Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen
November 12th, 2020
Dit artikel is bedoeld om een protocol te presenteren over het bouwen van een spotvariatie Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (svFCS) microscoop om moleculaire diffusie te meten op het plasmamembraan van levende cellen.
De huidige kijk op de laterale organisatie van het plasmamembraan is nog onvolledig. Om deze reden is het belangrijk om enkele nieuwe innovatieve technieken te implementeren, zoals spot variatie Fluorescerende Correlatie Spectroscopie. Dit is een zeer krachtige techniek gekenmerkt door uitstekende tijd- en ruimtelijkheidsresolutie.
Bovendien is het niet-invasief en maakt het mogelijk om celmembranen onder fysiologische omstandigheden te bestuderen. Elke dag voor het uitvoeren van een experiment, open alle irisdiafragma's en gebruik een vermogensmeter om het laservermogen te meten met de eerste iris volledig open. Draai de halve plaat om de maximale kracht te lokaliseren.
Als het laservermogen lager is dan normaal, gebruik de irissen om de uitlijning te controleren en beweeg afwisselend L1 en M1 indien nodig. Noteer vervolgens de vermogenswaarde in een laboratoriumnotitieboek. Om de detectiepad te controleren, plaats water, een dekglas en een druppel van twee nanomolare rodamine 6G-oplossing op het objectief.
Start vervolgens de correlator software en neem de gegevens op. De autocorrelatiefunctie zou een lage hoeveelheid ruis moeten weergeven, een kleine afvalgrootte en een hoge tellingsnelheid per molecuul per seconde. Om de spotgrootte te kalibreren, plaats een celcultuur gecodeerde dekglas op het wateronderdompeling objectief en voeg 200 microliters van twee nanomolare rodamine 6G-oplossing toe aan het dekglas.
Pas de 488 nanometer laserstraalkracht aan op 300 microwatt en selecteer in de software de svFCS verlichting detectie microscooppoort. Schakel de APD in en open de iris totdat een signaal daalt om de minimale afvalgrootte te verkrijgen of sluit deze voor een grotere afvalgrootte. Neem ongeveer 10, 20-seconde autocorrelatiefuncties op om de statistische reproduceerbaarheid te verbeteren en schakel de APD uit.
In een geschikt data-analyseprogramma, controleer en gooi de runs weg met sterke fluctuaties vanwege moleculaire aggregaten, past vervolgens de gemiddelde van de behouden autocorrelatiefunctie met een 3d diffusiemodel aan, haal het gemiddelde diffusietijd uit de aanpassingsparameters en sla de gegevens op als een TXT-bestand. Voor svFCS-analyse, pas de 488 nanometer straalkracht aan tussen twee tot vier microwatt en breng de monsters in evenwicht gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Selecteer de svFCS verlichting detectie microscooppoort en op de APD.
Voer vervolgens een XY-scan en een Z-scan van de geselecteerde cel uit. Selecteer het plasmamembraan aan de bovenkant van de cel om de confocale spot bij de maximale fluorescentie-intensiteit te lokaliseren en start de gegevensverwerving. In de correlator software, neem een serie van 20, vijf seconde runs op.
Na de laatste run, schakel de APD uit en gooi alle onverwachte runs weg zoals gedemonstreerd. Past de gemiddelde autocorrelatiefunctie aan met een twee soorten 2d diffusiemodel en sla de aanpassingsparameters op in het eerder opgeslagen TXT-bestand. Wanneer alle cellen van belang zijn opgenomen, analyseer ten minste vier afvalgroottes variërend tussen 200 tot 400 nanometers om een enkele diffusiewet vast te stellen.
Vervolgens selecteert u in MATLAB een map met alle TXT-bestanden die overeenkomen met ten minste vier afvalgrootte-experimenten en plot de diffusietijd versus het vierkante afval. In deze figuur kan een diffusiewet voor Thy1-GFP geëxpresseerd in Cos7-cellen worden waargenomen. De diffusiewet heeft een positieve tijd nul waarde, wat aangeeft dat de Thy1-GFP beperkt is tot nano domeinstructuren van het plasmamembraan.
In deze analyse resulteerde de cholesteroloxidase behandeling van de cellen die Thy1-GFP tot expressie brengen in de verschuiving van de diffusiewet tijd nul waarde naar 7,36 plus of min 1,34 milliseconden. Dit bevestigt dat de aard van de Thy1-GFP beperking afhangt van het cholesterolgehalte en geassocieerd is met lipide raft nano domeinen. Er werd ook een kleine maar significante afname in het totale cholesterolgehalte waargenomen na behandeling met cholesteroloxidase.
Aangezien dit enzym alleen werkt op het cholesterolpool dat toegankelijk is aan de buitenste laag van het plasmamembraan, suggereren deze gegevens dat de waargenomen afname in cholesterol alleen geassocieerd is met het plasmamembraan en destabilisatie van de lipide raft nano domeinen veroorzaakt. Het belangrijkste bij het uitvoeren van deze procedure is de juiste kalibratie van het svFCS-systeem en de voorbereiding van cellen voor de analyse. svFCS is een uitstekend hulpmiddel om celmembraanorganisatie te bestuderen.
