Name: TGF-β Signalering en TGF-β-geïnduceerde Epitheel-naar-mesenchymale overgang bij borstkanker en normale cellen bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Leer TGF-β-signalering en epitheel-naar-mesenchymale overgang bestuderen bij borstkanker met behulp van Western blotting, luciferase-assays en immunofluorescentie. Deze methode biedt inzicht in kankerprogressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen de steun van de Chinese Scholarship Council (CSC) aan J.Z. en Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) naar P.t.D.

1. Analyse van TGF-β-geïnduceerde SMAD2 fosforylering met behulp van westerse vlekken
OPMERKING: Premalignant menselijke borst MCF10A-Ras cellen werden gebruikt als een voorbeeld om TGF-β signalering reacties te onderzoeken33. In principe zijn de hieronder beschreven methoden ook van toepassing op andere TGF-β-responsieve cellijnen.
<ol><li>Kweek de borsteperiële cellijn MCF10A-Ras bij 37 °C in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM)/F12 met L-glutamine met 5% paardenserum, 20 ng/ml epidermale groeifactor (EFG), 10 mg/ml insuline, 100 ng/ml cholera-enterotoxine, 0,5 mg/ml hydrocortison en 1:100 penicilline-streptomycine (Pen-Strep).</li>
	<li>Probeer MCF10A-Ras cellen met 1 ml van 0,25% trypsine-EDTA gedurende 1 minuut en tel levensvatbare cellen met behulp van een celteller.</li>
	<li>Zaadcellen in 6-put platen met een dichtheid van 5×105 cellen/put.</li>
	<li>Behandel na nachtelijke groei cellen met TGF-β (5 ng/ml) of ligandbuffer (4 mM HCl, 0,1% vetzuurvrije runderserumalbumine (BSA)) gedurende 1 uur en verwijder vervolgens het kweekmedium en was de cellen voorzichtig twee keer met 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Koel cellen in 6-putplaten op ijs en voeg 150 μL voorgekoelde radio-immuunneerslagtest (RIPA) lysisbuffer (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 en vers toegevoegde mini proteaseremmercocktail). Laat de lysis 10 minuten op het ijs staan.</li>
	<li>Schraap hechtcellen van de schaal met behulp van een plastic celschraper en breng de celsuspensie voorzichtig over in een voorgekoelde microcentrifugebuis.</li>
	<li>Centrifugeer de cel gedurende 10 minuten bij 150 centrifugaalkracht (x g) bij 4 °C en breng het supernatant over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Meet de eiwitconcentratie met behulp van een wasmiddel compatibele (DC) eiwittestkit.</li>
	<li>Laad 30 μg eiwit uit elk monster op een 10% natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) gel en voer de gel gedurende 1,5-2 uur uit bij een spanning van 100 V.</li>
	<li>Breng de eiwitten van de gel over naar een 45-μm polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan bij een spanning van 110 V gedurende 1-1,5 uur.</li>
	<li>Breng het PVDF-membraan over in een geschikte container met de eiwitzijde (de kant die naar de gel gericht was) omhoog en spoel het membraan kort af in gedestilleerd water.</li>
	<li>Gooi het water weg, voeg Ponceau S-oplossing toe en leg het membraan 1-2 minuten op een schommelplatform.</li>
	<li>Bevlek het membraan met gedestilleerd water door het snel te spoelen en vervolgens 1 minuut te wassen.</li>
	<li>Plaats vervolgens het PVDF-membraan op een lichtbak en maak een foto om te controleren op gelijke totale eiwitbelastingen.</li>
	<li>Was het membraan met Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl en 0,1% Tween 20) totdat er geen zichtbare vlekken zijn.</li>
	<li>Plaats het membraan in de blokkerende buffer (5% magere melk in TBST-oplossing) en incubeer het gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was het membraan twee keer met TBST.</li>
	<li>Incubeer het membraan met primaire antilichamen tegen fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, zelfgemaakt 34), totaal SMAD2/3 1:1000 en glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH; 1:1000), 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Was het membraan twee keer met TBST en incubeer het membraan gedurende 2 uur met een secundair antilichaam tegen konijn of muis (1:5000).</li>
	<li>Incubeer het PVDF-membraan gedurende 30 seconden met westers ECL-substraat en detecteer het signaal met behulp van een beeldvormingssysteem.</li>
	<li>Herhaal de experimenten minstens drie keer om biologische drievouden te verkrijgen.</li>
</ol>2. Analyse van TGF-β-geïnduceerde SMAD3-afhankelijke transcriptionele reacties
<ol><li>Voer de SMAD3/SMAD4-afhankelijke CAGA12-luciferase transcriptional reporter assay uit.<ol>
<li>Kweek en trypsinize MCF10A-Ras cellen zoals beschreven in Stap 1. Zaadcellen in 24-putplaten op 5×104 cellen/put en laat de cellen 's nachts hechten.</li>
		<li>De dag na het zaaien, cotransfecteer de cellen in elke put met 100 ng van de TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 luciferase transcriptional reporter construct35 and 80 ng of the β-galactosidase expression construct using polyethylenimine (PEI). De transfectie van β-galactosidase wordt gebruikt om verschillen in transfectie-efficiëntie tussen verschillende putten te normaliseren. Stel elke experimentele groep in drievoud in.</li>
