Name: Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Leer spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen. Deze niet-invasieve methode biedt uitstekende temporele en ruimtelijke resolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SB, SM en DM werden ondersteund door institutionele financiering van de CNRS, Inserm en Aix-Marseille University en programmasubsidies van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR-17-CE15-0032-01 en ANR-18-CE15-0021-02) en het Franse "Investissement d'Avenir" (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW erkent "BioTechNan", een programma van interdisciplinaire milieudoctorale studies KNOW op het gebied van biotechnologie en nanotechnologie. EB erkent de financiële steun van het National Science Centre of Poland (NCN) in het kader van project nr. 2016/21/D/NZ1/00285, evenals de Franse regering en de ambassade van Frankrijk in Polen. MŁ erkent de financiële steun van het Poolse ministerie van Ontwikkeling (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) en het Nationaal Centrum voor Onderzoek en Ontwikkeling (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT erkent financiële steun van het National Science Center of Poland (NCN) in het kader van project nr. 2016/21/B/NZ3/00343 en van het Wroclaw Biotechnology Center (KNOW).

<ol><li>Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+are+more+mosaic+than+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membranes are more mosaic than fluid.</a> Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).</li>
<li>Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+ABC+kinases+by+phosphorylation%3A+protein+kinase+C+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm.</a> The Biochemical Journal. 370, Pt 2 361-371 (2003).</li>
<li>Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+in+the+plasma+membrane%3A+how+to+combine+fluidity+and+order%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order.</a> The EMBO Journal. 25 (15), 3446-3457 (2006).</li>
<li>Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+lipid+rafts%3A+From+model+membranes+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The state of lipid rafts: From model membranes to cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. , (2003).</li>
<li>Lingwood, D., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+as+a+membrane-organizing+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts as a membrane-organizing principle.</a> Science. , (2010).</li>
<li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annual Reviews of Physical Chemistry. 62, 417-436 (2011).</li>
<li>Rossy, J., Ma, Y., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+cell+membrane%3A+Do+proteins+rule+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The organisation of the cell membrane: Do proteins rule lipids.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20 (1), 54-59 (2014).</li>
<li>Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluid+-+Mosaic+Model+of+Membrane+Structure%3A+Still+relevant+to+understanding+the+structure%2C+function+and+dynamics+of+biological+membranes+after+more+than+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The Fluid - Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (6), 1451-1466 (2014).</li>
<li>Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+undergo+hop+diffusion+in+compartmentalized+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1081 (2002).</li>
<li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+shift+of+the+plasma+membrane+concept+from+the+two-dimensional+continuum+fluid+to+the+partitioned+fluid%3A+high-speed+single-molecule+tracking+of+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 351-378 (2005).</li>
<li>Destainville, N., Salomé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), 17-19 (2006).</li>
<li>Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Un%29confined+diffusion+of+CD59+in+the+plasma+membrane+determined+by+high-resolution+single+molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy.</a> Biophysical Journal. 92 (10), 3719-3728 (2007).</li>
<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. , (1976).</li>
<li>Petrášek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2008).</li>
<li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((40+Years+of+FCS%3A+How+it+all+began%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">40 Years of FCS: How it all began.</a> Methods in Enzymology. , (2013).</li>
<li>Elson, E. L., Magde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy.+I.+Conceptual+basis+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory.</a> Biopolymers. , (1974).</li>
<li>Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy.+II.+An+experimental+realization%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization.</a> Biopolymers. , (1974).</li>
<li>Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+in+living+cells+observed+by+fluorescence+correlation+spectroscopy+with+one-+and+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation.</a> Biophysical Journal. , (1999).</li>
<li>Bouchaud, J. P., Georges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+diffusion+in+disordered+media%3A+Statistical+mechanisms%2C+models+and+physical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Reports%22%5BJournal%5D)">Anomalous diffusion in disordered media: Statistical mechanisms, models and physical applications.</a> Physics Reports. , (1990).</li>
<li>Yechiel, E., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrometer-scale+domains+in+fibroblast+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Micrometer-scale domains in fibroblast plasma membranes.</a> Journal of Cell Biology. 105 (2), 755-760 (1987).</li>
<li>Salomé, L., Cazeils, J. L., Lopez, A., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+domains+by+FRAP+experiments+at+variable+observation+areas%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane domains by FRAP experiments at variable observation areas.</a> European Biophysics Journal. 27 (4), 391-402 (1998).</li>
<li>Niv, H., Gutman, O., Kloog, Y., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+K-Ras+and+H-Ras+display+different+interactions+with+saturable+nonraft+sites+at+the+surface+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated K-Ras and H-Ras display different interactions with saturable nonraft sites at the surface of live cells.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (5), 865-872 (2002).</li>
<li>Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+diffusion+laws+to+probe+the+submicron+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization.</a> Biophysical Journal. 89 (6), 4029-4042 (2005).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+corralation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence corralation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2005).</li>
<li>Lenne, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+confinement+in+the+plasma+membrane+by+microdomains+and+the+cytoskeleton+meshwork%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork.</a> EMBO Journal. 25 (14), 3245-3256 (2006).</li>
