Name: Segmentering van de groei van endotheelcellen in 6-putplaten op een orbitale shaker voor mechanobiologische studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Leer een coatingmethode voor gelokaliseerde endotheelcelgroei in 6-putplaten met een orbitale shaker om schuifspanningseffecten te bestuderen. Dit model verbetert vasculaire biologieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen dankbaar een projectbeurs van de British Heart Foundation (aan PDW), een National Medical Research Council Singapore TAAP en DYNAMO Grant (aan XW, NMRC/OFLCG/004/2018, NMRC/OFLCG/001/2017), een A*STAR Graduate Scholarship (aan KTP) en een British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (to MA).

1. Vervaardiging van hulpmiddelen en bereiding van reagentia
<ol><li>Fabricage van roestvrijstalen module<ol>
<li>Fabriceer de roestvrijstalen module van een roestvrij staal van klasse 316 met behulp van een CNC-freesmachine volgens de meegeleverde technische tekening (figuur 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D-printen van een polydimethylsiloxaan (PDMS) mal<ol>
<li>Bereid een CAD-model (3D computer aided design) van de PDMS-mal voor met SolidWorks volgens de meegeleverde technische tekening (Figuur 2).</li>
		<li>Exporteer het CAD-model naar een STL-bestand en importeer het STL-bestand naar Cura 2.6.2.</li>
		<li>Snijd het model in lagen met een afdruksnelheid van 50 mm/s en een infilldichtheid van 60%.</li>
		<li>Exporteer het bestand als een G-code en upload het naar een Ultimaker2 3D-printer om af te drukken. Gebruik polymelkzuur (PLA) als drukmateriaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gieten van PDMS ring<ol>
<li>Meng de PDMS-basis en het uithardingsmiddel (beide uit een siliconen elastomeerkit) met de verhouding van 90,9% basis en 9,1% uithardingsmiddel.</li>
		<li>Giet ongeveer 2,6 ml van de goed gemengde oplossing in de 3D-geprinte mal.</li>
		<li>Verwijder bellen in een vacuüm ontgassingskamer.</li>
		<li>Hard het 1 uur uit in een oven van 80 °C.</li>
		<li>Laat de PDMS-ring afkoelen tot kamertemperatuur en verwijder vervolgens de uitgeharde PDMS-ring voorzichtig uit de mal. De technische tekening van pdms-ring wordt weergegeven in figuur 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van 1% Pluronic F-127<ol>
<li>Weeg 5 g Pluronic F-127 af, giet het in een glazen fles en voeg vervolgens 100 ml steriel water toe aan de glazen fles. Dit geeft een 5% Pluronic F-127 oplossing.</li>
		<li>Zorg ervoor dat al het Pluronic F-127 poeder in het water wordt ondergedompeld, sluit de dop en autoclaaf deze met behulp van een programma voor de sterilisatiecyclus van de vloeistof.</li>
		<li>Laat de oplossing na het autoclaaf afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik.</li>
		<li>Voeg 10 ml 5% Pluronic F-127-oplossing toe aan 40 ml steriel water met autoclaaf om 1% Pluronic F-127-oplossing te maken. Voer de verdunning uit in een bioveiligheidskast (BSC) kap.</li>
		<li>Bewaar zowel 1% als 5% Pluronic F-127 bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van 4% paraformaldehyde (PFA)<ol>
<li>Voeg 800 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan een glazen bekerglas en verwarm deze tijdens het roeren tot 60 °C (blijf roeren van stap 1.5.1 tot 1.5.5).</li>
		<li>Weeg 40 g PFA-poeder en voeg het toe aan de warme PBS-oplossing. LET OP: PFA is gevaarlijk, voer de stappen 1.5.2 tot 1.5.6 uit in een zuurkast.</li>
		<li>Voeg 1 M natriumhydroxide (NaOH) langzaam druppelgewijs toe aan de PFA-oplossing totdat de oplossingen helder worden.</li>
		<li>Stel de pH van de PFA-oplossing in op ongeveer 7,4 met 1 M zoutzuur (HCl).</li>
		<li>Vul de oplossing bij tot 1 L met 1X PBS. Dit geeft 1 L van 4% PFA.</li>
		<li>Filter de PFA-oplossing met filters van 0,2 μm om deeltjes te verwijderen, te aliquot en in te vriezen in een vriezer van -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van 0,1% Triton-X<ol>
<li>Voeg 50 μL pure Triton-X toe aan 50 ml PBS om 0,1% Triton-X-oplossing te maken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van 1% runderserumalbumine (BSA)<ol>
<li>Weeg 0,5 g BSA, giet het in een centrifugebuis van 50 ml en voeg vervolgens 50 ml PBS toe aan de buis.</li>
		<li>Laat het 1 uur rollen bij kamertemperatuur op een rol om op te lossen.</li>
		<li>Bewaar 1% BSA bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Coating van een 6-put plaat
<ol><li>Autoclaaf roestvrijstalen module, PDMS-ring en pincet voor gebruik. Voer alle daaropvolgende procedures uit in een BSC-kap en neem aseptische technieken in acht om steriliteit te garanderen.</li>
	<li>Plaats de PDMS-ring in een 6-put met een pincet. Gebruik de externe rand van de PDMS-ring om de PDMS-ring concentrisch met de put uit te lijnen. OPMERKING: Alleen niet-weefselkweek behandelde putplaten mogen worden gebruikt.</li>
	<li>Plaats de roestvrijstalen module met een pincet op de PDMS-ring.</li>
	<li>Steek de uiteinden van de interne borgringtang in de greepgaten van de borgring, knijp in de houder om de diameter van de borgring te verkleinen. Plaats hem in de 6-put, druk hem stevig op de roestvrijstalen module en laat de tang los om de PDMS-ring in de put te monteren.</li>
	<li>Voeg 1 ml fibronectine van 5 μg/ml toe aan het midden of de rand van de put (afhankelijk van de interesseregio) door het openen van de PDMS-ring en de roestvrijstalen module.</li>