		<li>Na 24 uur incubatie verhongeren cellen met serumvrije DMEM-hoge glucose en voegen 6 uur later TGF-β (5 ng/ml) of ligandbuffer (4 mM HCl, 0,1% BSA) toe als voertuigcontrole aan de cellen.</li>
		<li>Na nog eens 24 uur incubatie, was cellen twee keer met voorverwarmde PBS.</li>
		<li>Voeg 120 μL/well 1× lysisbuffer toe en schud de plaat gedurende 20 minuten zachtjes bij 4 °C.</li>
		<li>Breng 30 μL lysaat over naar elke put van een 96-putige witte assay microplaat om luciferaseactiviteit te meten met behulp van een luminometer.</li>
		<li>Breng 50 μL lysaat over naar elke put van een 96-put transparante plaat om β-galactosidase-activiteit te meten.</li>
		<li>Normaliseer de luciferaseactiviteit tot de β-galactosidase-activiteit en herhaal de experimenten minstens drie keer om biologische drievouden te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyseer de expressie van TGF-β doelgenen met behulp van kwantitatieve real-time-polymerasekettingreactie (qRT-PCR).<ol>
<li>Kweek en trypsinize MCF10A-Ras cellen zoals beschreven in Stap 1. Zaadcellen in 6-putplaten op 5×105 cellen/put en laat de cellen 's nachts hechten.</li>
		<li>Behandel cellen met TGF-β (5 ng/ml) of ligandbuffer (4 mM HCl, 0,1% BSA) gedurende 6 uur en was de cellen vervolgens tweemaal met 1 ml PBS.</li>
		<li>Isoleer totaal RNA met behulp van een RNA-isolatiekit.</li>
		<li>Bepaal de RNA-concentratie met een NanoDrop en voer cDNA-synthese uit met 1 μg RNA met behulp van een eerste streng cDNA-synthesekit.</li>
		<li>Gebruik een real-time-PCR-detectiesysteem om kwantitatieve real-time-PCR (qRT-PCR) uit te voeren met tienvoudig verdunde cDNA in een 10 μL-reactiemengsel dat specifieke menselijke voorwaartse en omgekeerde primers voor GAPDH (voor normalisatie) bevat, SERPINE1 (codering van het PAI-1-eiwit, een TGF-β/SMAD-doelgen),SMAD7 (TGF-β/SMAD-doelgen) en qPCR Master Mix. Stel elke experimentele groep in drievoud in. OPMERKING: De primersequenties die worden gebruikt om menselijke doelgenen in qRT-PCR te detecteren, zijn opgenomen in tabel 1.</li>
		<li>Gebruik de volgende qPCR-reactieomstandigheden: initialisatie, 95 °C gedurende 3 minuten; denaturatie, 95 °C gedurende 10 seconden; gloeien, 60 °C gedurende 30 seconden; en verlenging, 80 °C gedurende 10 seconden; denaturatie, gloeien en verlengen worden 40 keer herhaald.</li>
		<li>Herhaal de experimenten minstens drie keer om biologische drievouden te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analyse van TGF-β-geïnduceerde EMT
<ol><li>Analyseer de expressie van EMT-markers op eiwitniveau met behulp van western blotting. OPMERKING: De analyse van TGF-β-geïnduceerde EMT wordt getoond met behulp van muis NMuMG epitheelcellen als voorbeeld36,37.<ol>
<li>Kweek NMuMG-cellen bij 37 °C in DMEM-hoog glucosemedium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1:100 Pen-Strep. Gebruik methoden die worden beschreven in stap 1 voor eiwitisolatie en -detectie. OPMERKING: In dit experiment worden de volgende antilichamen gebruikt: E-cadherine, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Slak, 1:1000; Slak, 1:1000; Tubuline, 1:1000 (figuur 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyseer de expressie van EMT-markers op mRNA-niveau met behulp van kwantitatieve real-time-PCR zoals beschreven in stap 2.2. OPMERKING: Alle muisprimers die worden gebruikt voor qRT-PCR, inclusief CDH1 (codering van het E-cadherine-eiwit), SNAILen ZEB2 (figuur 3) zijn opgenomen in tabel 1.</li>
	<li>Analyseer het EMT-proces met behulp van indirecte immunofluorescentie en directe fluorescentiekleuring.<ol>
<li>Indirecte immunofluorescentiekleuring van E-cadherine<ol>
<li>Plaats steriele 18 mm-side vierkante glazen afdeklippen in 6-put platen (één afdeklip per put).</li>
			<li>Zaad 1×105 NMuMG cellen met 2 ml complete DMEM per 6-put plaat en laat de cellen 's nachts hechten.</li>
			<li>Beweeg de afdeklippen met hechtende cellen voorzichtig naar een nieuwe plaat met 6 putten en voeg 2 ml kweekmedium toe aan de putten.</li>
			<li>Behandel de cellen gedurende 2 dagen met TGF-β (5 ng/ml) of ligandbuffer (4 mM HCl, 0,1% BSA).</li>
			<li>Verwijder het kweekmedium en was de cellen voorzichtig twee keer met 1 ml voorverwarmde PBS.</li>
			<li>Fixeer de cellen door 1 ml paraformaldehyde van 4% toe te voegen en gedurende 30 minuten op kamertemperatuur te broeden. Was vervolgens de cellen twee keer voorzichtig met 1 ml PBS.</li>
			<li>Permeabiliseer de vaste cellen met 0,1% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en was de cellen tweemaal met PBS.</li>
			<li>Blokkeer de cellen met 5% BSA in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en was de cellen twee keer met PBS.</li>
			<li>Voeg het primaire antilichaam tegen E-cadherine (verdund 1:1000 in PBS) toe aan de bovenkant van elke deklip en incub gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Verwijder het primaire antilichaam en was de afdeklip drie keer met PBS.</li>
