Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen
12 november 2020
Dit artikel is bedoeld om een protocol te presenteren over het bouwen van een spotvariatie Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (svFCS) microscoop om moleculaire diffusie te meten op het plasmamembraan van levende cellen.
De huidige kijk op de laterale organisatie van het plasmamembraan is nog onvolledig. Om deze reden is het belangrijk om enkele nieuwe innovatieve technieken te implementeren, zoals spot variatie Fluorescerende Correlatie Spectroscopie. Dit is een zeer krachtige techniek gekenmerkt door uitstekende tijd- en ruimtelijkheidsresolutie.
Bovendien is het niet-invasief en maakt het mogelijk om celmembranen onder fysiologische omstandigheden te bestuderen. Elke dag voor het uitvoeren van een experiment, open alle irisdiafragma's en gebruik een vermogensmeter om het laservermogen te meten met de eerste iris volledig open. Draai de halve plaat om de maximale kracht te lokaliseren.
Als het laservermogen lager is dan normaal, gebruik de irissen om de uitlijning te controleren en beweeg afwisselend L1 en M1 indien nodig. Noteer vervolgens de vermogenswaarde in een laboratoriumnotitieboek. Om de detectiepad te controleren, plaats water, een dekglas en een druppel van twee nanomolare rodamine 6G-oplossing op het objectief.
Start vervolgens de correlator software en neem de gegevens op. De autocorrelatiefunctie zou een lage hoeveelheid ruis moeten weergeven, een kleine afvalgrootte en een hoge tellingsnelheid per molecuul per seconde. Om de spotgrootte te kalibreren, plaats een celcultuur gecodeerde dekglas op het wateronderdompeling objectief en voeg 200 microliters van twee nanomolare rodamine 6G-oplossing toe aan het dekglas.
Pas de 488 nanometer laserstraalkracht aan op 300 microwatt en selecteer in de software de svFCS verlichting detectie microscooppoort. Schakel de APD in en open de iris totdat een signaal daalt om de minimale afvalgrootte te verkrijgen of sluit deze voor een grotere afvalgrootte. Neem ongeveer 10, 20-seconde autocorrelatiefuncties op om de statistische reproduceerbaarheid te verbeteren en schakel de APD uit.
In een geschikt data-analyseprogramma, controleer en gooi de runs weg met sterke fluctuaties vanwege moleculaire aggregaten, past vervolgens de gemiddelde van de behouden autocorrelatiefunctie met een 3d diffusiemodel aan, haal het gemiddelde diffusietijd uit de aanpassingsparameters en sla de gegevens op als een TXT-bestand. Voor svFCS-analyse, pas de 488 nanometer straalkracht aan tussen twee tot vier microwatt en breng de monsters in evenwicht gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Selecteer de svFCS verlichting detectie microscooppoort en op de APD.
Voer vervolgens een XY-scan en een Z-scan van de geselecteerde cel uit. Selecteer het plasmamembraan aan de bovenkant van de cel om de confocale spot bij de maximale fluorescentie-intensiteit te lokaliseren en start de gegevensverwerving. In de correlator software, neem een serie van 20, vijf seconde runs op.
Na de laatste run, schakel de APD uit en gooi alle onverwachte runs weg zoals gedemonstreerd. Past de gemiddelde autocorrelatiefunctie aan met een twee soorten 2d diffusiemodel en sla de aanpassingsparameters op in het eerder opgeslagen TXT-bestand. Wanneer alle cellen van belang zijn opgenomen, analyseer ten minste vier afvalgroottes variërend tussen 200 tot 400 nanometers om een enkele diffusiewet vast te stellen.
Vervolgens selecteert u in MATLAB een map met alle TXT-bestanden die overeenkomen met ten minste vier afvalgrootte-experimenten en plot de diffusietijd versus het vierkante afval. In deze figuur kan een diffusiewet voor Thy1-GFP geëxpresseerd in Cos7-cellen worden waargenomen. De diffusiewet heeft een positieve tijd nul waarde, wat aangeeft dat de Thy1-GFP beperkt is tot nano domeinstructuren van het plasmamembraan.
In deze analyse resulteerde de cholesteroloxidase behandeling van de cellen die Thy1-GFP tot expressie brengen in de verschuiving van de diffusiewet tijd nul waarde naar 7,36 plus of min 1,34 milliseconden. Dit bevestigt dat de aard van de Thy1-GFP beperking afhangt van het cholesterolgehalte en geassocieerd is met lipide raft nano domeinen. Er werd ook een kleine maar significante afname in het totale cholesterolgehalte waargenomen na behandeling met cholesteroloxidase.
Aangezien dit enzym alleen werkt op het cholesterolpool dat toegankelijk is aan de buitenste laag van het plasmamembraan, suggereren deze gegevens dat de waargenomen afname in cholesterol alleen geassocieerd is met het plasmamembraan en destabilisatie van de lipide raft nano domeinen veroorzaakt. Het belangrijkste bij het uitvoeren van deze procedure is de juiste kalibratie van het svFCS-systeem en de voorbereiding van cellen voor de analyse. svFCS is een uitstekend hulpmiddel om celmembraanorganisatie te bestuderen.
Het kan echter ook worden gebruikt om de diffusie van intracellulaire moleculen te analyseren. Deze techniek kan met succes worden geïmplementeerd in de biomedische wetenschappen om de invloed van potentiële geneesmiddelen op levende cellen, zoals kankercellen, te bepalen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bouwen van een spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscoop om moleculaire diffusie bij het plasmamembraan van levende cellen te meten. De techniek biedt een uitstekende temporele en ruimtelijke resolutie en is bovendien niet-invasief.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- De laterale organisatie van het plasmamembraan is nog niet volledig begrepen.