	<li>Wervel de plaat om ervoor te zorgen dat de fibronectine-oplossing alle interessegebieden bestrijkt.</li>
	<li>Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C in een bevochtigde incubator onder 95% lucht/5% CO2.</li>
	<li>Haal de fibronectineoplossing uit de put en was tweemaal met PBS. Verwijder de PBS volledig uit de put.</li>
	<li>Verwijder de borgring, roestvrijstalen module en PDMS-ring uit de put.</li>
	<li>Voeg 1,5 ml Pluronic F-127 van 1% toe aan het midden of de rand van de put (ongecoat oppervlak) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om het ongecoate oppervlak te passiveren.</li>
	<li>Haal de Pluronic F-127 oplossing uit de put en was driemaal met PBS.</li>
	<li>Gebruik de gecoate put onmiddellijk of bewaar deze maximaal twee weken op 4 °C met een laag PBS in de gecoate put.</li>
</ol>3. Zaaien van HUVECs
<ol><li>Gebruik HUVECs onder passage 5 in het experiment.</li>
	<li>Verwijder alle kweekmedia en was de cellen eenmaal met PBS.</li>
	<li>Voeg 3 ml trypsine van 0,05% toe en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C in een bevochtigde incubator onder 95% lucht/5% CO2. Tik voorzichtig op de kolf om de cellen los te maken. OPMERKING: Dit protocol is getest met huvec's en de concentratie trypsine en de incubatietijd ervan kunnen verschillen voor andere soorten EC's.</li>
	<li>Breng de oplossing over in een centrifugebuis van 15 ml en neutraliseer de trypsine met behulp van 6 ml kweekmedium (bijv. Lonza EGM-2) voorverwarmd tot 37 °C.</li>
	<li>Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min. Verwijder de geneutraliseerde trypsineoplossing en resuspend cellen met 1 ml voorverwarmd kweekmedium.</li>
	<li>Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en zaad 180k cellen in een gecoate 6-put plaat in 1,5 ml voorverwarmd kweekmedium.</li>
	<li>Schud de putplaat zijdelings om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig in de put verdelen.</li>
	<li>Laat het 's nachts in een bevochtigde incubator van 37 °C onder 95% lucht/5% CO2.</li>
	<li>Verwijder de niet-vastgemaakte cellen en het kweekmedium en vervang door 2 ml voorverwarmd kweekmedium. OPMERKING: veel niet-gekoppelde cellen die in het medium zweven, worden verwacht.</li>
</ol>4. Scheerspanningstoepassing met behulp van een orbitale shaker
<ol><li>HUVECs moeten na 3 dagen groei samenvloeien. Vervang het medium door 1,9 ml voorverwarmd kweekmedium (om een hoogte van 2 mm te bereiken).</li>
	<li>Plaats de plaat op het platform van een orbitale shaker in een bevochtigde incubator onder 95% lucht/5% CO2 en wervel deze gedurende 3 dagen bij 150 tpm. OPMERKING: Veeg het buitenoppervlak van de orbitale shaker af met 70% ethanol voordat u deze in de incubator plaatst.</li>
	<li>(Optioneel) Na 2 dagen afschuiven kunnen cytokinen aan het kweekmedium worden toegevoegd om het samenspel tussen cytokinen en schuifspanning te onderzoeken. Knip na de behandeling de cellen nog een dag af. In deze studie werd TNF-α gebruikt om de cellen te activeren.</li>
	<li>Voer analyses uit na 3 dagen van afschuifspanning.</li>
</ol>5. Kleuring en beeldvorming van cellen
<ol><li>Verwijder na 3 dagen afschuiven de plaat uit de incubator en was de cellen twee keer met PBS.</li>
	<li>Bevestig de cellen door 1,5 ml 4% PFA in de put toe te voegen en 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.</li>
	<li>Haal de 4% PFA uit de put en was twee keer met PBS.</li>
	<li>Permeabiliseer de cellen door 0,1% Triton-X toe te voegen aan de put en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de 0,1% Triton-X oplossing uit de put en voeg 1,5 ml 1% BSA toe aan de put voor blokkering. Incubeer de cellen met 1% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verdun konijn anti-humaan ZO-1 antilichaam bij een verdunning van 1:200 in 1% BSA. Voeg 1,5 ml verdund antilichaam toe aan de put en incubeer het 's nachts met de cellen bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder na een nachtelijke incubatie het verdunde antilichaam en was de cellen driemaal met PBS.</li>
	<li>Verdun Alexa Fluor 488-gelabeld geitenanti-konijn IgG secundair antilichaam bij een verdunning van 1:300 in PBS. Voeg 1,5 ml verdund secundair antilichaam toe aan de put en incubeer het met de cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder het verdunde secundaire antilichaam en was cellen tweemaal met PBS.</li>
	<li>Verdun DRAQ5 bij een verdunning van 1:1000 in PBS. Voeg 1,5 ml verdunde DRAQ5 toe aan de put en incubeer deze gedurende 15 minuten met de cellen bij kamertemperatuur om de celkernen te bevlekken.</li>
	<li>Verwijder de verdunde DRAQ5 en was driemaal met PBS.</li>
	<li>Voer een tegelscan uit van de rand naar het midden van de put met een confocale microscoop.</li>
</ol>6. Kwantificering van vormindex en celnummer
<ol><li>Post verwerkt de afbeeldingen met MATLAB R2016a.</li>
	<li>Lees het LIF-bestand van confocale microscoop naar MATLAB en converteer de samengevoegde tegelscan naar een binaire afbeelding en drempel het beeld vervolgens op gebied en intensiteit om kernen van achtergrond te onderscheiden.</li>
	<li>Verdeel de binaire tegelscan in radiale segmenten van 1 mm.</li>
	<li>Plaats een ellips in elke afzonderlijke kern.</li>
	<li>Tel het aantal ellipsen binnen elk radiaal segment om een celnummer op te geven.</li>
	<li>Definieer de vormindex = als SI = 4π x Gebied / Omtrek2. Bereken de vormindex voor elke ellips18.</li>
</ol>