			<li>Voeg het Alexa Fluor 555 secundaire antilichaam (verdund 1:500 in PBS) toe aan de bovenkant van elke coverslip en incubeert gedurende 1 uur bij kamertemperatuur terwijl het bedekt is met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht.</li>
			<li>Verwijder het secundaire antilichaam en was de afdeklip drie keer met PBS.</li>
			<li>Monteer de afdeklip (cellen naar beneden gericht) op glazen dia's met behulp van montagemedium met 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) en bewaar de gemonteerde dia's in een doos bij 4 °C, beschermd tegen licht.</li>
			<li>Observeer vlekken met SP8 confocale microscopie.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Directe fluorescentiekleuring van filamenteuze (F)-actine.<ol>
<li>Bereid monsters voor volgens stap 3.3.1.1. tot en met 3.3.1.9.</li>
			<li>Beits de cellen door Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) gedurende 1 uur op kamertemperatuur in het donker toe te voegen om filamenteuze actine (F-actine) te visualiseren.</li>
			<li>Was cellen drie keer met PBS.</li>
			<li>Monteer de coverslip op glazen dia's met behulp van montagemedium met DAPI en maak foto's met SP8 confocale microscopie.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

TGF-β/SMAD-signalering speelt een cruciale rol bij de progressie van borstkanker, omdat het de invasieve en uitzaaiingen van borstkankercellen kan bevorderen door EMT7te induceren. Hier beschreven we een logische workflow om TGF-β geïnitieerde signalering te onderzoeken van receptorgeïnduceerde SMAD-activering naar SMAD-gemedieerde transcriptie- en biologische reacties. We begonnen met het beschrijven van de analyse van SMAD2-fosforylering, gingen verder met TGF-β-geïnduceerde SMAD3-afhankelijke transcriptionele reacties en EMT-markerexpressie op zowel het gen- als eiwitniveau om de TGF-β / SMAD-signaleringsrespons te analyseren en onderzochten uiteindelijk TGF-β-geïnduceerde EMT. We gebruikten de CAGA12-luciferase transcriptional reporter met CAGA-boxen afgeleid van de PAI-1 promotor, om de activiteit van de TGF-β /SMAD signaleringsroute35te volgen. Deze reporter-constructie vereist SMAD3 en SMAD4 voor activering. Eerdere studies hebben aangetoond dat de knockdown van SMAD4 verzwakt tgf-β-geïnduceerde CAGA12-luciferase activiteit37. Naast de reporter-test is het bepalen van de fosforyleringsstatus van endogene SMADs, waaronder SMAD2 en SMAD3, een andere manier om de TGF-β signaleringsreactie te onderzoeken. Andere leden van de TGF-β familie, zoals groei - en differentiatiefactor (GDF)-8/myostatin en GDF-9, transduceren ook signalen via SMAD2/3-eiwitten door TβRI42,43,44in te schakelen . Naast de CAGA12-luciferase reporter zijn verschillende soortgelijke verslaggevers gebruikt om de activering van TGF-β signalering te detecteren. Een transcriptieverslaggever (SBE)4-Lux met responselementen afgeleid van de JunB-promotor kan bijvoorbeeld efficiënt worden geïnduceerd door TGF-β, activins en BMPs45.
Western blotting en qPCR werden gebruikt om TGF-β-geïnduceerde EMT te analyseren, wat klassieke methoden zijn om de expressie van epitheelmarkers (d.w.z. E-cadherine) en mesenchymal markers (d.w.z. N-cadherine, Snail, Slug en Zeb2) te onderzoeken. We hebben ook indirecte immunofluorescentiekleuring van E-cadherine en directe fluorescentiekleuring van F-actine uitgevoerd. Deze tests verder gevalideerd het mesenchymale fenotype van cellen na TGF-β behandeling. De beperking van immunofluorescentiekleuring is dat cellen vóór incubatie moeten worden gerepareerd met antilichamen en beeldvorming, en het is moeilijk om veranderingen in emt-markerexpressie in levende cellen te onderzoeken. Onlangs heeft het ontwerp van EMT reporter cell lines, zoals A549 lung adenocarcinoma-vimentin-RFP, het mogelijk gemaakt om de transformatie van epitheelcellen naar mesenchymale cellen in realtime te monitoren via de expressie van rood fluorescerend eiwit (RFP)-tagged vimentine. Dit platform kan worden gebruikt voor drugsscreening en nieuwe drugsontwikkeling46. LifeAct-kleurstof, een 17-aminozuurpeptide, dat F-actinestructuren in levende cellen kan bevlekken, wordt een waardevol hulpmiddel om het actinecytoskelet in realtime te visualiseren zonder de cellulaire processen te verstoren47. In deze studie gebruikten we twee kleine-molecuulremmers, SB431542 en GW788388, om hun remmende effect op TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT te valideren. Met name de GW788388 remt de TβRI- en TβRII-activiteit krachtig, terwijl SB431542 alleen een remmend effect heeft op TβRI (en ALK4 en ALK7). Eerdere studies toonden aan dat GW788388 krachtiger is in vivo dan SB43154240. Naast de remming van EMT verminderde GW788388 de expressie van fibrosemarkers in de nier en verminderde de orale toediening van GW788388 bij diabetische muizen de glomerulopathieaanzienlijk 25,48.
