Een multi-cue bioreactor om de inflammatoire en regeneratieve capaciteit van biomaterialen onder flow en stretch te evalueren
10 december 2020
Het doel van dit protocol is om een dynamische co-cultuur van menselijke macrofagen en myofibroblasten in buisvormige elektrospunsteigers uit te voeren om materiaalgestuurde weefselregeneratie te onderzoeken, met behulp van een bioreactor die het ontkoppelen van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt.
Tot nu toe is het erg moeilijk geweest om de oorzaak-gevolg relaties tussen hemodynamiek en vaatweefselregeneratie te identificeren. En dit komt omdat het een uitdaging is om de individuele mechanische belastingen te beheersen. Deze bioreactor stelt ons in staat om mechanisch de individuele en gecombineerde effecten van zuivere spanning en cyclische stretch op het regeneratieve potentieel van een brede verscheidenheid aan weefselgeengineerde vasculaire grafts te onderzoeken.
Suzanne Koch, een promovenda in onze groep, zal deze procedure demonstreren. En Dr. Tamar Wissing, een postdoctoraal onderzoeker uit ons laboratorium. Om de elektrogesponnen scaffold op de siliconen buis te monteren, draait u een 4-0 prolene naald door één uiteinde van een stuk siliconenbuis en door het andere uiteinde.
Maak aan beide kanten van de buis een kleine knoop waardoor er ongeveer 10 centimeter draad overblijft en maak een derde knoop bovenop de twee. Nadat u een naald voor het naaien hebt verwijderd, snijdt u de randen van de siliconenbuis in een driehoekige vorm en maakt u een laatste knoop aan het einde van de twee 10 centimeter lange draden. Dompel de elektrogesponnen scaffold in 30%ethanol en plaats de scaffold over een uiteinde van de vrije naaddraad.
Strek vervolgens zachtjes beide zijden van de siliconenbuis en de 10 centimeter naadknoop terwijl de tweede onderzoeker een pincet met een gladde binnenkant gebruikt om de elektrogesponnen scaffold voorzichtig over de buis te schuiven. Laat de rek op de siliconenbuis langzaam los terwijl u tegelijkertijd de elektrogesponnen scaffold met het pincet glad maakt. En dompel de scaffold en siliconenbuis twee keer in ultra zuiver water.
Bouw het onderste compartiment en zorg ervoor dat de O-ring goed geplaatst is. Plaats een adapterbus in het bovenste gedeelte van het onderste compartiment en plaats de drukgeleider met gaten door het onderste compartiment. Lace de siliconen O-ring rond het onderste uiteinde van de drukgeleider om lekkage te voorkomen.
En schroef het onderste deel van het onderste compartiment op het bovenste deel van het onderste compartiment om de drukgeleider te bevestigen. Zorg ervoor dat de onderste gegraveerde groef van de drukgeleider ongeveer drie tot vijf millimeter boven de rand van de adapterbus van het onderste compartiment is. Trek de siliconenbuis met de elektrogesponnen scaffold over de drukgeleider en maak een knoop en de naaddraad aan het onderste uiteinde van de elektrogesponnen scaffold, op de locatie van de gegraveerde groef op de drukgeleider.
Maak een tweede knoop aan de andere kant om de siliconenbuis met de elektrogesponnen graft stevig vast te zetten. En plaats een schaarklemmen voorzien van een liniaal aan het bovenste uiteinde van de siliconenbuis, trek de schaarklemmen op een consistente manier omhoog en trek zachtjes aan de elektrische spawn scaffold om eventuele kreuken te verwijderen. Gebruik een naaddraad om twee knopen te maken aan beide uiteinden van de scaffold bij de bovenste gegraveerde groef van de drukgeleider.
Wanneer beide knopen zijn gemaakt, laat u de schaarklemmen los en gebruikt u een mes om eventueel overtollig siliconenbuis te verwijderen. Schroef de neuskegels op de schroefdraad van de drukgeleiders voor de monsters die dynamisch worden geladen. Dompel de drukgeleider, buis en scaffold één keer in 30%ethanol en twee keer in ultrapuur water om de setup vooraf te bevochtigen.
Plaats de glazen buis over de drukgeleider en druk zachtjes op het onderste compartiment om de glazen buis op zijn plaats te bevestigen. Plaats vervolgens de stroomversterker, een siliconen O-ring en adapterbus in het bovenste compartiment. En bevestig het compartiment over de open uiteinden van de glazen buis.