- Innovatieve technieken zoals svFCS zijn nodig voor betere inzichten.
- svFCS maakt het mogelijk om celmembranen onder fysiologische omstandigheden te bestuderen.
- Een juiste kalibratie en celvoorbereiding zijn cruciaal voor nauwkeurige resultaten.
Doel van de studie
- Om een protocol voor svFCS-microscopie te ontwikkelen.
- Om moleculaire diffusie aan het plasmamembraan te meten.
- Om de invloed van cholesterol op de membraanorganisatie te analyseren.
Gebruikte methoden
- Kalibratie van het svFCS-systeem met behulp van een rhodamine 6G-oplossing.
- Data-acquisitie via XY- en Z-scans van geselecteerde cellen.
- Analyse van diffusiewetten met behulp van MATLAB.
- Vergelijking van diffusieparameters vóór en na behandeling met cholesterolexidase.
Belangrijkste resultaten
- Thy1-GFP-diffusie is beperkt tot nanodomeinstructuren.
- Behandeling met cholesteroloxidase verschuift de waarde bij tijd nul van de diffusiewet.
- Er werd een afname van het totale cholesterolgehalte waargenomen.
- De studie suggereert dat cholesterol de stabiliteit van lipid rafts beïnvloedt.
Conclusies
- svFCS is effectief voor het bestuderen van de organisatie van het celmembraan.
- De techniek kan ook de diffusie van intracellulaire moleculen analyseren.
- De bevindingen hebben implicaties voor het begrijpen van drugseffecten op levende cellen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) maakt een hoge-resolutie analyse mogelijk van moleculaire diffusie bij het plasmamembraan onder fysiologische omstandigheden, wat cruciale inzichten biedt in de membraanorganisatie en de dynamiek van lipid rafts. Deze mogelijkheid ondersteunt targetvalidatie door de biofysische context van membraangeassocieerde eiwitten te verduidelijken, wat bijdraagt aan mechanistische de-risking in vroege discoveryfasen. De niet-invasieve aard van de methode en de compatibiliteit met levende cellen vergroten de bruikbaarheid bij preklinische screening en translationele biomarkerstudies.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door het diffusiegedrag van membraaneiwitten zoals Thy1-GFP binnen nanodomeinstructuren te kwantificeren.
- Operationele waarde: Onthult cholesterolafhankelijke opsluiting, wat functionele validatie van associaties met lipid rafts mogelijk maakt.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het identificeren van targets waarvan de membraanlokalisatie gevoelig is voor verstoringen van de lipidenomgeving.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op compound-screening door basisdiffusiewetten onder fysiologische omstandigheden vast te stellen.
- Kwantitatieve output: Genereert reproduceerbare metingen van de diffusietijd bij variërende beam waist-groottes, ter ondersteuning van de standaardisatie van de assay.
- Relevantie voor screening: Detecteert compound-geïnduceerde verschuivingen in diffusieparameters, wat duidt op veranderingen in de membraanorganisatie of target-engagement.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert de verstoring van nanodomeinen van plasmamembraanvlotten, relevant voor pathologieën waarbij lipidedysregulatie betrokken is.
- Translationele continuïteit: Verbindt observaties uit vroege ontdekkingsfasen met preklinische validatie door aan te tonen hoe omgevingsverstoringen (bijv. cholesterolmodulatie) het gedrag van het doelwit veranderen.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Biedt mechanistische uitslagen die go/no-go-criteria informeren op basis van de veerkracht van het doelwit tegen membraanverstoringen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
svFCS past binnen het continuüm van ontdekking, van het testen van doelhypothesen via lead-identificatie tot preklinische validatie, en biedt een biofysische karakteriseringslaag die biochemische en fenotypische assays aanvult.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van hypothesen door diffusiecoëfficiënten te meten en het onderscheiden van beperkte versus mobiele moleculaire populaties.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde kalibratie met rhodamine 6G en validatie van de integriteit van het detectiepad.
- Analytica: Levert kwantitatieve diffusiewetten via MATLAB-analyse van autocorrelatiefuncties, waardoor vergelijking van moleculair gedrag onder verschillende condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Koppelt veranderingen in membraanorganisatie aan functionele resultaten, wat de afstemming van biomarkers ondersteunt wanneer diffusieverschuivingen correleren met fenotypische responsen.
- Bedrijfmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van membraaneiwitdynamiek over meerdere targets en cellijnen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door nanoscale opsluiting en diffusieheterogeniteit bij het plasmamembraan op te lossen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde laservermogenskalibratie, controles van het detectiepad en middeling van gerepliceerde autocorrelatiefuncties.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door de stabiliteit van targets in native-achtige membraanomgevingen te kwantificeren, waardoor uitval in een laat stadium door onvoorziene biofysische tekortkomingen wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van targets mogelijk op basis van hun afhankelijkheid van de integriteit van lipid rafts voor een correcte lokalisatie en functie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie, lasersafety en data-analyse van correlatiespectroscopie.
- Vereist een aangepaste fluorescentiemicroscoop met APD, correlatorsoftware en nauwkeurige controle van het laservermogen (2–4 µW voor svFCS-metingen).
- Vraagt om cross-team standaardisatie van kalibratieprotocollen (bijv. validatie van de spotgrootte van rhodamine 6G) en data-analysepijplijnen (bijv. MATLAB-fitting van 2D-diffusiemodellen).
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende membraaneiwitten, celtypen en perturbatie-agentia naast cholesteroloxidase.
- Beperkt door de noodzaak van zorgvuldige monstervoorbereiding om moleculaire aggregaten te vermijden en fysiologische relevantie te garanderen tijdens equilibratie bij 37°C.