EMT speelt een essentiële rol bij het bevorderen van de plasticiteit van kankercellen en resulteert in geneesmiddelresistentie en uitzaaiingen 49. Daarom is het richten van EMT-afgeleide cellen met specifieke cytotoxische geneesmiddelen50 of het induceren van redifferentiatie via mesenchymal-to-epithelial transition (MET)51 voorgesteld als een aanpak om kankercelmetastasen en therapieresistentie te overwinnen. BMO draagt echter bij tot de proliferatie van verspreide kankercellen in verre organen52, wat contraproductief kan zijn bij het gebruik van de therapeutische omkering van EMT. Onlangs rapporteerde een nieuwe studie een therapeutische transdifferentiatiebenadering door emt-afgeleide borstkankercellen rechtstreeks te richten op differentiatie in adipocyten30. De studie van Ishay-Ronen et. al.30 gebruikt py2T murine epitheelkankercellen die een overgang naar mesenchymale cellen hadden ondergaan als reactie op langdurige behandeling met TGF-β. Ze toonden aan dat rosiglitazon in combinatie met MEK-remmers de epitheeldifferentiatie en adipogenese verbeterde. We ontdekten echter dat rosiglitazon alleen voldoende was om de transdifferentiatie van mesenchymale Py2T murinecellen in adipocyten te induceren.
Samengevat boden de methoden die in deze studie werden gebruikt een logische workflow om TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT te onderzoeken. De twee remmers, SB431542 en GW788388, kunnen TGF-β-geïnduceerde reacties en EMT blokkeren. Daarnaast hebben we ook aangetoond dat rosiglitazon alleen adipogenese induceert in bepaalde TGF-β geïnduceerde mesenchymale borstkankercellen. Hoewel we slechts verschillende borstkankercellijnen gebruikten om TGF-β reacties te onderzoeken, konden de hier beschreven methoden worden geëxtrapoleerd naar andere (kanker)cellen. Hier gebruikten we verschillende TGF-β concentraties om cellulaire reacties op te wekken. In de meeste celtypen oefent TGF-β zijn biologische activiteit uit in het concentratiebereik van 0,01-10 ng/ml53 en induceert signalering in een dosisresponspatroon. In primaire endotheelcellen, met inbegrip van boviene aorta-endotheelcellen, veroorzaakte TGF-β de substantiële expressie van gefosforyleerde SMAD2 bij 0,025 ng/ml, bereikte een maximum van 0,25 ng/ml en bleef op dit niveau in reactie op hogere concentraties53. In onze studie gebruikten we een hoge concentratie TGF-β (5 ng/ml) in MCF10A-Ras-cellen voor de transcriptionele reportertest om sterke reacties te verkrijgen. SMAD2-fosforylering en doelgenexpressie kunnen worden geïnduceerd door TGF-β in een lage dosis; zo gebruikten we 2,5 ng/ml TGF-β om cellen te behandelen. De meest geschikte werkconcentratie hangt echter af van het celtype en de geschatte effecten. Om de beste concentratie TGF-β te bepalen, wordt aanbevolen om de cellen met verschillende doses (van laag tot hoog) te behandelen.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Het cytokine transformerende groeifactor-β (TGF-β) is het prototype van een grote groep structureel en functioneel gerelateerde regulerende polypeptiden, waaronder TGF-βs (d.w.z. TGF-β1, -β2 en -β3), botmorfogene eiwitten (BMPs) en activines1,2. Deze cytokinen spelen allemaal een belangrijke rol bij de embryonale ontwikkeling en bij het behoud van weefsel- en orgaanhomeostase3. De verkeerde regelgeving van TGF-β kan leiden tot een grote verscheidenheid aan ziekten, waaronder kanker4,5. TGF-β speelt een complexe, dubbele rol bij de progressie van kanker: in normale en premaligne epitheelcellen gedraagt TGF-β zich als een tumoronderdrukker door proliferatie te remmen en apoptose6,7te induceren; in het late stadium van tumorprogressie, wanneer cytostatische reacties worden geblokkeerd door de activering van oncogenen of verlies van tumoronderdrukkergenen, fungeert TGF-β als een tumorversterker door epitheel-mesenchymale overgang (EMT) in kankercellen te bevorderen, waardoor kankercelinvasie en uitzaaiingen mogelijk worden, inwerken op cellen in het micromilieu van de tumor en angiogenese en immuunontduikingstimuleren 8,9,10.