<li>Ruprecht, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+contractility+triggers+a+stochastic+switch+to+fast+amoeboid+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility.</a> Cell. , (2015).</li>
<li>Billaudeau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+plasma+membrane+organization+in+living+cells+by+spot+variation+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 519, 277-302 (2013).</li>
<li>Mailfert, S., Hamon, Y., Bertaux, N., He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+for+characterizing+plasma+membrane+subdomains+in+living+cells+by+spot+variation+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide for characterizing plasma membrane subdomains in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Cell Biology. 139, 1-22 (2017).</li>
<li>Rege, T. A., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1%2C+a+versatile+modulator+of+signaling+affecting+cellular+adhesion%2C+proliferation%2C+survival%2C+and+cytokine%2Fgrowth+factor+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Thy-1, a versatile modulator of signaling affecting cellular adhesion, proliferation, survival, and cytokine/growth factor responses.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. , (2006).</li>
<li>Cahuzac, N., et al. Fas ligand is localized to membrane rafts, where it displays increased cell death-inducing activity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCahuzac%2C+N+%22Blood%22">Blood</a>. , (2006).</li>
<li>Guia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+of+activating+receptors+at+the+plasma+membrane+controls+natural+killer+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Confinement of activating receptors at the plasma membrane controls natural killer cell tolerance.</a> Science Signaling. 4 (167), 21(2011).</li>
<li>Blouin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation-dependent+IFN-%CE%B3R+partitioning+in+lipid+and+actin+nanodomains+is+critical+for+JAK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation-dependent IFN-γR partitioning in lipid and actin nanodomains is critical for JAK activation.</a> Cell. 166 (4), 920-934 (2016).</li>
<li>Chouaki-Benmansour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+regulate+the+TCR%2FCD3+complex+membrane+dynamics+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides regulate the TCR/CD3 complex membrane dynamics and activation.</a> Scientific Reports. , (2018).</li>
<li>Wawrezinieck, L., Lenne, P. F., Marguet, D., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+to+determine+diffusion+laws%3A+application+to+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+Micro-+and+Nano-Imaging%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy to determine diffusion laws: application to live cell membranes.</a> Biophotonics Micro- and Nano-Imaging. , (2004).</li>
<li>Masuda, A., Ushida, K., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescence+correlation+spectroscopy+enabling+direct+observation+of+spatiotemporal+dependence+of+diffusion+constants+as+an+evidence+of+anomalous+transport+in+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">New fluorescence correlation spectroscopy enabling direct observation of spatiotemporal dependence of diffusion constants as an evidence of anomalous transport in extracellular matrices.</a> Biophysical Journal. , (2005).</li>
<li>Humpolíčková, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. , (2006).</li>
<li>Benda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+diffusion+coefficients+in+planar+phospholipid+systems+by+confocal+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to determine diffusion coefficients in planar phospholipid systems by confocal fluorescence correlation spectroscopy.</a> Langmuir. , (2003).</li>
<li>Ganguly, S., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+depletion+mimics+the+effect+of+cytoskeletal+destabilization+on+membrane+dynamics+of+the+serotonin1A+receptor%3A+A+zFCS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cholesterol depletion mimics the effect of cytoskeletal destabilization on membrane dynamics of the serotonin1A receptor: A zFCS study.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li>
<li>Wenger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+analysis+within+single+nanometric+apertures+reveals+the+ultrafine+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization.</a> Biophysical Journal. 92 (3), 913-919 (2007).</li>
<li>Manzo, C., Van Zanten, T. S., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+fluorescence+correlation+spectroscopy+on+intact+living+cell+membranes+with+NSOM+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes.</a> Biophysical Journal. , (2011).</li>
<li>Regmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+optical+nanoantennas+resolve+cholesterol-dependent+nanoscale+heterogeneities+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Planar optical nanoantennas resolve cholesterol-dependent nanoscale heterogeneities in the plasma membrane of living cells.</a> Nano Letters. , (2017).</li>
<li>Mueller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FCS+in+STED+microscopy%3A+Studying+the+nanoscale+of+lipid+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">FCS in STED microscopy: Studying the nanoscale of lipid membrane dynamics.</a> Methods in Enzymology. , (2013).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+nanoscale+diffusion+dynamics+in+cellular+membranes+with+super-resolution+STED-FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring nanoscale diffusion dynamics in cellular membranes with super-resolution STED-FCS.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+STED-background+corrected+fitting+model+for+unbiased+STED-FCS+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A straightforward STED-background corrected fitting model for unbiased STED-FCS analyses.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Veerapathiran, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+imaging+FCS+diffusion+law+in+the+presence+of+multiple+diffusive+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The imaging FCS diffusion law in the presence of multiple diffusive modes.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Gupta, A., Phang, I. Y., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+hop+or+not+to+hop%3A+exceptions+in+the+FCS+diffusion+law%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">To hop or not to hop: exceptions in the FCS diffusion law.</a> Biophysical Journal. , (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben we de implementatie van de svFCS-module op een standaard fluorescerende microscoop beschreven, een krachtige experimentele benadering om de dynamiek van de plasmamembraanorganisatie in levende cellen te ontcijferen dankzij de FCS-diffusiewetanalyse. Conceptueel is de svFCS gebaseerd op een eenvoudig principe: correlatiemetingen van fluorescentie in het tijdsdomein, terwijl de grootte van het verlichtingsgebiedvarieert 23. Deze strategie is instrumenteel geweest bij het afleiden van nanoscopische informatie uit microscopische metingen, die helpt bij het ontcijferen van de belangrijkste fysisch-chemische elementen die bijdragen aan de plasmamembraanorganisatie in steady state25 en fysiologische processen 30,31,32,33. Al met al tonen deze svFCS-analyses ondubbelzinnig het bestaan aan van lipide-afhankelijke nanodomeinen in verschillende celtypen en hun directe implicatie bij het afstemmen van verschillende signaleringsgebeurtenissen.