Verwijder de mannelijke lure-plug van de stroomuitlaat, werk in een steriele laminaire stroomkast. Open de witte lure-kap en plaats een ethanol gedrenkt weefsel voor de stroomuitlaat. Deconstructeer de stroomcultuurkamer door de glazen buis met het bovenste compartiment te verwijderen.
Plaats een vacuüm weidebuis op de elektrogesponnen scaffold om zoveel mogelijk medium te verwijderen. En voeg fibrinogeenoplossing toe in een een-op-een verhouding met de trombine aangevulde celsuspensie. Pipetteer de oplossing omhoog en omlaag een keer en druppel de oplossing onmiddellijk over de volledige lengte van de scaffold.
Wanneer alle cellen zijn aangeboden, verplaats de scaffold langzaam van links naar rechts en van boven naar beneden om een gelijkmatige verdeling van de cellen te bereiken. Wanneer beide zijden van de scaffold zijn gezaaid, reconstrueert u voorzichtig de stroomcultuurkamer door de glazen buis en het bovenste compartiment terug te plaatsen. En plaats de stroomcultuurkamer in de incubator om de vezel te laten stollen.
Om de bioreactor aan het pompsysteem te koppelen, plaatst u de stroomcultuurkamer op een van de acht schroefdraden op de bioreactorbasis. En plaats een hostclip op de mediumbuis. Verwijder de witte lure-kap die de stroominlaat van het bovenste compartiment van de stroomcultuurkamer bedekt en verwijder de vrouwelijke lure-koppeling van de mediumbuis.
Verbind de mediumbuis met één zijde van de stroominlaat op het bovenste compartiment. En de andere zijde met de stroomuitlaat op het onderste compartiment. Breng de complete setup van de laminaire stroomkast naar de incubator.
En verbind de vloeistofunits en de bioreactorbasis aan de luchtdrukbuis en elektrische kabel. Start de software en initialiseer de pompen. Start de mediumstroom voor de monsters een voor een.
Vervolgens wijzigt u de parameters van de spanpomp naar de gewenste instellingen en start u de spanning. Bewaak de rek die op de scaffold wordt toegepast om de andere dag. De bewaking van rek en wandschuifspanning over langere cultuurperioden laat zien dat deze waarden gedurende een periode van maximaal 20 dagen op relatief constante niveaus kunnen worden gehandhaafd.
Na drie dagen van hemodynamische belasting onthult immunofluorescente kleuring een homogene verdeling van monocyt-afgeleide macrofagen en myofibroblasten door de gehele scaffold. Na 20 dagen co-cultuur resulteert cyclische stretch in de afzetting van meer talrijke en dikkere collageentype 1 vezels. Terwijl in de gecombineerde hemod
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert een dynamische co-cultuur van menselijke macrofagen en myofibroblasten binnen tubulaire electrospun scaffolds. De studie heeft tot doel materiaalgestuurde weefselregeneratie te onderzoeken met behulp van een bioreactor die de ontkoppeling van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Weefseltechnologie
- Regeneratieve Geneeskunde
- Biomechanica
Achtergrond
- Het identificeren van oorzaak-gevolgrelaties tussen hemodynamiek en regeneratie van vasculair weefsel is uitdagend.
- Het beheersen van individuele mechanische belastingen is cruciaal voor het begrijpen van weefselregeneratie.
- Deze bioreactor faciliteert mechanistische onderzoeken naar schuifspanning en cyclische rek.
- De studie richt zich op via tissue-engineering vervaardigde vasculaire grafts.
Doel van de studie
- Om de effecten van mechanische belastingen op weefselregeneratie te onderzoeken.
- Om een bioreactor te gebruiken voor gecontroleerde experimenten.
- Om het begrip van materiaalgestuurde weefselregeneratie te bevorderen.
Gebruikte methoden
- Dynamische co-cultuur van humane macrofagen en myofibroblasten.
- Gebruik van tubulaire electrospun scaffolds.
- Toepassing van een bioreactor om mechanische krachten te ontkoppelen.
- Experimentele opstelling met siliconen buisjes en hechtingen.
Belangrijkste resultaten
- Inzichten in het regeneratieve potentieel van vasculaire grafts.
- Demonstratie van de mogelijkheden van de bioreactor.