Het kan echter ook worden gebruikt om de diffusie van intracellulaire moleculen te analyseren. Deze techniek kan met succes worden geïmplementeerd in de biomedische wetenschappen om de invloed van potentiële geneesmiddelen op levende cellen, zoals kankercellen, te bepalen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bouwen van een spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscoop om moleculaire diffusie te meten aan het plasmamembraan van levende cellen. De techniek biedt uitstekende tijd- en ruimtelijke resolutie en is niet-invasief.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- De laterale organisatie van het plasmamembraan is niet volledig begrepen.
- Innovatieve technieken zoals svFCS zijn nodig voor betere inzichten.
- svFCS maakt het mogelijk om celmembranen onder fysiologische omstandigheden te bestuderen.
- Juiste kalibratie en celvoorbereiding zijn cruciaal voor nauwkeurige resultaten.
Doel van de studie
- Om een protocol voor svFCS-microscopie te ontwikkelen.
- Om moleculaire diffusie aan het plasmamembraan te meten.
- Om de invloed van cholesterol op membraanorganisatie te analyseren.
Gebruikte methoden
- Kalibratie van het svFCS-systeem met behulp van rhodamine 6G-oplossing.
- Gegevensverzameling door middel van XY- en Z-scans van geselecteerde cellen.
- Analyse van diffusiewetten met behulp van MATLAB.
- Vergelijking van diffusieparameters voor en na behandeling met cholesteroloxidase.
Belangrijkste resultaten
- Thy1-GFP-diffusie is beperkt tot nano-domeinstructuren.
- Behandeling met cholesteroloxidase verschuift de diffusiewet-tijd nul-waarde.
- Een afname in het totale cholesterolgehalte werd waargenomen.
- De studie suggereert dat cholesterol de stabiliteit van lipide rafts beïnvloedt.
Conclusies
- svFCS is effectief voor het bestuderen van celmembraanorganisatie.
- De techniek kan ook intracellulaire moleculaire diffusie analyseren.
- De bevindingen hebben implicaties voor het begrijpen van medicijneffecten op levende cellen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) enables high-resolution analysis of molecular diffusion at the plasma membrane under physiological conditions, providing critical insights into membrane organization and lipid raft dynamics. This capability supports target validation by elucidating the biophysical context of membrane-associated proteins, informing mechanistic de-risking in early discovery. The method’s non-invasive nature and compatibility with living cells enhance its utility in preclinical screening and translational biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying diffusion behavior of membrane proteins like Thy1-GFP within nanodomain structures.
- Operational Value: Reveals cholesterol-dependent confinement, enabling functional validation of lipid raft associations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets whose membrane localization is sensitive to lipid environment perturbations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline diffusion laws under physiological conditions.
- Quantitative Output: Generates reproducible diffusion time measurements across varying beam waist sizes, supporting assay standardization.
- Screening Relevance: Detects compound-induced shifts in diffusion parameters, indicating alterations in membrane organization or target engagement.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models plasma membrane raft nanodomain disruption, relevant to pathologies involving lipid dysregulation.
- Translational Continuity: Connects early discovery observations to preclinical validation by demonstrating how environmental perturbations (e.g., cholesterol modulation) alter target behavior.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic readouts that inform go/no-go criteria based on target resilience to membrane perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
svFCS fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, offering a biophysical layer of characterization that complements biochemical and phenotypic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring diffusion coefficients and identifying confined vs. mobile molecular populations.
- Screening: Enables assay readiness through standardized calibration using rhodamine 6G and validation of detection path integrity.
- Analytics: Delivers quantitative diffusion laws via MATLAB analysis of auto correlation functions, allowing comparison of molecular behavior across conditions.
- Translational Research: Links membrane organization changes to functional outcomes, supporting biomarker alignment when diffusion shifts correlate with phenotypic responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying membrane protein dynamics across multiple targets and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving nanoscale confinement and diffusion heterogeneity at the plasma membrane.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized laser power calibration, detection path checks, and replicate auto correlation function averaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying target stability in native-like membrane environments, reducing late-stage attrition due to unforeseen biophysical liabilities.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their dependence on lipid raft integrity for proper localization and function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, laser safety, and correlation spectroscopy data analysis.
- Needs a customized fluorescence microscope with APD, correlator software, and precise laser power control (2–4 µW for svFCS measurements).
- Demands cross-team standardization of calibration protocols (e.g., rhodamine 6G spot size validation) and data analysis pipelines (e.g., MATLAB fitting of 2D diffusion models).
- Involves adaptation considerations for different membrane proteins, cell types, and perturbation agents beyond cholesterol oxidase.
- Limited by the need for careful sample preparation to avoid molecular aggregates and ensure physiological relevance during 37°C equilibration.
