL SE50336 competente cellen met 5 μL pKD46 plasmide gelijkmatig en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Verhit het bovenstaande mengsel bij 42 °C gedurende 90 s en breng het mengsel snel over op ijs gedurende 2 minuten om het pKD46-plasmide om te zetten in SE50336. Zeef positieve kolonies door 's nachts bij 30 °C te kweken op een Amp (50 μg/ml) resistente plaat.</li>
		<li>Voeg 30 mM L-arabinose toe aan de SE50336/pKD46 vloeibare cultuur en induceer recombinase-expressie door een schudcultuur van 30 °C gedurende 1 uur. Bereid vervolgens competente cellen voor.</li>
		<li>Meng 100 ng gezuiverd PCR-product (stap 3.1) en 40 μL SE50336/pKD46-competente cellen in een elektrische schokbeker (bijv. Bio-Rad). Voer elektrische schoktransformatie uit met de parameters spanning 1,8 kV, puls 25 μF en weerstand 200 Ω.</li>
		<li>Breng na elektrotransformatie het mengsel over op 1 ml SOC-medium en een schudcultuur bij 150 tpm en 30 °C gedurende 1 uur. Smeer het mengsel vervolgens uit op een cm (34 μg / ml) resistente LB-plaat en kweek 's nachts bij 37 ° C om een positieve kolonie te screenen.</li>
		<li>Kweek de bovenstaande positieve kolonie bij 42 °C gedurende 2 uur. Screen de kolonie die gevoelig is voor Amp (50 μg/ml) maar resistent tegen Cm (34 μg/ml) bij 37 °C 's nachts om de 1e recombinante stam zonder pKD46 te verkrijgen.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificeer de 1e recombinante stam 50336ΔmicC::Cat.<ol><li>Extract 50336ΔmicC::Cat genomisch DNA als de PCR-sjabloon. Gebruik dezelfde PCR-reactiecomponenten als in stap 2.1. Voer de PCR-reactie uit onder dezelfde omstandigheden als in stap 2.1.</li>
		<li>Detecteer de grootte van het PCR-product door agarosegel-elektroforese en sequentieer het PCR-product.</li>
	</ol></li>
	<li>Construct deletie mutant 50336ΔmicC.
	<ol><li>Elektroporaat 100 ng plasmide pCP20 in 40 μL van 50336ΔmicC::Cat competente cellen met de parameters van spanning 1,8 kV, puls 25 μF en weerstand 200 Ω, schermpositieve transformanten op zowel Amp (50 μg/ml) als Cm (34 μg/ml) resistente plaat bij 30 °C.</li>
		<li>Breng boven positieve transformanten over in niet-resistente LB en kweek ze 's nachts bij 42 °C en isoleer vervolgens enkele kolonies op een LB-plaat bij 37 °C. Selecteer de kolonie die gevoelig is voor zowel Amp als Cm. Deze mutant is de micC deletie mutant SE50336Δ micC.</li>
		<li>Controleer 50336ΔmicC met PCR.<ol><li>Extract 50336ΔmicC genomisch DNA als PCR-sjabloon. Meng 5 μLof 10x PCR-reactiebuffer, 2 μL dNTP-mengsel (2,5 mM), 1 μL primer vmicC-F, 1 μL primer vmicC-R, 5 μL sjabloon, 1 μL Taq DNA-polymerase en 35 μL ddH2O samen voor PCR.</li>
			<li>Gebruik de volgende PCR-reactieomstandigheden:pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 4 minuten; 94 °C gedurende 30 s, 53 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 min gedurende 25 cycli en verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Constructie van de micC aangevulde stam
<ol><li>Ontwerpprimers pBR-micC-F en pBR-micC-R met NheI- en SalI-beperkingsplaatsen.<ol><li>Amplify full-length micC gen met flanksequenties met behulp van PCR reactiemengsel dat 5 μL SE50336 genomisch DNA als sjabloon bevat, primers 1 μL pBR-micC-F en 1 μL pBR-micC-R als primers, 5 μLof 10x PCR reactiebuffer, 2 μL dNTP Mengsel (2,5 mM), 2 μL dNTP Mengsel (2,5 mM) en 35 μL ddH2O.</li>
		<li>Gebruik de volgende PCR-reactieomstandigheden: pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 4 minuten; 94 °C gedurende 30 s, 52 °C gedurende 50 s, 72 °C gedurende 1 min gedurende 25 cycli en verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten. Zuiver en herstel PCR-product.</li>
	</ol></li>
	<li>Vergist PCR-product en plasmide pBR322 respectievelijk met behulp van restrictie-enzym NheI en SalI, en ligaat ze met behulp van T4-ligase bij 16 °C 's nachts om het plasmide pBR322-micC te verkrijgen.</li>
