Zuivering van tubuline met gecontroleerde posttranslationele modificaties en isotypes uit beperkte bronnen door polymerisatie-depolymerisatiecycli

Deze methode maakt het mogelijk om pure, assembleringscompetente tubuline te genereren met gedefinieerde post-translationele modificaties in hoeveelheden die voldoende zijn om volledige sets in-vitro experimenten uit te voeren. Dit protocol, gebaseerd op cycli van tubulinepolymerisatie en depolymerisatie, is eenvoudig uit te voeren in elk celbiologielab. Het maakt het mogelijk om grote hoeveelheden tubuline te genereren met zeer weinig praktische tijd.

Om tubuline uit suspensieculturen te zuiveren, leven negen dagen voor de tubulinevoorbereiding het gewenste celtype nieuw leven in en versterk het om zes confluente 15 centimeter schaaltjes te verkrijgen. Acht dagen voor de tubulinevoorbereiding, voeg een liter voorverwarmd medium toe aan elke spinnerfles per schaaltje onder een celkweekkast en plaats de spinners op een roertafel binnen de celkweekincubator. Laat de zijdelingse spinnerdoppen lichtjes open om het medium te laten gelijkmaken met de atmosfeer van de incubator.

De volgende dag, gebruik de cellen van de confluente schotels om de spinnerflessen te inoculeren. Breng de spinnerflessen terug naar de incubator gedurende één week met de zijdelingse kleppen lichtjes open. Om de cellen te oogsten, breng de culturen van de spinnerflessen over in een liter centrifugeerbuisjes en verzamel cellen door centrifugatie.

Resuspendeer elke pellet in 10 milliliter ijskoud PBS, en verzamel de resuspendeerde cellen in een 50 milliliter buis voor centrifugatie bij vier graden Celsius. Voor een 10 milliliters cellenpellet, voeg 10 milliliters lysisbuffer toe aan de pellet, en draai de buis meerdere keren om de cellen opnieuw te suspenderen. Om tubuline uit adherente celculturen te zuiveren, leven de gewenste celtype nieuw leven in en versterk het om 10 confluente 15 centimeter schotels te verkrijgen op de dag van de tubulinevoorbereiding.

Om de adherente cellen te oogsten, behandel drie schotels tegelijk, kantel de kweekschalen om het medium te verwijderen terwijl een tweede persoon de cellen voorzichtig wast met zeven milliliter PBS-EDTA. Na het wassen, moet de tweede persoon de cellen behandelen met vijf milliliter PBS-EDTA per schaal voordat een derde persoon een cellifter gebruikt om de cellen voorzichtig naar één rand van de schaal te duwen. Wanneer de cellen zijn losgekoppeld, verzamel de cellen van alle drie de schotels in een 50 milliliter buis op ijs en spoel elke plaat met een extra twee milliliter PBS-EDTA om eventuele resterende cellen te verzamelen.

Na het verzamelen van de cellen door centrifugatie, gooi het supernatant weg om het volume van de cellenpellet te bepalen. Voeg de lysisbuffer toe, suspendeer de cellen opnieuw en breng ze over in een 14 milliliter buis met ronde bodem. Soniceer de cellen gedurende ongeveer 45 pulsen.

Voor hersenlysat van muizen, voeg 500 microliters gelicentieerde buffer toe aan een enkele hersenen die is geoogst van een volwassen muis en gebruik een weefselmenger om het weefsel te lyseren. Na het verkrijgen van het lysaat bij een 1/100e van het volume tot een gelijk volume van 2X Laemmli buffer en kook de oplossing gedurende vijf minuten. Bewaar het bij min 20 graden Celsius tot kwantificering.

Verzamel op deze manier een monster bij elke stap van de tubulinevoorbereiding. Om het lysaat te verduidelijken, centrifugeer het monster en gebruik een lange naald om voorzichtig het heldere supernatant over te brengen naar een nieuwe buis, zorg ervoor dat de bovenste zwevende laag wordt vermeden. Na de klaring van het lysaat is het essentieel om het zwevende materiaal in het supernatant te verwijderen, anders kan dit de efficiëntie van de tubuline zuivering negatief beïnvloeden.

Om tubuline uit het verduidelijkte lysaat te polymeriseren, meng het gehele volume supernatant een met een 1/200e volume van 0,2 molair GTP en een halve volume warm glycerol in een geschikt formaat buis. Pipetteer het mengsel voorzichtig, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in komen. Verzegeld de buizen met parafilm en plaats ze in een 30 graden Celsius waterbad gedurende 20 minuten.

Na centrifugatie, breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Om de microtubuli in de tweede pellet te depolymeriseren, suspendeer de pellet in ijskoud BRB 80 gedurende vijf minuten op ijs. Pipetteer het monster eerst met een P1000 pipette, dan met een P200 pipette, elke vijf minuten gedurende 20 minuten op ijs.

Zodra het monster homogeen is, centrifugeer het en breng het verkregen supernatant over naar een nieuwe buis. Om microtubuli geassocieerde eiwitten van de tubuline te verwijderen, meng het gehele volume supernatant drie met een gelijk volume voorverwarmde een molaire pipe S, hetzelfde volume voorverwarmde glycerol en een 1/100e volume van 0,2 molair GTP. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij 30 graden Celsius voordat je centrifugeert.

Breng het microtubuli geassocieerde eiwit bevattende supernatant vier over naar een nieuwe buis, het pellet bevat gepolymeriseerde microtubuli. Na het uitvoeren van een derde polymerisatie en depolymerisatie, kan de hoeveelheid geoogste tubuline worden gekwantificeerd door SDS-page analyse. Het succes van het zuiveringsproces kan worden bevestigd op een Coomassie gekleurde SDS-page.

Een lager dan verwachte opbrengst van de gezuiverde tubuline kan te wijten zijn aan een inefficiënte tubulinepolymerisatie zoals blijkt uit een lagere hoeveelheid tubuline in de tweede, vierde en zesde pelletfracties en een hogere hoeveelheid in de tweede, vierde en zesde supernatantfracties. Om de gezuiverde tubuline te kwantificeren, kunnen de monsters worden uitgevoerd naast bekende hoeveelheden bovien serumalbumine. Kwantitatieve densitometrie van de eiwitbanden maakt het vervolgens mogelijk om de hoeveelheid gezuiverde tubuline te berekenen.

De modificatiestatus van de tubuline kan worden bevestigd door immuno blot analyse van de monsters. Ons protocol maakt de isolatie van tubuline mogelijk met gecontroleerde post-translationele modificaties. Met dit tubuline kunnen we in vitro reconstitutie-experimenten opzetten die ons in staat stellen de impact van tubuline modificaties op microtubulaire eigenschappen, evenals op hun interacties met microtubuli geassocieerde eiwitten, te bepalen.