Binnen dit kader zijn er enkele optische aspecten waarmee rekening moet worden gehouden bij het bouwen van de svFCS-opstelling om het fotonenbudget te optimaliseren en optische aberraties te minimaliseren. Daarom raden we aan een microscoop te gebruiken waaruit de buislens kan worden verwijderd wanneer de svFCS-meting wordt uitgevoerd. Bovendien speelt een enkele iris een sleutelrol in de svFCS-opstelling: het verandert de straalgrootte bij de achterste opening van het objectief, waardoor de effectieve tailleomvang (d.w.z. het effectieve excitatievolume) direct varieert. De balkdiameter moet passen bij de achterste pupil van het objectief om de kleinste taillemaat34 te verkrijgen. Deze optie, die helpt bij het afstemmen van de tailleomvang, zorgt voor optimalisatie van het fotonenbudget en is eenvoudig te implementeren. Ten slotte wordt een minimaal aantal optische onderdelen gebruikt langs het lichtpad; hoe minder complex het systeem, hoe minder fotonen er verloren gaan. Al deze opties verbeteren de robuustheid van svFCS-experimenten aanzienlijk.
Met betrekking tot het protocol zelf moeten een paar kritische stappen worden overwogen. Het belangrijkste is een passende uitlijning van de optische paden die cruciaal is voor succesvolle svFCS-metingen (protocol, paragraaf 2). Dit is eenvoudig te controleren door het fluorescentiesignaal van een 2 nM Rh6G-oplossing te analyseren, die ~ 200 kHz onder 300 μW laserverlichting zou moeten zijn. Alle irissen moeten worden geopend en de ACF's moeten een belangrijke amplitude hebben (meestal G0 ~ 1,5-2,0). Een ander kritiek punt betreft de cellen en hun voorbereiding op svFCS-analyse (protocol, secties 4-8). Hun dichtheid moet worden aangepast, zodat geïsoleerde cellen die moeten worden waargenomen, beschikbaar zijn voor analyse. Niet-hechtende cellen moeten worden geïmmobiliseerd op een kamerglas met behulp van poly-L-lysine-oplossing. Het fluorescentiesignaal van celetikettering mag niet te sterk zijn, anders zal het resulteren in zeer platte ACF's die moeilijk te passen zijn, en de fitparameters worden belast met een belangrijke fout. Bovendien maken niet-homogene etiketterings- en fluorescentieaggregaten in cellen de svFCS-metingen uiterst moeilijk te interpreteren. Ten slotte beïnvloedt de behandeling met cholesteroloxidase de levensvatbaarheid van de cellen en mag de svFCS-analyse niet langer dan een uur na de behandeling plaatsvinden. Het is ook beter om de fluorescentiefluctuaties van het bovenste plasmamembraan te registreren, omdat het niet aan de ondersteuning is bevestigd en er geen risico is op belemmerde diffusie van moleculen als gevolg van de fysieke interacties met de ondersteuning.
Er is voldoende vooruitgang geboekt in de svFCS-techniek voor het gebruik ervan in verschillende benaderingen vanwege de diversiteit aan modaliteiten voor het aanpassen van het detectievolume, waardoor het mogelijk is om verschillende biologische processen in levende cellen te bestuderen. Een alternatief voor het aanpassen van de grootte van het excitatievolume is het gebruik van een variabele bundelexpander35. Het is ook mogelijk om eenvoudig de grootte van het verlichtingsgebied te moduleren door het fluorescerende signaal van de onderschepping van het plasmamembraan langs de z-richting36 te registreren. Dit kan op een standaard confocale microscoop waarvoor een theoretisch kader is ontwikkeld om de diffusiewet af te leiden37,38.
Hoewel de svFCS-methode spatio-temporele resolutie biedt, die nodig is voor de karakterisering van de inhomogene laterale organisatie van het plasmamembraan, sluiten de geometrische manieren van opsluiting elkaar niet uit. Een afwijking van t0 in de ene of de andere richting onthult uitsluitend een dominante manier van opsluiting25. Bovendien is een andere belangrijke beperking van de huidige svFCS-methode het gevolg van de klassieke optische diffractielimiet (~ 200 nm). Dit is ongetwijfeld groter dan de domeinen die de moleculen in het celplasmamembraan beperken. Daarom wordt de analyse van de opsluiting afgeleid uit de t 0-waarde, geëxtrapoleerd uit de diffusiewet.
Dit nadeel is overwonnen door alternatieve methoden te implementeren. Aanvankelijk bood het gebruik van metalen films geboord met nanoapertures de mogelijkheid om een zeer klein membraanoppervlak te verlichten (d.w.z. onder de optische diffractielimiet van enkele nanometrische openingen van radii variërend tussen 75 en 250 nm)39. Het overgangsregime voorspeld op basis van de theoretische diffusiewet voor geïsoleerde domeinorganisatie werd dus gerapporteerd, en het maakte een verfijning mogelijk van de karakteristieke grootte van de nanometrische membraanheterogeniteiten en een kwantitatieve schatting van het oppervlak bezet door lipide-afhankelijke nanodomeinen39. Als alternatief is nanometrische verlichting ook ontwikkeld met behulp van near-field scanning optische microscopie40 of planaire optische nanoantennas41. Meer recent heeft het combineren van gestimuleerde emissiedepletie (STED) en FCS een krachtig en gevoelig hulpmiddel geboden om de diffusiewet met een zeer hoge ruimtelijke resolutie te documenteren. Deze STED-FCS geeft toegang tot moleculaire diffusiekenmerken op nanoschaal die binnen een korte tijdsperiode plaatsvinden, waardoor de dynamische organisatie van lipidensondes op het plasmamembraan42,43 kan worden bestudeerd. De onvolledige onderdrukking van fluorescentie in het SOA-proces daagt echter de analyse van de autocorrelatiecurven in FCS uit.
Er is een nieuw pasmodel ontwikkeld om deze moeilijkheid te overwinnen en de nauwkeurigheid van de diffusietijden en gemiddelde molecuulaantallen te verbeteren44. Ten slotte kan voor langzame moleculaire diffusie op het plasmamembraan het svFCS-principe worden toegepast op gegevens die zijn geregistreerd door beeldcorrelatiespectroscopie45. Onlangs is aangetoond dat het combineren van atoomkrachtmicroscopie (AFM) met beeldvorming totale interne reflectie-FCS (ITIR-FCS) bijdraagt aan de verfijning van de aard van het mechanisme dat moleculaire diffusie op het plasmamembraan belemmert, vooral in de buurt van de percolatiedrempelmembraanconfiguratie vanwege een hoge dichtheid van nanodomeinen46.
Concluderend heeft het vaststellen van de diffusiewet door svFCS het experimentele bewijs geleverd om lokale heterogeniteit af te leiden die is gecreëerd door dynamische collectieve lipiden- en membraaneiwitassociaties. Zoals Wohland en collega's46 stelden, "blijft de FCS-diffusiewetanalyse een waardevol hulpmiddel om structurele en organisatorische kenmerken onder de resolutielimiet af te leiden uit dynamische informatie". Toch moeten we nieuwe modellen ontwikkelen om de interpretatie van de diffusiewet te verfijnen die een beter begrip mogelijk moet maken van de dynamiek van de moleculaire gebeurtenissen die zich voordoen op het plasmamembraan.