<ol><li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).</li>
<li>Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Sensing+of+Flow+Direction%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Sensing of Flow Direction.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).</li>
<li>Tzima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanosensory+complex+that+mediates+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress.</a> Nature. 437, 426-431 (2005).</li>
<li>Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+and+compliance+of+endothelial+cells+after+shear+stress+in+vitro+or+from+different+aortic+regions%3A+Scanning+ion+conductance+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study.</a> PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).</li>
<li>Asakura, T., Karino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Patterns+and+Spatial+Distribution+of+Atherosclerotic+Lesions+in+Human%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human.</a> Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).</li>
<li>Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+evidence+for+a+change+in+the+pattern+of+aortic+wall+shear+stress+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).</li>
<li>Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+fluid+mechanics+in+the+localization+and+detection+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis.</a> Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).</li>
<li>Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+vitro+rheological+system+for+studying+the+effect+of+fluid+shear+stress+on+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells.</a> The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).</li>
<li>Levesque, M. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elongation+and+orientation+of+cultured+endothelial+cells+in+response+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress.</a> Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).</li>
<li>Chiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+effect+of+disturbed+flow+on+monocytic+adhesion+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).</li>
<li>Venugopal Menon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+microfluidic+3D+stenosis+model+to+study+leukocyte-endothelial+interactions+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis.</a> APL Bioengineering. 2 (1), 016103(2018).</li>
<li>Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+mechanobiology+in+cultured+endothelium%3A+A+review+of+the+orbital+shaker+method%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method.</a> Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).</li>
<li>Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+segmenting+growth+of+cells+in+sheared+endothelial+culture+reveals+the+secretion+of+an+anti-inflammatory+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator.</a> Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15(2018).</li>
<li>Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+phenotypes+of+endothelial+cells+in+culture%3A+comparison+of+aortic%2C+venous%2C+capillary%2C+and+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%22%5BJournal%5D)">Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium.</a> Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).</li>
<li>Tunica, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+using+a+combination+of+free-flow+electrophoresis+and+nanoflow+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS.</a> Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).</li>
<li>Griffoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+proteins+secreted+by+endothelial+cells+during+modeled+low+gravity+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).</li>
<li>Ghim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+three+pathways+for+macromolecule+transport+across+cultured+endothelium+and+their+modification+by+flow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).</li>
<li>Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+endothelial+cell+shape+and+wall+shear+stress+in+a+stenosed+dog+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%3A+An+Official+Journal+of+the+American+Heart+Association%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta.</a> Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