TGF-β wordt afgescheiden als een inactief precursormolecuul dat de volwassen carboxy-terminale TGF-β en latentie-geassocieerd peptide (LAP)11bevat. Dit kleine complex kan covalent worden gebonden door latente TGF-β-bindend eiwit (LTBP)12. De afgifte van volwassen TGF-β kan worden bemiddeld door de werking van specifieke proteasen die LAP splijten of door het mechanisch trekken van LAP in een integrin-afhankelijk proces13,14. Naast LTBP worden glycoproteïne A-herhalingen die overheersen (GARP) sterk uitgedrukt op het oppervlak van regulerende T-cellen (Tregs) en speelt het een vergelijkbare rol als LTBP bij het reguleren van de activering van TGF-β15,16. GARP bindt rechtstreeks aan latente TGF-β door disulfidekoppeling en niet-covalente associatie. De activering van TGF-β van het GARP/TGF-β complex vereist integrins17. Volwassen TGF-β bindt aan TGF-β serine/threonine kinase receptoren, d.w.z. TGF-β type I (TβRI) en TGF-β type II (TβRII) receptoren18 om signalering te initiëren. De binding van TGF-β aan TβRII bevordert de aanwerving van TβRI en de vorming van een heteromere complex. Vervolgens wordt TβRI gefosforyleerd door TβRII kinase op serine- en threonineresiduen in een kort glycine- en serinerijk (GS)-motief, wat resulteert in de activeringervan 19,20. Bij activering rekruteert en fosforyleert geactiveerde TβRI zijn substraten: de twee receptorspecifieke SMADs (R-SMADs) die SMAD2 en SMAD3 omvatten (Figuur 1). R-SMADs delen een vergelijkbare algehele structuur met twee zogenaamde Mad homologie domeinen, MH1 en MH2, die worden gescheiden door een proline-rijke linker regio (Figuur 2). Het DNA-bindingsmotief binnen het MH1-domein van SMAD3 is niet geconserveerd tussen SMAD2 en SMAD3, en SMAD2 kan DNA niet rechtstreeks binden vanwege twee invoegingen in zijn MH1-domein (exon 3 en L1). SMAD2 en SMAD3 kunnen worden geactiveerd door de fosforylering van het SSXS-motief in hun C-termini (figuur 2). Gefosforyleerde SMAD2/3 vormt heteromere complexen met een gemeenschappelijke SMAD-bemiddelaar, SMAD4, die transloceert in de kern om de transcriptie van doelgenen te moduleren (figuur 1)7,21. Deze canonieke SMAD-signaleringsroute is nauwkeurig gereguleerd en genereert specifieke cellulaire en weefselreacties zoals de regulatie van cel fate en tumorcelmetastasen en invasie22. Naast TGF-β-SMAD-signalering kunnen niet-SMAD-signaleringsroutes ook direct worden geactiveerd door receptoren om downstream cellulaire reacties te reguleren23.
Tijdens tumorprogressie zijn de activering van TGF-β-geïnduceerde SMAD-afhankelijke en SMAD-onafhankelijke trajecten nodig voor de inductie van EMT. EMT is een omkeerbaar proces waarbij tumorcellen dedifferentiate van een epitheelfenotype, dat wordt geassocieerd met het verlies van celcelcontacten en verminderde apicaal-basale polariteit, tot een mesenchymaal fenotype met verbeterde beweeglijkheid en invasievermogen24. EMT wordt gekenmerkt door een verhoogde expressie van mesenchymale markereiwitten, waaronder N-cadherine, vimentine, Zeb2 en Snail1/2, en de gelijktijdige downregulatie van epitheelmarkers, zoals E-cadherine en β-catenine (figuur 3)25. De overgang van een epitheel naar een mesenchymale toestand is echter vaak onvolledig en cellen krijgen gemengde epitheel- en mesenchymale (E/M) kenmerken. Een recent artikel van de International EMT association stelde voor om het proces van cellen die tussenliggende E/M fenotypische toestanden ondergaan te beschrijven als epitheel-mesenchymale plasticiteit (EMP)26. Deze plasticiteit verwijst naar gedeeltelijke EMT, een hybride E/M-status, een uitzaaibare EMT-toestand, een EMT-continuüm en een EMT-spectrum26. Tijdens EMT krijgen tumorcellen csc-eigenschappen (Cancer Stem Cell) en worden ze resistenter tegen door onthechting veroorzaakte apoptose27. Hoewel EMT verantwoordelijk is voor de verwerving van een invasief fenotype in primaire tumorcellen en de progressie van kanker stimuleert, is daarentegen aangetoond dat mesenchymale-epitheeltransitie (MET) een belangrijke rol speelt in de uitgroei van verspreide tumorcellen op verre gemetastaseerde locaties28,29. Een recente studie toonde aan dat EMT-afgeleide borstkankercellen kunnen worden omgezet in adipocyten, wat een kans zou kunnen bieden om uitzaaiingen te remmen en therapieresistentie in tumorcellen en teruggevallen kanker te overwinnen30. Vanwege de belangrijke rol van TGF-β signalering bij de activering van EMT bij kankerverwekkende borst, we presenteren gedetailleerde protocollen voor western blotting, een luciferase transcriptional reporter assay, kwantitatieve real-time-polymerase kettingreactie (qRT-PCR) en immunofluorescentie voor het onderzoek van TGF-β signalering, TGF-β-geïnduceerde EMT, en de transdifferentiatie van EMT-afgeleide murine borst epitheel tumorcellen in adipocyten. Deze technieken zijn de meest gebruikte analytische tools op het gebied van celbiologie. qRT-PCR wordt gebruikt om mRNA-expressieniveaus kwantitatief te detecteren, karakteriseren en kwantificeren. In vergelijking met kwantitatieve PCR (qPCR), een alternatieve techniek, kan de reverse transcription (RT)-PCR worden gebruikt om mRNA-expressie op semikwantitatieve wijze te bepalen31,32. Western blotting wordt gebruikt om specifieke eiwitniveaus in een bepaald cellysaatmonster te onderzoeken met voordelen van gevoeligheid en specificiteit, op een semi-kwantitatieve manier. Zo presenteren we een systematische workflow om veranderingen van genexpressie naar eiwitexpressie te analyseren om TGF-β-signalering te helpen onderzoeken die ook op andere signaleringsroutes kan worden toegepast.