	<li>Transformeer pBR322-micC in de SE50336ΔmicC competente cellen en screen positieve transformant om de aangevulde stam SE50336ΔmicC/pmicC te verkrijgen. Extraheer plasmide pBR322-micC uit de aangevulde stam en verifieer het door restrictie-enzymvertering en sequencing.</li>
</ol>5. RNA-isolatie en kwantitatieve real-time PCR
<ol><li>Kweek SE50336, 50336ΔmicC en 50336ΔmicC/pmicC in LB medium 's nachts bij 24 °C met 180 rpm schud de teelt tot een OD600 van 2,0. Verzamel bacteriecultuur door centrifugeren bij 13000 rpm gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Extraheer totaal RNA met behulp van TRIzol-reagens. Incubeer 50 μL geïsoleerd RNA met 2 μL DNaseI en 6 μL 10x buffer bij 37 °C gedurende 30 minuten om DNA te verwijderen. Bepaal de hoeveelheid RNA door 1 μL RNA-monster naar een microspectrofotometer te pipetteren.</li>
	<li>Synthese van cDNA<ol><li>Gebruik 1 μg totaal RNA voor cDNA-synthese in 20 μL van het reverse transcriptiereactiesysteem (4 μL van 5x buffer, 1 μL van RT Enzym mix, 1 μL van RT primer mix, 10 μL van totaal RNA, en 4 μL van ddH2O). Incubeer boven het reactiesysteem bij 37 °C gedurende 15 minuten en vervolgens bij 85 °C gedurende 5 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Ontwerp primers op basis van de sequentie van doelgenen ompA, ompC en ompD. Voer reverse transcriptie-PCR uit met behulp van een RT-reagenskit. De PCR-reactiecomponenten bevatten 2,5 μL 10x PCR-reactiebuffer, 1 μL dNTP-mengsel (2,5 mM), 1 μL doelgen (ompA, ompC of ompD) primers, 2,5 μL sjabloon, 0,5 μL Taq DNA-polymerase en 17,5 μL ddH2O.<ol><li>Gebruik de volgende PCR-reactieomstandigheden:pre-denaturatie bij 94 °C gedurende 4 minuten; 94 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 min gedurende 25 cycli en verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer real-time PCR uit met behulp van SYBR groene RT-PCR-kit in een RT-PCT-instrument in drievoud.<ol><li>Gebruik de volgende PCR-reactiecomponenten: 10 μL 2x SYBR-buffer, 0,4 μLof forward primer en reverse primer respectievelijk, 0,4 μL RoxDye II, 2 μLof cDNA en 6,8 μL RNase-vrij H2O.</li>
		<li>Gebruik de volgende PCR-reactieomstandigheden:pre-denaturatie bij 95 °C gedurende 1 minuut gedurende één cyclus; 95 °C gedurende 5 s, 60 °C gedurende 34 s gedurende 40 cycli.</li>
		<li>Normaliseer alle gegevens naar het endogene referentiegen gyrA. Gebruik de 2-Δ Δ CT-methode voor gegevenskwantificering15.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Virulentietests
<ol><li>Kweek SE50336, 50336ΔmicC en 50336ΔmicC/pmicC in LB medium tot vroege stationaire fase (OD600 van 2-3) bij 24 °C, oogst door centrifugatie en verdun tot geschikte CFU mL-1 in steriele PBS.</li>
	<li>Voor muizeninfecties verdunt u de gekweekte stammen tot 10 CFU/200 μL, 102 CFU/200 μL en 103 CFU/200 μL gradiëntresuspensies. Infecteer groepen van vijf 6-8 weken oude Balb/c muizen per stam door subcutane injectie. Injecteer de controlegroep met 200 μL fysiologische zoutoplossing.</li>
	<li>Voor kippeninfecties, verdun boven drie stammen tot 107 CFU/200 μL, 108 CFU/200 μL en 109 CFU/200 μL gradiënt resuspensies. Infecteer groepen van twintig kippen van 1 dag oud per stam door subcutane injectie.</li>
	<li>Controleer dagelijks tekenen van ziekte en sterfgevallen van proefdieren. Bereken de LD50 (mediane letale dosis) 14 d na infectie zoals eerder beschreven16. Verwerk de gegevens met behulp van data-analysesoftware.</li>
	<li>Verzamel in infectiegroepen het hart, de lever, de milt, de longen en de nieren van vers dode kuikens. Weeg 0,5 g van de bovenstaande weefsels afzonderlijk af en maal ze met steriele werking. Verdun de maalmonsters geleidelijk, verdeel ze op LB-plaat en kweek gedurende 8-10 uur bij 37 °C. Noteer de hoeveelheid Salmonella-stammen die in kuikenweefsels zijn gekoloniseerd.</li>
</ol>