De swirling-well methode is in staat om complexe flowprofielen te genereren in een enkele put - Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) in het midden en High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) aan de rand van de put. Shear stress-gemedieerde afscheidingen van oplosbare mediatoren worden echter gemengd in het wervelende medium en beïnvloeden cellen in de hele put, waardoor mogelijk het ware effect van een bepaald afschuifspanningsprofiel op de cellen wordt gemaskeerd.
De hier gedemonstreerde coa...

Reacties van vasculaire cellen op hun mechanische omgeving zijn belangrijk in de normale functie van bloedvaten en bij de ontwikkeling van ziekte1. De mechanobiologie van de endotheelcellen (EC's) die het binnenoppervlak van alle bloedvaten belijnen, is een bijzondere focus van mechanobiologisch onderzoek geweest, omdat EC's direct de schuifspanning ervaren die wordt gegenereerd door de bloedstroom eroverheen. Verschillende fenotypische veranderingen zoals ontstekingsreacties, veranderde stijfheid en morfologie, de afgifte van vasoactieve stoffen en de lokalisatie en expressie van junctionele eiwitten zijn afhankelijk van eg-blootstelling aan schuifspanning2,3,4. Afschuifafhankelijke endotheeleigenschappen kunnen ook verantwoordelijk zijn voor de fragmentarische ontwikkeling van ziekten zoals atherosclerose5,6,7.
Het is nuttig om het effect van afschuiving op EC's in cultuur te bestuderen, waar spanningen kunnen worden gecontroleerd en EC's kunnen worden geïsoleerd van andere celtypen. Veelgebruikte in vitro apparaten voor het toepassen van schuifspanning op EC's zijn de parallelplaatstroomkamer en de kegel-en-plaatviscometer, maar alleen eenassige steady, oscillatory en pulsatile flow kunnen worden toegepast8,9. Hoewel gewijzigde stromingskamers met taps toelopende of vertakkende geometrieën en microfluïdische chips die een stenotische geometrie nabootsen zijn ontwikkeld , vormen hun lage doorvoer en de relatief korte cultuurduur die mogelijk is een uitdaging10, 11.
De orbitale shaker (of wervelende put) methode voor de studie van endotheelmechanotransductie, waarbij cellen worden gekweekt in standaard celkweekplasticware geplaatst op het platform van een orbitale shaker, krijgt steeds meer aandacht omdat het in staat is om chronisch complexe, ruimtelijk variërende schuifspanningspatronen op EC's met een hoge doorvoer op te leggen (zie review door Warboys et al.12). Computational Fluid Dynamics (CFD) simulaties zijn gebruikt om de ruimtelijke en temporele variatie van schuifspanning in een wervelende put te karakteriseren. De wervelende beweging van cultuurmedium veroorzaakt door de orbitale beweging van het schudplatform waarop de plaat is geplaatst, leidt tot Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF, of putatively pro-atherogene flow) in het midden en High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF, of putatively atheroprotective flow) aan de rand van de putten van een 6-wells plaat. De tijdgemiddelde wandschaarspanning (TAWSS) is bijvoorbeeld ongeveer 0,3 Pa in het midden en 0,7 Pa aan de rand van een 6-putplaat die bij 150 tpm met een omloopradius van 5 mm13wordt gewerveld. De methode vereist alleen in de handel verkrijgbaar plastic en de orbitale shaker zelf.
Er is echter een nadeel aan de methode (en aan andere methoden om stromen in vitro op te leggen): EC's geven op een afschuifafhankelijke manier oplosbare mediatoren en microdeeltjes vrij14,15,16 en dit secretoom kan ECs beïnvloeden in andere gebieden van de put dan die waar ze zijn vrijgegeven, als gevolg van het mengen in het wervelende medium. Dit kan de werkelijke effecten van afschuifspanning op het EG-fenotype maskeren. Ghim et al. hebben bijvoorbeeld gespeculeerd dat dit verantwoordelijk is voor de ogenschijnlijk identieke invloed van verschillende afschuifprofielen op het transcellulaire transport van grote deeltjes17.
Hier beschrijven we een methode voor het bevorderen van de hechting van menselijke navelstrengaadotheelcellen (HUVEC) in specifieke gebieden van een 6-putplaat met behulp van fibronectinecoating tijdens het gebruik van Pluronic F-127 om het oppervlak te passiveren en groei elders te voorkomen. De methode lost de hierboven beschreven beperking op, omdat EC's door celgroei te segmenteren slechts één soort afschuifprofiel ervaren en niet worden beïnvloed door secretomen van EC's die elders in de put aan andere profielen worden blootgesteld.