De complexiteit van plasmamembraanorganisatie Het huidige begrip van celmembraanorganisatie moet rekening houden met verschillende aspecten1. Ten eerste varieert een complexe lipidesamenstelling niet alleen tussen celtypen, maar ook binnen een enkele cel (membraanorganellen / plasmamembraan). Bovendien zijn geassocieerde of intrinsieke membraaneiwitten meestal georganiseerd in dynamische multimere complexen, met grote domeinen die zich buiten het membraan uitstrekken, goed voor een aanzienlijk groter gebied dan dat van de transmembraandomeinen alleen. Bovendien vertonen membraan-geassocieerde eiwitten specifieke lipidebindende of lipide-interagerende capaciteiten die een rol spelen bij het reguleren van de eiwitfunctie. Deze zijn direct afhankelijk van de lokale samenstelling en toegankelijkheid van de lipiden2.
Ten slotte wordt een significant niveau van asymmetrie waargenomen tussen twee membraanfolders vanwege de intrinsieke asymmetrische structuur van membraaneiwitten en de verdeling van lipiden. Inderdaad, een lipide metabolische balans tussen synthese en hydrolyse, gecombineerd met lipide flip-flop tussen de folders, genereert een dergelijke asymmetrische verdeling. Omdat elk transport over de bilayer wordt beperkt door de vrije energie die nodig is om de polaire kopgroep door het hydrofobe binnenste van de membranen te bewegen, wordt het meestal bijgestaan door selectieve transporters. Voor elk celtype wordt de asymmetrie meestal stevig gehandhaafd. Al met al dragen deze factoren bij aan laterale inhomogeniteit of compartimentering van het plasmamembraan 3,4.
We verrijken deze representatie van het plasmamembraan door rekening te houden met de intrinsieke moleculaire diffusie binnen en over de bilayer, die bijdraagt aan de dynamische laterale heterogeniteit op een schaal van tienden tot honderden nanometers en microseconden tot seconden. Lipide-afhankelijke membraan nanodomeinen - de zogenaamde lipide vlotten, gedefinieerd als cholesterol, en sfingolipide-rijke signaleringsplatforms - dragen bijvoorbeeld bij aan de compartimentering van het plasmamembraan 5,6. De huidige visie op membraanorganisatie is echter niet beperkt tot lipidevlotten alleen. Membraan nanodomeinen zijn complexer en heterogener in samenstelling, oorsprong en functie. Toch moet hun aanwezigheid op het plasmamembraan nauw worden gecoördineerd en dynamische interacties tussen eiwitten en lipiden lijken belangrijk te zijn bij de ruimtelijke verdeling en chemische modificatie van membraannanodomeinen 1,3,7,8.
Het svFCS-principe en de toepassing ervan om de organisatie van het plasmamembraan te onderzoeken Hoewel er veel vooruitgang is geboekt in de analyse van membraandomeinen, voornamelijk door middel van biofysische technieken, moeten de determinanten die de lokale organisatie van het plasmamembraan dicteren, worden verfijnd met de juiste ruimtelijke en temporele resolutie. Determinanten op basis van het volgen van individuele moleculen bieden uitstekende ruimtelijke precisie en maken de karakterisering van verschillende bewegingsmodi 9,10,11,12 mogelijk, maar hebben een beperkte temporele resolutie met klassieke lage cameraframesnelheden en vereisen meer experimentele inspanning om een aanzienlijk aantal trajecten vast te leggen. Als alternatief kan de diffusiecoëfficiënt van membraancomponenten worden geëvalueerd door Fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP)13 of Fluorescentie correlatiespectroscopie (FCS)14. Dit laatste heeft meer aandacht gekregen, vooral vanwege de hoge gevoeligheid en selectiviteit, het microscopische detectievolume, de lage invasiviteit en het brede dynamische bereik15.