<ol><li>Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-mediated+control+in+bacteria%3A+An+increasing+diversity+of+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504(2020).</li>
<li>Wagner, E. G. H., Romby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNAs+in+bacteria+and+archaea%3A+who+they+are%2C+what+they+do%2C+and+how+they+do+it%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+In+Genetics%22%5BJournal%5D)">Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it.</a> Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).</li>
<li>Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rough+guide+to+the+non-coding+RNA+world+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella.</a> Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Dutta, T., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA-mediated+regulation+in+bacteria%3A+A+growing+palette+of+diverse+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms.</a> Gene. 656, 60-72 (2018).</li>
<li>Waters, L. S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136 (4), 615-628 (2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicC%2C+a+second+small-RNA+regulator+of+Omp+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).</li>
<li>Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+sequence+targeting+by+MicC+RNA+reveals+bacterial+mRNA+silencing+downstream+of+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).</li>
<li>Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Regulation+of+the+Small+RNA+MicC+and+the+Quiescent+Porin+OmpN+in+Response+to+Antibiotic+Stress+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli.</a> Antibiotics (Basel). 6 (4), 33(2017).</li>
<li>Hao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porin+Deficiency+in+Carbapenem-Resistant+Enterobacter+aerogenes+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains.</a> Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).</li>
<li>Wroblewska, Z., Olejniczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq+assists+small+RNAs+in+binding+to+the+coding+sequence+of+ompD+mRNA+and+in+rearranging+its+structure%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure.</a> RNA. 22 (7), 979-994 (2016).</li>
<li>Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulation+of+the+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+major+porin%2C+OmpD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD.</a> Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).</li>
<li>Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OmpD+but+not+OmpC+is+involved+in+adherence+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+to+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells.</a> Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+chaperone+Hfq+regulates+expression+of+fimbrial-related+genes+and+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Enteritidis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis.</a> FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+fimbrial+adhesins+are+required+for+full+virulence+of+Salmonella+typhimurium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice.</a> Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).</li>
<li>Prescott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+enteritidis+in+humans+and+animals%3A+Epidemiology%2C+pathogenesis%2C+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Veterinary+Journal+La+Revue+Veterinaire+Canadienne%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control.</a> Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736(1999).</li>
<li>Balasubramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+and+epidemiology+of+invasive+non-typhoidal%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Vaccin+Immunother%22%5BJournal%5D)">The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal.</a> Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).</li>
<li>De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+the+chicken+reproductive+tract+and+egg+contamination+by+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+and+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella.</a> Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).</li>
<li>Padalon-Brauch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNAs+encoded+within+genetic+islands+of+Salmonella+typhimurium+show+host-induced+expression+and+role+in+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence.</a> Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).</li>
<li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477(2009).</li>
<li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Salmonella+small+non-coding+RNA+facilitates+bacterial+invasion+and+intracellular+replication+by+modulating+the+expression+of+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120(2011).</li>
<li>Hébrard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNAs+and+the+virulence+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).</li>
<li>Vogel, J., Papenfort, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNAs+and+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).</li>
<li>Papenfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SigmaE-dependent+small+RNAs+of+Salmonella+respond+to+membrane+stress+by+accelerating+global+omp+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay.</a> Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).</li>
<li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li>
<li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboregulation+in+Escherichia+coli%3A+DsrA+RNA+acts+by+RNA%3ARNA+interactions+at+multiple+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li>
<li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C%2FA-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li>
<li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li>
<li>Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

