Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Het algemene doel van deze clearing-techniek is om een weefselclearing-methode voor de rattenhersenen te ontwikkelen. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor de HIV-1 transgene rat. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het rattenhersenweefsel intact kan worden gelaten tijdens het clearing-proces, waardoor een volledige analyse op circuitniveau mogelijk is.

Kristin Kirchner, een promovenda uit mijn laboratorium, en ook Hailong Li, een onderzoeksmedewerker uit mijn lab, zullen de procedure demonstreren. Nadat de transcardiale perfusie is uitgevoerd bij een rat van drie tot zes weken oud, verwijder je de hersenen uit de schedel met behulp van een pincet. Plaats het vervolgens in een sagittale positie en snijd het in vier gelijke secties van drie millimeter breed met behulp van een scheermes en een rattenhersenmatrix.

Bevestig elke sectie in een vier procent PFA in een verzegeld plastic buisje van vijf milliliters overnacht op een shaker bij vier graden Celsius. Op de volgende dag, zet de fixatie voort bij kamertemperatuur gedurende een uur. Was elke sectie drie keer met PBS gedurende ongeveer 30 minuten per wasbeurt.

Incubeer de gewassen secties serieel in 20, 40, 60, 80 en 100% methanoloplossing gedurende een uur per keer. Herhaal de dehydratie met 100% methanol. Koel vervolgens de monsters in 100% methanol gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Bereid een oplossing met 66% DCM en 33% methanol en incubeer de gekoelde secties in deze oplossing overnacht bij kamertemperatuur met schudden. Op de volgende dag, was het monster twee keer met methanol gedurende 30 minuten en koel het in 100% methanol bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Voor het bleken, plaats het monster in verse vijf procent waterstofperoxide in methanol en incubeer het overnacht bij vier graden Celsius.

Na de overnachtelijke incubatie, incubeer het monster serieel in 80, 60, 40 en 20% methanoloplossingen gedurende een uur per keer bij kamertemperatuur. Incubeer vervolgens het monster in PBS gedurende een uur en was het twee keer in oplossing een gedurende een uur per wasbeurt. Vul een enkele milliliter spuit met 2,5 microliters van één procent biotin-CTB en injecteer het langzaam in de nucleus accumbens-plaats gedurende 20 seconden.

Laat de naaldpunt één minuut op zijn plaats en verwijder het langzaam gedurende 10 seconden om lekkage te voorkomen. Incubeer het monster in oplossing drie en vervolgens oplossing vier gedurende twee dagen elk in een waterbad van 37 graden Celsius. Voeg vervolgens het primaire antilichaam toe en vervolg de incubatie gedurende zeven dagen.

Was het monster vijf keer in oplossing twee gedurende een uur per wasbeurt en bewaar het in oplossing twee bij kamertemperatuur overnacht. Incubeer het monster met een secundair antilichaam gedurende zeven dagen in een waterbad van 37 graden Celsius. Was het vervolgens vijf keer in oplossing twee gedurende een uur per wasbeurt en bewaar het in oplossing twee bij kamertemperatuur overnacht in een donkere omgeving.

Incubeer het monster serieel in 20, 40, 60, 80 en 100% methanol gedurende een uur per keer bij kamertemperatuur. Incubeer het vervolgens in verse 100% methanol overnacht. Op de volgende dag, incubeer het monster in vers bereide 66% DCM in 33% methanol gedurende drie uur bij kamertemperatuur met schudden.

Na drie uur, incubeer het monster in dibenzylether zonder te schudden totdat het helder is. Bewaar het vervolgens in dibenzylether tot het beeldvormingsproces. Verkrijg een 3D-printerkamer en bevestig deze aan een microscoopglasplaat met behulp van epoxy.

Plaats het monster in de middelste vierkante ruimte in de kamer en vul de kamer volledig met dibenzylether. Plaats een 0,17 millimeter dikke dekglas over de kamer en oefen druk uit om ervoor te zorgen dat het volledig in contact staat met de wanden van de kamer. Verzegeld vervolgens de randen met epoxy.

Zorg ervoor dat je de kamer draait om luchtbellen te laten ontsnappen uit de vulopening. Vul de kamer met extra dibenzylether. Verzegeld vervolgens de vulopening met epoxy en laat het uitharden.

Bekijk het specimen met behulp van een confocale microscoop om een z-scan uit te voeren bij viervoudige vergroting. De confocale afbeelding van een hydrofobisch verhelderde weefselmonster bij viervoudige vergroting toont een dichte TH-kleuring in het substantia nigra-gebied, schaarse TH-neuronen naast de substantia nigra, en een donker zwart weefselgebied zonder TH-neuronen. De typische morfologie van een TH-positief neuron bij 20-voudige vergroting heeft een groot soma en verschillende vertakte processen.

Terwijl IBA1-gekleurde microglia kleine cellichamen en korte uitgebreide processen hebben. De ideale confocale afbeelding toont positieve en dichte TH-kleuring in het substantia nigra-gebied met geschikte fluorescentiegain. Voorbeelden van slechte confocale afbeeldingen omvatten een onjuist scherpgestelde afbeelding met te veel fluorescentiegain, een vals positieve kleuring met heldere punten die niet scherp staan op de rest van het weefsel, en een hoge achtergrondkleuring als gevolg van het gebruik van een blokkerend serum dat niet overeenkomt met een secundair antilichaam.

Positieve CTB-kleuring in de rattenhersenen wordt hier getoond. De lange dunne vezels zijn afferente projecties langs de dopaminerge route. Co-lokalisatie van TH en CTB maakt het mogelijk om de injectieplaats in het nucleus accumbens-gebied te visualiseren, die verschijnt als een dicht fluorescerend groen cirkel.

Co-lokalisatie van TH en CTB in de substantia nigra wordt hier getoond. Het belangrijkste om te onthouden bij het uitvoeren van deze procedure is om het monster voldoende tijd te geven om in alle antilichaamoplossingen te incuberen en voldoende tijd om volledig te verhelderen voordat het wordt afgebeeld. Het monster mag beperkt worden blootgesteld aan lucht, omdat dit het monster zal beschadigen.

Deze techniek is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt om veel verschillende eiwitten van belang te onderzoeken in versch