<table><tbody><tr><td>Cell and Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endotheelgroeimedium (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>cc-3162</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke navelstrengveneuze endotheelcellen</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Geïsoleerd uit navels uitgehaald bij donoren met een ongecompliceerde bevalling in het Hammersmith Ziekenhuis</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagentia en materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-gelabeld geitenanti-konijn IgG</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-50G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Niet Behandeld&nbsp;</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&nbsp;</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine uit runderplasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing met zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant menselijk TNF-a</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>RS PRO 2,85 mm zwart PLA 3D-printerfilament, 1 kg</td><td>RS</td><td>832-0264</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrij staal 316</td><td>Metal Supermarket</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard184 siliconen elastomeerkit</td><td>Farnell</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Zonula Occludens-1 (ZO-1)-antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13663</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (5 mM)</td><td>Bio Status</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grant Orbital Shaker PSU-10i</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&nbsp;</td><td>SHA7930</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bevestigingsringtang</td><td>Misumi</td><td>RTWP32-58</td><td></td></tr><tr><td>Bevestigingsringen/intern/C-type</td><td>Misumi</td><td>RTWS35</td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker 2+3-D printer</td><td>Ultimaker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cura 2.6.2</td><td>Ultimaker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 2016</td><td>Dassault Systemes</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

segmentering van de groei van endotheelcellen in 6-putplaten op een orbitale shaker voor mechanobiologische studies

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Schuifspanning opgelegd aan de arteriële wand door de bloedstroom beïnvloedt endotheelcelmorfologie en functie. Lage magnitude, oscillatoire en multidirectionele afschuifspanningen zijn allemaal gepostuleerd om een pro-atherosclerotisch fenotype in endotheelcellen te stimuleren, terwijl hoge magnitude en unidirectionele of uniaxiale afschuiving worden verondersteld endotheliale homeostase te bevorderen. Deze hypothesen vereisen verder onderzoek, maar traditionele in vitro technieken hebben beperkingen en zijn bijzonder slecht in het opleggen van multidirectionele schuifspanningen aan cellen. 
Een methode die steeds meer wordt gebruikt, is het gekweekt van endotheelcellen in standaard multi-well platen op het platform van een orbitale shaker; in deze eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer en chronische methode produceert het wervelende medium verschillende patronen en magnitudes van afschuiving, waaronder multidirectionele afschuiving, in verschillende delen van de put. Het heeft echter een aanzienlijke beperking: cellen in één regio, blootgesteld aan één type stroom, kunnen mediatoren afgeven in het medium die cellen in andere delen van de put beïnvloeden, blootgesteld aan verschillende stromen, waardoor de schijnbare relatie tussen stroom en fenotype wordt verstoord. 
Hier presenteren we een eenvoudige en betaalbare aanpassing van de methode waarmee cellen alleen kunnen worden blootgesteld aan specifieke afschuifspanningskenmerken. Celzaden is beperkt tot een bepaald gebied van de put door het gebied van belang te coaten met fibronectine, gevolgd door passivering met passiverende oplossing. Vervolgens kunnen de platen op de shaker worden gewerveld, wat resulteert in blootstelling van cellen aan goed gedefinieerde afschuifprofielen zoals multidirectionele afschuiving met een lage magnitude of uniaxiale afschuiving met een hoge magnitude, afhankelijk van hun locatie. Net als voorheen maakt het gebruik van standaard celkweekplasticware een eenvoudige verdere analyse van de cellen mogelijk. De wijziging heeft al de demonstratie mogelijk gemaakt van oplosbare mediatoren, die vrijkomen uit endotheel onder gedefinieerde kenmerken van schuifspanning, die cellen elders in de put beïnvloeden.