S. Enteritidis is een belangrijke facultatieve intracellulaire ziekteverwekker die jonge kippen kan infecteren en symptomen veroorzaakt van enteritis tot systemische infectie en overlijden17,18. Bovendien veroorzaakt S. Enteritidis latente infecties bij volwassen kippen en chronische dragers besmetten pluimveeproducten, wat resulteert in door voedsel overgedragen infecties bij mensen19. Het pathogene mechanisme van S<...

Niet-coderende kleine RNA's (sRNA's) zijn 40-400 nucleotiden lang, die over het algemeen geen eiwitten coderen, maar onafhankelijk kunnen worden getranscribeerd in bacteriële chromosomen 1,2,3. De meeste sRNA's zijn gecodeerd in de intergene regio's (IGR's) tussen gencoderende regio's en interageren met doel-mRNA's door middel van base-pairing acties, en reguleren de expressie van doelgenen op het post-transcriptionele niveau 4,5. Ze spelen een belangrijke regulerende rol in het stofmetabolisme, de synthese van buitenmembraaneiwitten, quorumdetectie en virulentiegenexpressie5.
MicC is een 109-nucleotide klein RNA-transcript aanwezig in Escherichia coli en Salmonella enterica serovar Typhimurium, dat meerdere buitenmembraaneiwitexpressie zoals OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 en Omp36 6,7,8,9 zou kunnen reguleren. MicC reguleert de expressie van OmpC door ribosoombinding aan de ompC mRNA-leider in vitro te remmen en het vereist de Hfq RNA-chaperonne voor zijn functie in Escherichia coli6. In Salmonella Typhimurium legt MicC ompD-mRNA het zwijgen op via een ≤12-bp RNA-duplex binnen de coderende sequentie (codons 23-26) en destabiliseert vervolgens endonucleolytisch mRNA7. Dit regulatieproces wordt ondersteund door chaperonne-eiwit Hfq10. De OmpC is een overvloedig buitenmembraaneiwit waarvan werd gedacht dat het belangrijk was in omgevingen waar de concentraties voedingsstoffen en toxines hoog waren, zoals in de darm6. De OmpD porine is het meest voorkomende buitenmembraaneiwit in Salmonella Typhimurium en vertegenwoordigt ongeveer 1% van het totale celeiwit11. OmpD is betrokken bij de hechting aan menselijke macrofagen en darmepitheelcellen12. MicC onderdrukt ook de expressie van zowel OmpC- als OmpD-porines. Er wordt gedacht dat MicC virulentie kan reguleren. Om nieuwe doelgenen gereguleerd door MicC te onderzoeken en de virulentieregulatiefunctie van micC te bestuderen, kloonden we het micC-gen in de Salmonella Enteritidis (SE) stam 50336 en construeerden vervolgens de mutant 50336ΔmicC en de aangevulde mutant 50336ΔmicC / p micC. Nieuwe doelgenen werden gescreend door qRT-PCR. De virulentie van 50336ΔmicC werd gedetecteerd door muizen en kippeninfecties.