<table><tbody><tr><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm-zijde vierkante glazen dekglasjes</td><td>Menzel Gläser</td><td>631-1331</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 secundair antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-cadherine antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td></td></tr><tr><td>anti-glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase(GAPDH) antilichaam</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-N-cadherine antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>610920</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Slug antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9585</td><td></td></tr><tr><td>anti-SMAD2/3 antilichaam</td><td>Becton Dickinson</td><td>610842</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Snail antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tubuline antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2148</td><td></td></tr><tr><td>Rund Serum Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Cholera enterotoxine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substraat</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>DC-eiwit assay kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000111</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-hoge glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-hoge glucose medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s aangepast Eagle&rsquo;s medium (DMEM)/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039047</td><td></td></tr><tr><td>Epidermale groeifactor (EGF)</td><td>Merck Millipore</td><td>01-107</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum (FBS)</td><td>BioWest</td><td>S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>PROMEGA</td><td>A600X</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II kit</td><td>BIOKE&acute;</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine (Pen-Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleeniminee (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthese Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>557366-M</td><td></td></tr><tr><td>Veelkleur</td><td>Campina: Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging Systeem</td><td>Bio-Rad</td><td>17001402</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Detectie Systeem</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrofotometers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr></tbody></table>

tgf-β signalering en tgf-β-geïnduceerde epitheel-naar-mesenchymale overgang bij borstkanker en normale cellen bestuderen

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Het transformeren van groeifactor-β (TGF-β) is een afgescheiden multifunctionele factor die een sleutelrol speelt in intercellulaire communicatie. Verstoringen van TGF-β signalering kan leiden tot borstkanker. TGF-β lokt de effecten ervan uit op proliferatie en differentiatie via specifiek celoppervlak TGF-β type I- en type II-receptoren (d.w.z. TβRI en TβRII) die een intrinsiek serine/threoninekinasedomein bevatten. Bij TGF-β-geïnduceerde heteromere complexe vorming lokt geactiveerde TβRI intracellulaire signalering uit door fosforylaatende SMAD2 en SMAD3. Deze geactiveerde SMAD's vormen heteromere complexen met SMAD4 om specifieke doelgenen te reguleren, waaronder plasminogene activeringsremmer 1 (PAI-1, gecodeerd door het SERPINE1-gen). De inductie van epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) maakt epitheelkankercellen op de primaire locatie of tijdens kolonisatie op verre locaties mogelijk om een invasief fenotype te krijgen en tumorprogressie te stimuleren. TGF-β fungeert als een krachtige inductor van borstkanker invasie door het drijven van EMT. Hier beschrijven we systematische methoden om TGF-β signalering en EMT-reacties te onderzoeken met behulp van premalignant menselijke MCF10A-RAS (M2) cellen en muis NMuMG epitheelcellen als voorbeelden. We beschrijven methoden om TGF-β-geïnduceerde SMAD2-fosforylering te bepalen door westerse blotting, SMAD3/SMAD4-afhankelijke transcriptieactiviteit met behulp van luciferaseverslaggeveractiviteit en SERPINE1-doelgenexpressie door kwantitatieve real-time-polymerasekettingreactie (qRT-PCR). Daarnaast worden methoden beschreven om TGF-β-geïnduceerde EMT te onderzoeken door veranderingen in morfologie, epitheel- en mesenchymale markerexpressie, filamenteuze actinekleuring en immunofluorescentiekleuring van E-cadherine te meten. Twee selectieve kleine molecule TGF-β receptorkinaseremmers, GW788388 en SB431542, werden gebruikt om TGF-β-geïnduceerde SMAD2-fosforylering, doelgenen en veranderingen in EMT-markerexpressie te blokkeren. Bovendien beschrijven we de transdifferentiatie van mesenchymale borst Py2T murine epitheeltumorcellen in adipocyten. Methoden om TGF-β-geïnduceerde signalering en EMT bij borstkanker te onderzoeken, kunnen bijdragen aan nieuwe therapeutische benaderingen voor borstkanker.