De conceptuele basis van FCS werd ongeveer 50 jaar geleden geïntroduceerd door Magde en collega's 16,17. Het is gebaseerd op het registreren van de fluctuatie van fluorescentie-emissie met een hoge temporele resolutie (van μs tot s)18. In zijn moderne versie worden metingen in levende cellen uitgevoerd door een klein confocaal excitatievolume (~ 0,3 femtoliters) geplaatst binnen een interessant gebied (bijvoorbeeld bij het plasmamembraan); het fluorescentiesignaal dat wordt gegenereerd door diffusie van fluorescerende moleculen die in en uit het waarnemingsvolume gaan, wordt verzameld met een zeer hoge temporele resolutie (d.w.z. de aankomsttijd van elk foton op de detector). Vervolgens wordt het signaal berekend om de autocorrelatiefunctie (ACF) te genereren, waaruit de gemiddelde tijd td (diffusietijd) wordt geëxtraheerd waarvoor een molecuul binnen het focale volume blijft, samen met het gemiddelde aantal deeltjes (N), aanwezig in het waarnemingsvolume, dat omgekeerd evenredig is met de amplitude van het AKF. Deze laatste parameter kan nuttige informatie zijn over de molecuulconcentratie binnen het waarnemingsvolume.
Sindsdien is een groeiend aantal FCS-modaliteiten geïmplementeerd dankzij de zich snel ontwikkelende instrumentatie in de biofotonica, waardoor dynamische verschijnselen in levende systemen kunnen worden beschreven. Toch zou een moleculaire soort een meer overlappende verdeling van de diffusiecoëfficiëntwaarden ervaren, die meestal wordt weerspiegeld door een abnormale diffusiekarakteristiek, waarbij moleculen diffunderen met een niet-lineaire relatie in tijd19, en moeite met het identificeren van de biologische betekenis van deze abnormale subdiffusie. In het verleden is deze moeilijkheid enigszins overwonnen door de moleculaire diffusie door FRAP te registreren vanuit gebieden van verschillende groottes, in plaats van vanuit slechts één gebied, waardoor aanvullende ruimtelijke informatie wordt verkregen. Dit maakte bijvoorbeeld de conceptualisering van membraanmicrodomeinen 20,21,22 mogelijk.
Een vertaling van deze strategie naar FCS-metingen (d.w.z. de zogenaamde spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie (svFCS)) werd tot stand gebracht door de grootte van het focale waarnemingsvolume te variëren, waardoor de fluctuatie in fluorescentie op verschillende ruimtelijke schalen kon worden geregistreerd23. De svFCS-benadering biedt dus indirecte ruimtelijke informatie die de identificatie en bepaling van moleculaire diffusiemodi en het type membraanpartitionering (geïsoleerde versus aaneengesloten domeinen24) van bestudeerde moleculen mogelijk maakt. Door de diffusietijd td uit te zetten als een functie van de verschillende ruimtelijke schalen gedefinieerd door de taille (ω) waarde, die overeenkomt met de detectiestraalgrootte in dit geval23,25, kan men de diffusiewet van een bepaald molecuul in een bepaalde fysiologische toestand karakteriseren. Het svFCS is daarom een perfect analoog aan single-particle tracking in het tijdsdomein26. Onder de Brownse diffusiebeperking mag men een strikt lineaire relatie verwachten tussen de diffusietijd td en de taille ω (figuur 1)23,25. De oorsprong van de afwijking van de diffusiewet van dit schema kan worden toegeschreven aan niet-exclusieve redenen, zoals cytoskelet meshwork, moleculaire crowding, dynamische partitionering in nanodomeinen, of een combinatie van deze en andere effecten (figuur 1), en moet experimenteel worden getest25.
Hier bieden we alle benodigde controlepunten voor het dagelijks gebruik van een op maat gemaakt svFCS-optisch systeem dat helemaal opnieuw is gebouwd, dat een aanvulling vormt op onze eerdere protocolbeoordelingen27,28 over die experimentele aanpak. Verder geven we als proof of concept richtlijnen met betrekking tot de kalibratie van de opstelling, de voorbereiding van cellen, gegevensverzameling en analyse voor de vaststelling van svFCS-diffusiewet (DL) voor Thy1-GFP, een plasmamembraan glycosylphosphatidylinositol-verankerd eiwit, waarvan bekend is dat het gelokaliseerd is in lipide-vlot nanodomeinen29. Ten slotte laten we zien hoe de gedeeltelijke destabilisatie van lipide-vlot nanodomeinen door cholesteroloxidasebehandeling de diffusie-eigenschappen van Thy1-GFP beïnvloedt. Daarnaast is een gedetailleerde beschrijving van het bouwen van een svFCS-opstelling vanaf nul in aanvullend materiaal.