Hechting van HUVECs aan gebieden van de putplaat die niet met fibronectine waren bedekt, werd door Pluronic F-127 passivering ingetrokken; de groei bleef beperkt tot het gebied dat zelfs na 72 uur cultuur bedekt was met fibronectine, met en zonder afschuifspanningstoepassing (figuur 4A, figuur 4C). Zonder de Pluronic F-127 passivering waren HUVECs zonder fibronectine aan het oppervlak bevestigd en hadden zich verder verspreid met...

Dit protocol beschrijft een coatingmethode om endotheelcelgroei te beperken tot een specifiek gebied van een 6-putplaat voor afschuifspanningstoepassing met behulp van het orbitale shakermodel.

Segmentering van de groei van endotheelcellen in 6-putplaten op een orbitale shaker voor mechanobiologische studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Dit protocol beschrijft een coatingmethode om endotheelcelgroei te beperken tot een specifiek gebied van een 6-put plaat voor pure stresstoepassing met behulp van het orbitale shakermodel. Een veel voorkomende manier om effecten van stroming op endotheel te bestuderen, is door endotheelcellen in multi-well kweekplaten op een orbitale shaker te gekweekt. De orbitale shaker induceert een golf die rond de put draait.Cellen in het midden van de put ervaren het soort stromen waarvan wordt gedacht dat ze leiden tot atherosclerose. Cellen dichter bij de rand ervaren een stroom waarvan wordt gedacht dat ze beschermend is. Eigenschappen van de cellen in elke regio worden verondersteld af te hangen van de pure stress die ze ervaren.Er is echter een potentiële verdieping in deze logica. Endotheelcellen geven bemiddelaars op een stroomafhankelijke manier vrij. Deze bemiddelaars zullen een uniforme concentratie bereiken in het wervelende medium en zullen daarom cellen aantasten in andere regio's dan die waar ze zijn vrijgegeven.Dat kan de ware effecten van afschuiven op het celgedrag beschadigen of verbergen. Het effect is niet beperkt tot het wervelputsysteem. Het kan zelfs voorkomen in eenvoudige modellen, zoals de parallelle plaatstroomkamer.Het kan worden vermeden door cellen in slechts één deel van het systeem te laten groeien. Hier beschrijven we methoden om celadhesie alleen in het midden of alleen aan de rand van de wervelput toe te staan. Fabricage van roestvrijstalen module.Fabriceer de roestvrijstalen module van een roestvrij staal van klasse 316 volgens een meegeleverde technische tekening. 3D-printen op PMM's. Bereid een 3D CAD-model van PDMs-mal voor met SOLIDWORKS volgens de meegeleverde technische tekening.Exporteer het CAD-model naar een STL-bestand en importeer het STL-bestand naar Cura 2.6.2. Snijd het model in lagen met een afdruksnelheid van 50 millimeter per seconde en een invuldichtheid van 60% Exporteer het bestand als een GCode. Geüpload naar een Ultimaker 3D-printer om te printen.Gebruik polymelkzuur als drukmateriaal. Gieten van PDMS ring. Meng de PDMS-basis en het uithardingsmiddel goed met de verhouding van 90,9% basis en 9,1%-uithardingsmiddel.Giet de goed gemengde oplossing in de 3D-geprinte mal. Verwijder bellen in een vacuüm ontgassingskamer. Hard het een uur uit in een oven van 80 graden.Laat de PDMS-ring afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de uitgeharde PDMS-ring voorzichtig uit de mal. Bereiding van 1%Pluronic F-127.Weeg vijf gram Pluronic F-127 af. Giet het in een glazen fles. Voeg vervolgens 100 miljoen Milli-Q water toe aan de glazen fles.Dit geeft een 5%Pluronic F-127 oplossing. Zorg ervoor dat al het Pluronic F-127 poeder in het water is ondergedompeld. Sluit de dop en autoclaaf deze met behulp van een programma voor de sterilisatiecyclus van de vloeistof.Laat de oplossing voor gebruik afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 10 mil 5%Pluronic F-127 oplossing toe aan 40 mil autoclaaf Milli-Q water om 1%Pluronic F-127 oplossing te maken. Voer de verdunning uit in een afzuigkap van een bioveiligheidskast.Bewaar zowel 1% als 5% Pluronic F-127 bij kamertemperatuur. Coating van 6-put plaat. Autoclaaf roestvrijstalen module, PDMS-ring en pincet voor gebruik.Voer alle daaropvolgende procedures uit in een BSC-kap en neem aseptische technieken in acht om steriliteit te garanderen. Plaats de PDMS-ring in een 6-put met een pincet. Gebruik de externe rand van de PDMS-ring om de PDMS-ring concentrisch in de put uit te lijnen.Let op, alleen niet-weefselkweekbehandelde putplaten mogen worden gebruikt. Plaats de roestvrijstalen module met een pincet op de PDMS-ring. Steek de uiteinden van de interne borgringtang in de greepgrepen van de borgring.Knijp in de houder om de diameter van de borgring te verkleinen. Plaats het in de 6-put, druk het stevig op de roestvrijstalen module en laat de tang los om de PDMS-ring in de put te zetten. Voeg een mil van vijf microgram per microliter fibronectine toe aan het midden of de rand van de put, afhankelijk van de interesseregio, door het openen van PDMS-ring en roestvrijstalen module.Wervel de plaat om ervoor te zorgen dat de fibronectine-oplossing alle interessegebieden bestrijkt. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden in een bevochtigde incubator onder 95% lucht en 5% CO2. Verwijder de fibronectineoplossing uit de put.En nu twee keer wassen met PBS. Als u klaar bent, verwijdert u de PBS volledig uit de put. Verwijder de borgring, roestvrijstalen module en PDMS-ring uit de put.Voeg 1,5 mil 1%Pluronic F-127 toe aan de put en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur om het ongecoate oppervlak te passiveren. Haal de Pluronic F-127 oplossing uit de put en was driemaal met PBS. Eenmaal gewassen, gebruik de gecoate put onmiddellijk of bewaar op vier graden gedurende maximaal twee weken met de laag PBS in de gecoate put.Zaaien van endotheelcellen. Tel cellen met behulp van een hemocytometer en zaad 180.000 cellen in een gecoate 6-put plaat in 1,5 mil pre-warm celkweekmedium. Schud de putplaat zijdelings om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig in de put verdelen.Laat het 's nachts in een 37 graden bevochtigde incubator onder 95% lucht en 5% CO2. Shear stress applicatie met behulp van een orbitale shaker. Cellen moeten na drie dagen groei samenvloeien.Vervang het medium door 1,9 mil voorgeïnd waarschuw celkweekmedium om een hoogte van twee millimeter te bereiken. Plaats een putplaat op het platform van een orbitale shaker in een bevochtigde incubator en wervel deze drie dagen bij 150 RPM. Optioneel kunnen na twee dagen afschuiven cytokinen worden toegevoegd aan het celkweekmedium om het samenspel tussen cytokinen en pure stress te onderzoeken.Knip na de behandeling de cellen nog een dag af. In deze studie werd TNF-alpha gebruikt om de cellen te activeren. Voer de analyse uit na drie dagen van afschuifspanning.Microscoopbeelden tonen aan dat Pluronic F-127 HUVEC-hechting aan het gebied voorkwam zonder fibronectinecoating. Er waren geen HUVECs bevestigd aan het deel van het putoppervlak dat niet was voorbehandeld met fibronectine vóór passivering van Pluronic F-127 na 24 uur, in figuur A, en 72 uur, in figuur C, van de groei. Zonder Pluronic F-127 passivering werden HUVECs zonder fibronectine aan het oppervlak bevestigd, 24 uur na het zaaien, in figuur B, en worden ze verder verspreid met 72 uur, in figuur D.De schaalbalk is gelijk aan 500 micrometer.Nucleaire rode vlek toont de morfologie van geschoren HUVECs, A, in het midden, en B, aan de rand van een volledige put. Schaalbalk is gelijk aan honderd micrometer. A en B tonen ook celcontouren afgebakend door immunostaining van ZO-1.Let op de uitlijning en rek van cellen aan de rand, maar niet in het midden. Het toont geen significant verschil in nucleaire vormindex, wat wijst op rondheid, tussen HUVECs die in volle put zijn gekweekt en gesegmenteerde putten werden waargenomen voor onbehandelde of met TNF-alfa behandelde HUVECs. Cellen waren meer langwerpig aan de rand van de put.Een tendens naar een grotere rek in met TNF-alfa behandelde HUVECs was niet consistent significant op verschillende locaties. Er werd geen significant verschil waargenomen tussen volledige en gesegmenteerde putten in dichtheidsaantal A, onbehandeld, en B, TNF-alfa-behandelde HUVECs op verschillende radiale locaties. In beide gevallen waren er meer cellen per eenheidsgebied aan de rand dan in het midden van de put.Concluderend, de methode die we hier hebben geschetst, stelt u in staat om cellen te laten groeien in slechts één gebied van de wervelende put of zelfs van elk op plastic gebaseerd celkweeksysteem. Dat betekent dat cellen in een deel van de put die één type stroom ervaren, niet worden beïnvloed door bemiddelaars die vrijkomen uit cellen in een andere regio die verschillende stromen ervaren. Niet alleen dat, we kunnen kijken naar cellen die in één regio worden gekweekt met of zonder cellen die in andere regio's worden gekweekt.Dat maakt het mogelijk om de effecten van dergelijke oplosbare mediatoren aan te toonden. Het testen van de effecten van geconditioneerd medium op naïeve cellen maakt hetzelfde mogelijk. Door het conditiemedium te analyseren, kunnen de bemiddelaars worden geïdentificeerd.