Analyse van TGF-β signalering De belangrijkste stap in TGF-β signalering is de fosforylering van de twee meest carboxy terminale serineresiduen in het SSXS-motief (figuur 2) door TβRI kinase38,39. Om TGF-β signaleringsreacties te onderzoeken, hebben we westerse vlekken van gefosforyleerde SMAD2 uitgevoerd. In de premalignant menselijke borst MCF10A-Ras cellen, de fosforylering van SMAD2 significant toegenomen in reactie op TGF-β stimulatie gedurende 1 uur, terwijl de expressie van de totale SMAD2/3 werd niet beïnvloed door TGF-β behandeling (Figuur 4A). Door gebruik te maken van de TGF-β-geïnduceerde SMAD3/4-aangedreven CAGA-luc transcriptional reporter assay, ontdekten we dat TGF-β de luciferase reporter in de MCF10A-Ras cellenlijn duidelijk geïnduceerd in vergelijking met niet-behandelde cellen (Figuur 4B). Bovendien merkten we op dat goed gekarakteriseerde directe transcriptionele gendoelen van TGF-β waaronder SMAD7 en SERPINE1 (codering van het PAI-1-eiwit), sterk werden uitgedrukt in TGF-β behandelde MCF10A-Ras-cellen (figuur 4C).
Analyse van TGF-β-geïnduceerde EMT We beoordeelden TGF-β-geïnduceerde EMT met verschillende methoden, zoals morfologische veranderingen, de expressie van EMT-markers bij het mRNA- en eiwitgehalte en immunofluorescentiekleuring van EMT-markers36. NMuMG epitheelcellen behandeld met TGF-β gedurende 1 en 2 dagen veranderden van een klassieke epitheelmorfologie in een spindelvormige mesenchymale morfologie, zoals blijkt uit fasecontrastmicroscopie (figuur 5A). In overeenstemming met de morfologische veranderingen, merkten we op dat TGF-β behandeling leidde tot een toename van de eiwitexpressie van mesenchymale markers, waaronder N-cadherine, Snail en Slug37 (Figuur 5B). E-cadherine, een epitheelmarker, werd daarentegen na 2 dagen behandeling met TGF-β in NMuMG-cellen gedereguleerd (figuur 5B). Daarnaast hebben we kwantitatieve real-time-polymerasekettingreactie (qRT-PCR) uitgevoerd om de genexpressie van EMT-markers te onderzoeken. CDH1 (codering van het E-cadherine-eiwit) werd aanzienlijk verlaagd, terwijl mesenchymal markers zoals SNAIL en Zinc finger E-box-binding homeobox 2 (ZEB2) aanzienlijk werden verhoogd na TGF-β stimulatie in NMuMG-cellen in vergelijking met onbehandelde cellen (figuur 5C). TGF-β-geïnduceerde EMT in NMuMG-cellen werd verder bevestigd door immunofluorescentiekleuring van E-cadherine. Bij TGF-β stimulatie gedurende 2 dagen, NMuMG cellen uitgedrukt minder E-cadherine dan cellen in de niet-geïnduceerde controlegroep, zoals geanalyseerd door confocale microscopie(figuur 5D). Bovendien, NMuMG cellen in de aanwezigheid van TGF-β gevormd meer actine stress vezels, zoals blijkt uit confocale microscopie(figuur 5E).
SB431542 en GW788388 remmen TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT SB431542 is een ATP-competitieve remmer van het kinasedomein van TβRI, ook wel activinereceptorachtige kinase 5 (ALK5) wordt vermeld, terwijl GW788388 de activiteit van TβRI en TβRII kinase remt. Beide remmers kunnen TGF-β receptor signaal40remmen. Zo behandelden we NMuMG-cellen met verschillende concentraties GW788388 in aanwezigheid van TGF-β gedurende 1 uur. Zoals verwacht remde GW788388 TGF-β-geïnduceerde SMAD2-fosforylering op een dosisafhankelijke manier (figuur 6A). Bovendien werd de TGF-β gemedieerde fosforylering van SMAD2 geblokkeerd door de behandeling met SB431542 (figuur 6A). Gefosforyleerde SMAD2/3 vormt een heteromere complex met SMAD4 en transloceert in de kern om de transcriptie van doelgenen te moduleren. Daarom onderzochten we de translocatie van SMAD2/3 in NMuMG-cellen door immunofluorescentiekleuring van SMAD2/3. De gegevens toonden aan dat zowel SB431542 als GW788388 de TGF-β-geïnduceerde nucleaire translocatie en accumulatie van SMAD2/3 in NMuMG-cellen aanzienlijk remden (figuur 6B). Bovendien werden de remmende effecten van SB431542 en GW788388 ook waargenomen in de mRNA-expressieniveaus van belangrijke TGF-β doelgenen die betrokken zijn bij EMT, waaronder PAI-1, SNAIL, E-cadherin en Fibronectin (figuur 6C). Deze gegevens suggereerden dat SB431542 en GW788388 TGF-β-signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT blokkeerden.