- Begrip van de gecombineerde effecten van schuifspanning en cyclische rek.
- Vaststelling van een protocol voor toekomstige studies.
Conclusies
- De bioreactor is effectief voor het bestuderen van mechanische invloeden op weefselregeneratie.
- Dynamische co-cultuur kan het begrip van interacties tussen macrofagen en myofibroblasten verbeteren.
- Deze aanpak kan leiden tot verbeterde strategieën voor de ontwikkeling van vasculaire grafts.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het begrijpen van de onafhankelijke en gecombineerde effecten van biomechanische signalen op de prestaties van biomaterialen is cruciaal om de risico's bij de ontwikkeling van vasculaire grafts te beperken. Deze bioreactor maakt een mechanistische dissectie mogelijk van de bijdragen van schuifspanning en rek aan inflammatoire en regeneratieve reacties, wat bijdraagt aan het voorspellend vertrouwen bij de selectie van scaffolds. Door de evaluatie te standaardiseren onder gecontroleerde hemodynamische omstandigheden, verbetert deze aanpak de translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe mechanische prikkels macrofaag-gemedieerde inflammatie en myofibroblast-gemedieerde regeneratie aansturen.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd platform om gecontroleerde rek en schuifspanning op tubulaire scaffolds te ontkoppelen en toe te passen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt hypothesetesten over door materiaal geïnduceerde weefselresponsen onder fysiologisch relevante mechanische belastingen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve resultaten over collageendepositie, cytokinesecretie en cellulair fenotype onder gedefinieerde mechanische omstandigheden.
- Operationele waarde: Vergemakkelijkt de gereedheid van assays door reproduceerbare seeding van scaffolds, dynamische belasting en langdurig onderhoud van de cultuur.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt de evaluatie van meerdere scaffold-varianten over acht onafhankelijke bioreactorkanalen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen mechanistische inzichten uit de ontdekkingsfase en de preklinische evaluatie van de prestaties van vasculaire grafts.
- Mechanistische Risicoreductie: Verheldert of rek of schuifspanning de regeneratieve resultaten domineert onder gecombineerde belasting.
- Afstemming van Biomarkers: Verbindt de mechanische omgeving met het myofibroblastfenotype en de expressie van contractiele markers (bijv. α-SMA).
Pipeline- & Workflowintegratie
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door een hypothesegestuurde beoordeling van biomateriaalresponsen mogelijk te maken vóór de identificatie van lead-verbindingen en preklinische tests.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistisch onderzoek naar hoe hemodynamische signalen inflammatoire en regeneratieve paden moduleren in co-culturesystemen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten over matrixdepositie en cellulaire dynamiek onder gecontroleerde mechanische stimuli.
- Analytics: Biedt tijdopgeloste monitoring van de stabiliteit van rek en schuifspanning over cultuurperioden van meerdere weken.
- Translational Research: Verbindt in vitro mechanische conditionering met remodellering van de extracellulaire matrix die relevant is voor de rijping van vasculaire grafts.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar biomechanisch screeningsplatform voor iteratieve optimalisatie van scaffolds.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij het bepalen van hoe individuele biomechanische signalen weefselreacties aansturen.
- Operationele waarde: Waarborgt een lekvrije, reproduceerbare toepassing van dynamische rek en schuifspanning over langere kweekperioden.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door dominante mechanische factoren van regeneratie versus resorptie te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van biomaterialen mogelijk op basis van hun regeneratieve capaciteit onder hemodynamische belasting.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met biomaterialen, cel-cocultuur en biomechanische stimulatie.
- Is afhankelijk van precisie-instrumentatie voor onafhankelijke controle van rek en schuifspanning.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor de preparatie van het scaffold, het zaaien van cellen en de analyse na de cultuur.
- Houdt rekening met adaptatie-overwegingen bij het overdragen van bevindingen naar verschillende tubulaire scaffold-geometrieën of celtypen.
- Is afhankelijk van het handhaven van steriele, lekvrije vloeistofverbindingen gedurende meerweekse experimenten.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Bioreactor Setup
3:43
Cell Seeding
4:48
Coupling Between the Bioreactor and the Pump System
5:50
Results: Representative Evaluation of the Biomaterial Inflammatory and Regenerative Capacity Under Flow and Stretch Conditions
7:27
Conclusion