<table><tbody><tr><td>dextrose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610219</td><td>voor bouillonbereiding</td></tr><tr><td>DNA-zuiveringskit</td><td>TIANGEN</td><td>DP214</td><td>voor DNA-zuivering</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR01A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10017608</td><td>voor bouillonbereiding</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>20032116</td><td>voor bouillonbereiding</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610071</td><td>&lambda;-Red recombinatie</td></tr><tr><td>Mini Plasmid Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP106</td><td>plasmide extractie</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10019308</td><td>voor bouillonbereiding</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10002917</td><td>voor bouillonbereiding</td></tr><tr><td>PrimeScriptRRT reagent Kit met gDNA Eraser&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR047</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBRR Premix Ex Taq II</td><td>TaKaRa</td><td>RR820</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>Ligation</td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>RNA isolatie</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>voor bouillonbereiding</td></tr><tr><td>Gist extract</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td>voor bouillonbereiding</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td>centrifugatie</td></tr><tr><td>Elektroforese apparaat</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td>Elektroforese</td></tr><tr><td>&nbsp;Elektroporatie Systeem</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td>voor bacteriële transformatie</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>BioTek</td><td>Epoch</td><td>Absorbantie detectie</td></tr><tr><td>Real-Time PCR systeem</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500 systeem</td><td>qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

een niet-coderende kleine rna micc draagt bij aan virulentie in buitenmembraaneiwitten in salmonella enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

Een niet-coderend klein RNA (sRNA) is een nieuwe factor om genexpressie op post-transcriptioneel niveau te reguleren. Een soort sRNA MicC, bekend in Escherichia coli en Salmonella Typhimurium, zou de expressie van buitenmembraaneiwitten kunnen onderdrukken. Om de regulatiefunctie van micC in Salmonella Enteritidis verder te onderzoeken, kloonden we het micC-gen in de Salmonella Enteritidis-stam 50336 en construeerden vervolgens de mutant 50336Δ micC door het op λ Red gebaseerde recombinatiesysteem en de aangevulde mutant 50336Δ micC / p micC met recombinant plasmide pBR322 die micC tot expressie brengt. qRT-PCR-resultaten toonden aan dat transcriptie van ompD in 50336Δ micC 1,3-voudig hoger was dan die in de wildtype stam, terwijl de transcriptie van ompA en ompC in 50336Δ micC 2,2-voudig en 3-voudig hoger was dan die in de wildtype stam. Deze gaven aan dat micC de expressie van ompA en ompC onderdrukt. In de volgende studie werd de pathogeniciteit van 50336ΔmicC gedetecteerd door zowel 6 weken oude Balb / c-muizen als 1-dag-oude kippen te infecteren. Het resultaat toonde aan dat de LD 50 van de wilde stam 50336, de mutanten 50336Δ micC en 50336ΔmicC/pmicC voor 6 weken oude Balb/c muizen respectievelijk 12,59 CFU, 5,01 CFU en 19,95 CFU waren. De LD 50 van de stammen voor 1-dag-oude kippen waren respectievelijk 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU en2,54 x 10 8 CFU. Het gaf aan dat deletie van micC de virulentie van S verhoogde. Enteritidis bij muizen en kippen door de expressie van buitenmembraaneiwitten te reguleren.

Constructie van de mutant 50336Δ micC en de gecomplementeerde stam 50336Δ micC /p micC Het resultaat van het micC-genkloon gaf aan dat dit gen was samengesteld uit 109 bp met 100% identiteit met dat van S. Tyfumurie. Op basis van de sequentiegegevens werden de deletiemutant 50336ΔmicC en de gecomplementeerde mutant 50336ΔmicC/pmicC </em...

Een λ-Rood-gemedieerd recombinatiesysteem werd gebruikt om een deletiemutant te maken van een kleine niet-coderende RNA-micC.

Een niet-coderende kleine RNA MicC draagt bij aan virulentie in buitenmembraaneiwitten in Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