segmenting-growth-endothelial-cells-6-well-plates-on-an-orbital

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Deze studie gebruikte een multi-well plaat microfluïdische systeem aanzienlijk verhogen doorvoer cel rollen studies onder fysiologisch relevante schuifkracht. Gezien het belang van cel rollen in het multi-step cel homing cascade en het belang van cel homing na systemische toediening van exogene populaties van cellen bij patiënten, biedt dit systeem potentieel als een screening platform om celtherapie verbeteren.

Systematische analyse van In Vitro Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System

Verschillende niveaus en patronen van vloeistofschuifspanning zijn bekend om hun modulatie van endothèle genexpressie, fenotype en gevoeligheid voor ziekten. We bespreken de samenstelling en het gebruik van'schuifringen': een model dat unidirectionele, periodieke schuurspanningspatronen produceert. Schuifringen zijn eenvoudig te assembleren, economisch en kunnen hoge celopbrengsten produceren.

De Algemene Vergadering en de toepassing van &#39;Shear Rings&#39;: A Novel endotheliale Model voor Orbital, Unidirectionele en Periodieke Fluid Flow en Shear Stress

Het behoud van de bloeddrukbarriere dekking is de sleutel voor de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de fundamentele en pathologische processen te definiëren die de bloeddrukbeperking moduleren.

In Vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van O-vormige vaartuigen, gespecialiseerd schorsing culturen van cellulaire aggregaten, met orbitale schudden. De HEK293 cellen gekweekt in deze tas vormen meer homogene aggregaten dan die gekweekt in een conventionele kweekvat.

Een cultuur van zoogdiercellen schudden in O-vormige schepen tot uniforme aggregaten orbitaal

Driedimensionaal co-Culture spheroid-systeem voor angiogenese is ontworpen om de fysiologische angiogenese na te bootsen. Co-Culture sferoïden worden gevormd door twee humane vasculaire celprecursoren, ecfcs en MSCS, en ingebed in collageen gel. Het nieuwe systeem is effectief voor het evalueren van angiogene modulatoren en verschaft relevantere informatie aan de in vivo studie.

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

Hier wordt een eenvoudige workflow beschreven om endotheelcellen te onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen, gevolgd door een gedetailleerd protocol voor hun mechanische stimulatie. Dit maakt het mogelijk om de ontwikkelingsmechanobiologie van endotheelcellen te bestuderen. Deze aanpak is compatibel met stroomafwaartse assays van levende cellen die na mechanische stimulatie uit de kweekchip zijn verzameld.

In vitro Model van foetaal menselijk vat op chip om ontwikkelingsmechanobiologie te bestuderen

We presenteren een protocol voor high-throughput productie van vasculaire kanalen met flexibele afmetingen en gewenste patronen op een standaard plaat met zes putjes met behulp van 3D-bioprinttechnologie, ook wel vessels-on-a-plate (VOP) genoemd. Dit platform heeft het potentieel om de ontwikkeling van therapieën voor de aandoeningen die verband houden met gecompromitteerd endotheel te bevorderen.

High-throughput bioprinting-methode voor het modelleren van vasculaire permeabiliteit in standaard zeswellsplaten met maat- en patroonflexibiliteit

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Microfluïdische stromingskamers geëtst door fotolithografie en vervaardigd uit PDMS worden toegepast op functionele resultaten in verband met EG-dysfunctie en ontsteking te onderzoeken. In een representatief experiment het vermogen van differentiële schuifspanning moduleren monocyte celhechting aan cytokine geactiveerd EC monolagen wordt aangetoond.

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Leer een coatingmethode voor gelokaliseerde endotheelcelgroei in 6-putplaten met een orbitale shaker om schuifspanningseffecten te bestuderen. Dit model verbetert vasculaire biologieonderzoek.

Segmentering van de groei van endotheelcellen in 6-putplaten op een orbitale shaker voor mechanobiologische studies

Meer video's verkennen