<table><tbody><tr><td>Aligment tool</td><td>Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings</td><td>Thorlabs</td><td>SPW602</td></tr><tr><td>Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM)</td><td>Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-AQRH-15</td></tr><tr><td></td><td>BNC 50 &Omega; plug to 50 &Omega; plug lead 2 m</td><td>RS Components</td><td>742-4315</td></tr><tr><td></td><td>Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 &Omega; With connector, 1.22 m, RoHS2</td><td>RS Components</td><td>885-8172</td></tr><tr><td></td><td>Tee 50&Omega; RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 &rarr; 1GHz</td><td>RS Components</td><td>546-4948</td></tr><tr><td></td><td>Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E &ndash; French Extension Lead, 230 V</td><td>RS Components</td><td>768-5500</td></tr><tr><td></td><td>Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C</td><td>RS Components</td><td>452-8394</td></tr><tr><td></td><td>Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter</td><td>RS Components</td><td>792-4079</td></tr><tr><td>Fluorescence filtering</td><td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&deg; Chroma Diameter 25 mm</td><td>AHF filter</td><td>F47-539</td></tr><tr><td></td><td>Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45&deg; Chroma 25.5 x 36 x 1 mm</td><td>AHF filter</td><td>F43-088</td></tr><tr><td></td><td>496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0&deg; Chroma Diameter 25</td><td>AHF filter</td><td>F37-496</td></tr><tr><td>Hardware correlator</td><td>80 MHz Digital Correlator</td><td>Correlator.com</td><td>Flex02-12D</td></tr><tr><td>Laser</td><td>LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW</td><td>Lasos</td><td>BLD-XT 488100</td></tr><tr><td>Laser safety</td><td>High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll</td><td>Thorlabs</td><td>T743-2.0</td></tr><tr><td></td><td>Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td></tr><tr><td></td><td>Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission</td><td>Thorlabs</td><td>LG3B</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR</td><td>Carl Zeiss</td><td>421767-9971-711</td></tr><tr><td></td><td>Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-345</td></tr><tr><td></td><td>Middle ring W0.8 - W0.8 H "5"</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-347</td></tr><tr><td>Optical path</td><td>D25.4mm Mirror, Protected Silver</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-A</td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-A</td></tr><tr><td></td><td>25 &micro;m mounted pinhole</td><td>Thorlabs</td><td>P25S I</td></tr><tr><td></td><td>25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-488 (HWP)</td></tr><tr><td></td><td>20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td></tr><tr><td></td><td>Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1/M</td></tr><tr><td></td><td>52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100B/M</td></tr><tr><td></td><td>Adjustable Prism Clamp</td><td>Thorlabs</td><td>PM3/M</td></tr><tr><td></td><td>Beam block - active area 19 mm x 38 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1/M</td></tr><tr><td></td><td>Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture</td><td>Thorlabs</td><td>ID25/M</td></tr><tr><td></td><td>Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td></tr><tr><td></td><td>1" Optic Holder, M4 Tap</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td></tr><tr><td></td><td>1" Stackable Lens Tube</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L03</td></tr><tr><td></td><td>Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth &frac12;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td></tr><tr><td></td><td>Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td></tr><tr><td></td><td>Small Optical Rails 600mm, metric</td><td>Thorlabs</td><td>RLA600/M</td></tr><tr><td></td><td>Small Optical Rails 75mm, metric</td><td>Thorlabs</td><td>RLA075/M</td></tr><tr><td></td><td>Small Optical Rails 150mm, metric</td><td>Thorlabs</td><td>RLA150/M</td></tr><tr><td></td><td>Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1"</td><td>Thorlabs</td><td>RC1</td></tr><tr><td></td><td>Rail Carrier, Perpendicular Dovetail</td><td>Thorlabs</td><td>RC3</td></tr><tr><td></td><td>High Precision Translating Lens Mount for 1 inch</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY/M</td></tr><tr><td></td><td>&frac12; " (12mm) Dovetail Translation Stage</td><td>Thorlabs</td><td>DT12/M</td></tr><tr><td></td><td>Rail Clamps</td><td>Thorlabs</td><td>CL6</td></tr><tr><td></td><td>Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102)</td><td>Thorlabs</td><td>PT3/M</td></tr><tr><td></td><td>Black Rubberized Fabric</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td></tr><tr><td></td><td>Ball Driver kit/ 6 tools</td><td>Thorlabs</td><td>BD-KIT/M</td></tr><tr><td></td><td>Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads</td><td>Thorlabs</td><td>AP6M4M</td></tr><tr><td></td><td>Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Lens Mount for 25.4mm optic</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1/M</td></tr><tr><td></td><td>SM1 FC/APC Adapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FCA</td></tr><tr><td></td><td>Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td></tr><tr><td></td><td>Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW</td><td>Thorlabs</td><td>S120C</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=50 mm, 5 Pack</td><td>Thorlabs</td><td>PH

spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamische biologische processen in levende cellen, inclusief die geassocieerd met plasmamembraanorganisatie, vinden plaats op verschillende ruimtelijke en temporele schalen, variërend van respectievelijk nanometers tot micrometers en microseconden tot minuten. Zo'n breed scala aan biologische processen daagt conventionele microscopiebenaderingen uit. Hier beschrijven we de procedure voor het implementeren van spotvariatie Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (svFCS) metingen met behulp van een klassieke fluorescentiemicroscoop die is aangepast. Het protocol omvat een specifieke prestatiecontrole van de svFCS-opstelling en de richtlijnen voor moleculaire diffusiemetingen door svFCS op het plasmamembraan van levende cellen onder fysiologische omstandigheden. Daarnaast bieden we een procedure voor het verstoren van plasmamembraanvlot nanodomeinen door cholesteroloxidasebehandeling en laten we zien hoe deze veranderingen in de laterale organisatie van het plasmamembraan kunnen worden onthuld door svFCS-analyse. Kortom, deze op fluorescentie gebaseerde methode kan ongekende details geven over de laterale organisatie van het plasmamembraan met de juiste ruimtelijke en temporele resolutie.

We genereerden een DL voor Thy1-GFP uitgedrukt in Cos-7 cellen (Figuur 4, zwarte vierkanten). De diffusiewet heeft een positieve t0-waarde (19,47 ms ± 2 ms), wat aangeeft dat Thy1-GFP is opgesloten in nanodomeinstructuren van het plasmamembraan. De cholesteroloxidasebehandeling van de cellen die Thy1-GFP tot expressie brengen, resulteerde in de verschuiving van de DL t0-waarde naar 7,36 ± 1,34 ms (figuur 4, grijze vierkanten). Deze observatie bevestigt dat de aard van Thy1-GFP-opsluiting afhankelijk is van het cholesterolgehalte en geassocieerd is met lipidevlot nanodomeinen. Deze twee diffusiewetten blijken volgens de hierboven beschreven statistische test (zie stap 9.1.3) verschillend te zijn in termen van t0- en D-eff-waarden. Daarnaast beoordeelden we de concentratie van totaal cellulair cholesterol in niet-behandelde Cos-7-cellen versus de cellen behandeld met COase. Een kleine, maar significante daling van het totale cholesterolgehalte wordt waargenomen bij behandeling met COase (figuur 5). Omdat dit enzym alleen inwerkt op de cholesterolpool die toegankelijk is in de buitenste folder van het plasmamembraan, gaan we ervan uit dat de waargenomen daling van cholesterol alleen geassocieerd is met het plasmamembraan en resulteert in de destabilisatie van lipidevlot nanodomeinen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> Figuur 1: Gesimuleerde fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) diffusiewetten vastgesteld door spot-variatie FCS voor verschillende vormen van membraanorganisatie. (Bovenste panelen) Schematische weergave van membraanorganisatie - (A) vrije diffusie, (B) meshwork-barrières en (C) val / domeinopsluitingen - met het traject getekend voor een enkel molecuul (rood). Blauwe cirkels geven de kruising van het membraan en de laserstraal van taille ω aan. (Onderste panelen) FCS-diffusiewetten weergegeven door de diffusietijd td uit te zetten als een functie van de kwadraatstraal ω2. Diffusiewetprojectie (groene stippellijn) onderschept de tijdas op (A) de oorsprong (t0 = 0) in het geval van vrije diffusie; B) in de negatieve as (t0 < 0) wanneer er mazenbarrières zijn, of (C) in de positieve as (t0 > 0) wanneer er vallen en domeinen zijn (lipidevlotten). D is de laterale diffusiecoëfficiënt voor Brownse beweging; Deff, de effectieve diffusiecoëfficiënt; Dmicro, de microscopische diffusiecoëfficiënt in de maaswerkvallen; Din, de diffusiecoëfficiënt binnen domeinen; Duit, de diffusiecoëfficiënt buiten domeinen; L, de grootte van de zijde van een vierkant domein; en rD, de straal van een cirkelvormig domein. Deze figuur is aangepast van He en Marguet6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> Figuur 2: Schematische weergave van svFCS-hardwarebesturing. De computer bestuurt alle apparaten via verschillende communicatieprotocollen: serieel (microscoop, externe sluiter), USB (XYZ piëzo-elektrische fase, correlator) en PCI (acquisitiebord). DAQ: data-acquisitiebord, APD: lawinefotodiode, SPCM: enkele fotonentelmodule, DO: digitale uitvoer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> Figuur 3: Schematische weergave van excitatie- en emissie-optische paden van de svFCS-opstelling. De svFCS-opstelling bevat vier modules: (1) de output van een vezelige 488 nm-laser wordt gecollimeerd, (2) een combinatie van een halve golfplaat en polariserende bundelsplitser stelt het optische vermogen in, (3) de laserstraal gericht op het monster na het reizen door een buislensvrije gemotoriseerde microscoop, en (4) de fluorescentie wordt gedetecteerd via een confocal-achtig detectiepad op een lawinefotodiode gekoppeld aan een enkele fotonentelmodule, die een signaal levert aan een hardwarecorrelator. Eenvoud geeft het systeem zijn gevoeligheid, robuustheid en gebruiksgemak (veel becommentarieerd in aanvullend materiaal). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> Figuur 4: De svFCS-diffusiewetten gegenereerd uit diffusieanalyse van Thy1-GFP uitgedrukt in Cos-7. svFCS diffusiewetten van Cos-7 cellen zonder behandeling (NT, zwarte vierkanten) en na behandeling met cholesteroloxidase (COase, grijze cirkels). De insert in de grafiek vertegenwoordigt statistische testen van een significant verschil tussen de twee gepresenteerde svFCS-diffusiewetten (volgens Mailfert et al.28). De testwaarde (T) moet hoger zijn dan de drempel van 3,8 wanneer beide diffusiewetten verschillend zijn. Hoe hoger het is, hoe groter het verschil tussen de diffusiewetten. De waarde van T is kleurgecodeerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> Figuur 5: Vergelijking van het totale cholesterolgehalte in Cos-7-cellen. Cos-7-cellen werden ofwel niet-behandeld (NT) of behandeld met 1 U /ml cholesteroloxidase (COase) gedurende 1 uur. De gegevens zijn een voorbeeld van één experiment in drievoud. Een tweezijdige, ongepaarde t-test werd gebruikt om het statistische verschil te beoordelen (α = 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel met materialen: De lijst met optische elementen die nodig zijn voor de svFCS-installatie.
Aanvullend materiaal: Dit document beschrijft het bouwen van een svFCS-opstelling vanaf nul. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit artikel is bedoeld om een protocol te presenteren over het bouwen van een spotvariatie Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (svFCS) microscoop om moleculaire diffusie te meten op het plasmamembraan van levende cellen.

Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

De huidige kijk op de laterale organisatie van het plasmamembraan is nog onvolledig. Om deze reden is het belangrijk om enkele nieuwe innovatieve technieken te implementeren, zoals spot variatie Fluorescerende Correlatie Spectroscopie. Dit is een zeer krachtige techniek gekenmerkt door uitstekende tijd- en ruimtelijkheidsresolutie.Bovendien is het niet-invasief en maakt het mogelijk om celmembranen onder fysiologische omstandigheden te bestuderen. Elke dag voor het uitvoeren van een experiment, open alle irisdiafragma's en gebruik een vermogensmeter om het laservermogen te meten met de eerste iris volledig open. Draai de halve plaat om de maximale kracht te lokaliseren.Als het laservermogen lager is dan normaal, gebruik de irissen om de uitlijning te controleren en beweeg afwisselend L1 en M1 indien nodig. Noteer vervolgens de vermogenswaarde in een laboratoriumnotitieboek. Om de detectiepad te controleren, plaats water, een dekglas en een druppel van twee nanomolare rodamine 6G-oplossing op het objectief.Start vervolgens de correlator software en neem de gegevens op. De autocorrelatiefunctie zou een lage hoeveelheid ruis moeten weergeven, een kleine afvalgrootte en een hoge tellingsnelheid per molecuul per seconde. Om de spotgrootte te kalibreren, plaats een celcultuur gecodeerde dekglas op het wateronderdompeling objectief en voeg 200 microliters van twee nanomolare rodamine 6G-oplossing toe aan het dekglas.Pas de 488 nanometer laserstraalkracht aan op 300 microwatt en selecteer in de software de svFCS verlichting detectie microscooppoort. Schakel de APD in en open de iris totdat een signaal daalt om de minimale afvalgrootte te verkrijgen of sluit deze voor een grotere afvalgrootte. Neem ongeveer 10, 20-seconde autocorrelatiefuncties op om de statistische reproduceerbaarheid te verbeteren en schakel de APD uit.In een geschikt data-analyseprogramma, controleer en gooi de runs weg met sterke fluctuaties vanwege moleculaire aggregaten, past vervolgens de gemiddelde van de behouden autocorrelatiefunctie met een 3d diffusiemodel aan, haal het gemiddelde diffusietijd uit de aanpassingsparameters en sla de gegevens op als een TXT-bestand. Voor svFCS-analyse, pas de 488 nanometer straalkracht aan tussen twee tot vier microwatt en breng de monsters in evenwicht gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Selecteer de svFCS verlichting detectie microscooppoort en op de APD.Voer vervolgens een XY-scan en een Z-scan van de geselecteerde cel uit. Selecteer het plasmamembraan aan de bovenkant van de cel om de confocale spot bij de maximale fluorescentie-intensiteit te lokaliseren en start de gegevensverwerving. In de correlator software, neem een serie van 20, vijf seconde runs op.Na de laatste run, schakel de APD uit en gooi alle onverwachte runs weg zoals gedemonstreerd. Past de gemiddelde autocorrelatiefunctie aan met een twee soorten 2d diffusiemodel en sla de aanpassingsparameters op in het eerder opgeslagen TXT-bestand. Wanneer alle cellen van belang zijn opgenomen, analyseer ten minste vier afvalgroottes variërend tussen 200 tot 400 nanometers om een enkele diffusiewet vast te stellen.Vervolgens selecteert u in MATLAB een map met alle TXT-bestanden die overeenkomen met ten minste vier afvalgrootte-experimenten en plot de diffusietijd versus het vierkante afval. In deze figuur kan een diffusiewet voor Thy1-GFP geëxpresseerd in Cos7-cellen worden waargenomen. De diffusiewet heeft een positieve tijd nul waarde, wat aangeeft dat de Thy1-GFP beperkt is tot nano domeinstructuren van het plasmamembraan.In deze analyse resulteerde de cholesteroloxidase behandeling van de cellen die Thy1-GFP tot expressie brengen in de verschuiving van de diffusiewet tijd nul waarde naar 7,36 plus of min 1,34 milliseconden. Dit bevestigt dat de aard van de Thy1-GFP beperking afhangt van het cholesterolgehalte en geassocieerd is met lipide raft nano domeinen. Er werd ook een kleine maar significante afname in het totale cholesterolgehalte waargenomen na behandeling met cholesteroloxidase.Aangezien dit enzym alleen werkt op het cholesterolpool dat toegankelijk is aan de buitenste laag van het plasmamembraan, suggereren deze gegevens dat de waargenomen afname in cholesterol alleen geassocieerd is met het plasmamembraan en destabilisatie van de lipide raft nano domeinen veroorzaakt. Het belangrijkste bij het uitvoeren van deze procedure is de juiste kalibratie van het svFCS-systeem en de voorbereiding van cellen voor de analyse. svFCS is een uitstekend hulpmiddel om celmembraanorganisatie te bestuderen.Het kan echter ook worden gebruikt om de diffusie van intracellulaire moleculen te analyseren. Deze techniek kan met succes worden geïmplementeerd in de biomedische wetenschappen om de invloed van potentiële geneesmiddelen op levende cellen, zoals kankercellen, te bepalen.

spot-variation-fluorescence-correlation-spectroscopy-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een techniek om de lipid raft verdeling van fluorescerende eiwitten in de plasmamembraan van levende cellen sonde wordt beschreven. Het maakt gebruik van de verschillen in verspreiding tijden van eiwitten die gelegen zijn binnen of buiten van lipide rafts. Overname kan dynamisch worden uitgevoerd in controle omstandigheden of na drugsverslaving.

Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS)

This video demonstrates the use of fluorescence fluctuation spectroscopy to detect the interaction among cell surface proteins at cell-cell contacts. By expressing the transmembrane adhesion receptor of interest labeled with a fluorescent protein and mixing two different cell populations harboring two spectrally separated fluorescent labels, the trans-interaction between the receptors of two neighboring cells with different-colored fluorescence is assessed via cross-correlation in the...

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Interaction at Cell Contacts

Dit artikel geeft een stap voor stap handleiding om de fluctuatie analysetechniek k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG's) voor het meten van diffusiecoëfficiënten van fluorescent gelabelde plasmamembraan eiwitten in levende cellen van zoogdieren.

Gemakkelijk Meting van diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van K-Space Beeld Correlatie Spectroscopie

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Een methode om eiwitdiffusie in membranen van primaire immuuncellen te meten met behulp van fluorescentie correlatiespectroscopie (FCS) wordt beschreven. In dit artikel wordt het gebruik van antilichamen voor fluorescentielabeling geïllustreerd.

Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Dit artikel beschrijft een methode voor het beoordelen van de interacties en assemblages van integrale membraaneiwitten in vitro met verschillende partnerfactoren in een lipid-proximaal milieu.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Hier wordt een protocol voor hoogwaardige FRET-experimenten op het molecuulniveau voorgesteld. Daarnaast kan deze methodologie worden gebruikt om drie conformatieve staten in het ligand-bindende domein van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren. Het bepalen van precieze afstande is de eerste stap in de richting van het opbouwen van structurele modellen op basis van FRET-experimenten.

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

Geautomatiseerde systemen en protocollen voor de routinematige bereiding van een groot aantal schermen en nanoliter kristallisatie druppels voor damp diffusie experimenten zijn beschreven en besproken.

Geautomatiseerd protocollen voor macromoleculaire kristallisatie bij het MRC Laboratory of Molecular Biology

Hier presenteren we een experimenteel protocol dat kan worden gebruikt om te bepalen van het bindende affiniteiten en de wijze van interactie van label-vrije fosfolipide-bindend-proteïne Annexine A2 met geïmmobiliseerdet solid-ondersteunde bilayers (SLB) door het meten van gelijktijdig de massale verbreiding en de visco-eigenschappen van het eiwit Annexine A2.

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

Leer spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen. Deze niet-invasieve methode biedt uitstekende temporele en ruimtelijke resolutie.

Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen (Video) | JoVE Journal

Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen

Meer video's verkennen