Dit protocol kan worden gebruikt voor het inactiveren van chromosomale genen om mutanten te isoleren voor genfunctiestudie en bacteriën. Het maakt het homologe recombinatieproces eenvoudig, snel en zeer efficiënt. Met behulp van deze techniek kunnen de virulentiegerelateerde genen van het pathogeen worden verwijderd om de verzwakte mutant te verkrijgen die kan worden gebruikt als kandidaat voor het verzwakte vaccin.Begin met het versterken van de chlooramfenicolcassette met hemologiefragmenten van het micC-gen. Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers om de chlooramfenicolcassette van plasmide PKD3 te versterken, inclusief 50 basepaar homologie-uitbreidingen van de vijf priem- en drie priemuiteinden van het micC-gen. Voer PCR uit zoals beschreven in het tekstmanuscript met behulp van het PKD3-plasmide als sjabloon om de chlooramfenicolcassette te versterken.Bepaal de grootte van het PCR-product met agarosegel-elektroforese. Zuiver het product vervolgens met een DNA-gelherstelkit en bepaal de concentratie van DNA door spectrofotometrie. Voer een tweede PCR-reactie uit om de interferentie van verdere recombinatie door het PKD3-plasmide te elimineren.Verdun het eerste PCR-product in een verhouding van 1 tot 200 en gebruik het als sjabloon voor de secundaire PCR. Om de eerste recombinante stam 50336 delta micC dot cat te construeren, mengt u 100 microliter SE 50336 competente cellen met vijf microliter PKD 46 plasmide en incubeert u gedurende 30 minuten op ijs. Hitteschok het mengsel bij 42 graden Celsius gedurende 90 seconden en breng het snel terug op ijs gedurende twee minuten om het plasmide in de cellen te transformeren.Screen positieve kolonies door de cellen 's nachts bij 30 graden Celsius te kweken op een ampicillineresistente plaat. Voeg de volgende dag 30 milli meer L arabinose toe aan de SE 50336 PKD 46 vloeibare cultuur en induceer recombinase-expressie met een incubatie van één uur bij 30 graden Celsius tijdens het schudden. Meng 100 nanogram van het gezuiverde PCR-product en 40 microliter SE 50336 PKD 46 competente cellen in een elektrische schokbeker.Voer vervolgens een elektrische schoktransformatie uit. Breng het mengsel na elektrotransformatie gedurende een uur over naar één milliliter SOC-medium en een incubator voor schudcultuur bij 150 RPM en 30 graden Celsius. Verdeel het mengsel op een chlooramfenicol-resistente LB-plaat en kweek 's nachts bij 37 graden Celsius om te screenen op positieve kolonies.Kweek de positieve kolonies twee uur lang op 42 graden Celsius. Vervolgens wordt de kolonie 's nachts gescreend op gevoeligheid voor ampicilline en resistentie tegen chlooramfenicol bij 37 graden Celsius om de eerste recombinante stam zonder PKD 46 te verkrijgen. Na het extraheren van de 50336 Delta micC dot cat genomisch DNA met behulp van PCR en gel elektroforese, galvaniseerde 100 nanogram plasmide PCP 20 in 40 microliter van 50336 Delta micC dot cat competente cellen.Screen positieve transformanten op zowel ampicilline als chlooramfenicol resistente platen bij 30 graden Celsius. Breng de positieve transformanten over in niet-resistent LB vloeibaar medium en kweek ze 's nachts bij 42 graden Celsius. Isoleer vervolgens enkele kolonies op een LB-plaat bij 37 graden Celsius.Selecteer de kolonie die gevoelig is voor zowel ampicilline als chlooramfenicol. Deze mutant is de micC deletie mutant SE 50336 Delta micC. Controleer 50336 Delta micC door PCR uit te voeren zoals beschreven in het tekstmanuscript.Dit protocol werd gebruikt om de deletiemutant 50336 Delta micC te construeren in de gecomplimenteerde mutant 50336 Delta micC, pmicC. De eerste recombinante 50336 Delta micC dot cat werd gevalideerd door PCR met een verwachte bandgrootte van ongeveer 1200 basenparen PCR-producten met de chlooramfenicol-insertie vergeleken met 279 basenparen in de wildtypestam. Bij de tweede recombinatie werd de chlooramfenicolcassette geëlimineerd door PCP 20.De PCR-resultaten in combinatie met sequencing bevestigden dat de isogene micC-mutant met succes was geconstrueerd. De expressie van ompA-, ompC- en ompD-genen in stammen 50336, 50336 Delta micC en 50336 delta micC pmicC werden geanalyseerd door realtime kwantitatieve PCR. Transcriptie van ompA en ompC en 50336 delta micC nam ongeveer 2,2 keer toe en verdrievoudigde in vergelijking met de wildtype soort.Terwijl de transcriptie van ompD slechts licht toenam. LD 50-testen toonden aan dat na het infecteren van zes tot acht weken oude BALB / c-muizen met elk van de drie stammen, de meeste muizen geïnfecteerd door 50336 Delta micC 48 uur na infectie lassitude, inappetentie of diarree vertoonden en na 96 uur stierven. De muizen geïnfecteerd door wild type stam en 50336 delta micC pmicC vertoonden dezelfde symptomen 72 uur na infectie en stierven na 120 uur.De LD 50's van de drie stammen gaven aan dat de virulentie van de mutant 50336 Delta micC 2,5 keer verbeterde in vergelijking met het wilde type. Deze techniek helpt onderzoekers de functie van bacteriële genen te bestuderen en de gewenste gemanipuleerde stam te verkrijgen door doelgenen te verwijderen.

a-non-coding-small-rna-micc-contributes-to-virulence-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De reverse genetics systeem voor de Rift Valley koorts virus MP-12 vaccinstam is een handig hulpmiddel voor het creëren van extra MP-12 mutanten met verhoogde verzwakking en immunogeniciteit. We beschrijven het protocol te genereren en karakteriseren NSS mutante stammen.

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

C. elegans heeft zich ontpopt als een nieuwe genetische model om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol te infecteren C. elegans met Salmonella typhimurium combinatie met een dubbele streng RNAi interferentie techniek om de rol van ontvangende genen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht.

Een protocol te infecteren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Met<em&gt; Salmonella typhimurium</em

Een high-throughput assay in vitro fenotype Salmonella of andere bacteriële vereniging, invasie en replicatie in fagocytische cellen met hoge doorvoer capaciteit ontwikkeld. De methode werd gebruikt om Salmonella-gen knock-out mutantstammen evalueren op hun betrokkenheid in gastheer-pathogeen interacties.

High-throughput Assay om Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, en replicatie in macrofagen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Onderzoek naar de interactie tussen bacteriële pathogenen en hun gastheren is een belangrijk gebied van biologisch onderzoek. Hier beschrijven we de noodzakelijke technieken om effector translocatie door Coxiella burnetii tijdens siRNA gene silencing behulp blam substraat te meten.

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Tijdens siRNA Silencing

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

MAPS-technologie is ontwikkeld om het targetoom van een specifiek regulerend RNA in vivo te onderzoeken. De sRNA van belang is gelabeld met een MS2 aptamer die de co-zuivering van zijn RNA-partners en hun identificatie door RNA-sequencing mogelijk maakt. Dit gewijzigde protocol is bijzonder geschikt voor Gram-positieve bacteriën.

MS2-Affinity Zuivering in combinatie met RNA Sequencing in Gram-Positieve Bacteriën

Dit artikel biedt een eenvoudig en duidelijk protocol om Salmonella-uitgescheiden effectoren te labelen met behulp van genetische code-uitbreiding (GCE) site-specifiek en de subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen in beeld te brengen met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)...

Superresolutiebeeldvorming van bacteriële uitgescheiden eiwitten met behulp van genetische code-uitbreiding

HIV tropisme kan worden afgeleid uit de V3 gebied van de virale envelop. V3 is PCR geamplificeerde in drievoud met geneste RT-PCR, in volgorde, en geïnterpreteerd met behulp van bio-software. Monsters met met 1 of meer sequentie (s) met een lage G2P scores worden geclassificeerd als niet-R5-virus.

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Beschrijven we een multiplex-PCR voor de snelle detectie van Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium. Specifieke Salmonella serovars kunnen worden geïdentificeerd door zich te richten een multiplex PCR om genen en sequenties die uniek zijn voor het O-antigen biosynthese cluster en flagelline van een bepaalde serovar. Serovar wordt vervolgens toegewezen aan een Salmonella isoleren op basis van het optreden van de specifieke, grootte amplicons (PCR-product) die...

Een Allelotyping PCR voor het vaststellen van Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium

Leer hoe je een micC-deletiemutant maakt in Salmonella enteritidis met behulp van het λ-Red-recombinatiesysteem. Deze methode vereenvoudigt gen-inactivatie voor microbiologisch en vaccinonderzoek.

Een niet-coderende kleine RNA MicC draagt bij aan virulentie in buitenmembraaneiwitten in Salmonella enteritidis

Meer video's verkennen