Analyse van de transdifferentiatie van mesenchymale borstkankercellen in adipocyten EMT speelt een vitale rol bij het verbeteren van cellulaire plasticiteit bij kankers en resulteert in de ontwikkeling van therapieresistentie. Plasticiteit van kankercellen kan direct worden gericht en geremd met een transdifferentiatiebenadering, zoals geforceerde adipogenese30. We gebruikten Py2T murine borstkankercellen, die werden afgeleid van de borstklier van een muis mammary tumor virus-polyoom midden tumor-antigeen (MMTV-PyMT) transgene muis, als een cellulair model van EMT-geïnduceerde kankercel plasticiteit. Op basis van een vastgesteld protocol41,behandelden we EMT-afgeleide Py2T murine borstkankercellen met het antidiabetische medicijn rosiglitazon gedurende 10 dagen om adipogenese op te wekken. Adipogenese werd beoordeeld door lipidedruppels te visualiseren met behulp van olierode O-vlekken. Vetcellen werden gemakkelijk gedetecteerd in met rosiglitazon behandelde Py2T murine borstkankercellen (figuur 7), wat aantoonde dat behandeling met alleen rosiglitazon voldoende is om de transdifferentiatie van EMT-afgeleide borstkankercellen in adipocyten te bevorderen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig01.jpg"> Figuur 1: TGF-β/SMAD signalering. TGF-β signalering initieert met de binding van TGF-β aan TGF-β type II-receptor (TβRII), een constitutief actieve kinase, die TGF-β type I-receptor (TβRI) fosforyleert. Activeer vervolgens TβRI kinasefosforylaten SMAD2/3. Een peptide dat het SSXS-motief van SMAD2 bevat met twee carboxy terminale gefosforyleerde serineresiduen werd gebruikt om polyklonale antisera te verkrijgen die fosfor-SMAD2 (p-SMAD2) herkennen. Daarom kan de analyse van p-SMAD2-expressie door western blotting worden gebruikt om de activering van de TGF-β signaleringsroute te bepalen. Gefosforyleerde SMAD2/3 kan heteromere complexen vormen met SMAD4, die vervolgens transloceren naar de kern om transcriptionele reacties te moduleren. De CAGA12-luciferase reporter assay en quantitative real time PCR (qRT-PCR) voor de mRNA expressie van TGF-β doelgenen zoals SMAD7 en SERPINE1 (coderende PAI-1 eiwit), kan worden gebruikt om TGF-β-geïnduceerde SMAD3-afhankelijke transcriptionele reacties te analyseren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig02.jpg"> Figuur 2: Schematische structuur van R-SMADs (SMAD2 en SMAD3). De MH1 (blauw) en MH2 (geel) domeinen worden geconserveerd onder R-SMADs, maar het linkergebied (grijs) is niet geconserveerd. Het MH1-domein van SMAD3 herbergt een DNA-bindend motief, terwijl SMAD2 DNA niet direct kan binden, vanwege een invoeging (exon 3) in zijn MH1-domein. Het MH2-domein bemiddelt SMAD-oligomerisatie, interactie met TGF-β receptoren en eiwitbinding en is betrokken bij transcriptionele regulatie. SMAD2 en SMAD3 kunnen worden geactiveerd door de fosforylering van het SSXS-motief (in rood) in hun C-termini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig03.jpg"> Figuur 3: TGF-β-geïnduceerde EMT. Tijdens TGF-β-geïnduceerde epitheel-mesenchymale overgang (EMT), ondergaan de cellen verlies van epitheel en verwerving van mesenchymale kenmerken met verbeterde celmotiliteit en invasievermogen. De inductie van EMT leidt tot de expressie van mesenchymal markers zoals N-cadherin, Zeb2 en Snail1/2, evenals de downregulatie van epitheelmarkers, waaronder E-cadherine, β-catenine en claudin-1. Het geaccumuleerde verlies of de toename van epitheel/mesenchymale (E/M) kenmerken zorgt ervoor dat een cel op een omkeerbare manier tussentoestanden invoert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig04.jpg"> Figuur 4: TGF-β signaleringsreacties in MCF10A-Ras cellen. (A) MCF10A-Ras-cellen werden gedurende 1 uur behandeld met of zonder TGF-β (2,5 ng/ml) en cellysaten waren immunoblot voor gefosforyleerde SMAD2 (p-SMAD2), totale SMAD2/3 en GAPDH (als belastingscontrole). De maatmarkering wordt rechts weergegeven. Con: Controlegroep zonder TGF-β behandeling. (B) Analyse van TGF-β (5 ng/ml) activiteit met behulp van de SMAD3–SMAD4-afhankelijke CAGA12-luciferase (LUC) transcriptional reporter in MCF10A-Ras cellen. De waarden worden genormaliseerd tot β-galactosidase (βGal) activiteit. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± s.d, n = 3. Student's t test, ***P ≤ 0.001 (C) qRT-PCR analyse van de TGF-β doelgenen SMAD7 en SERPINE1 (codering van het PAI-1 eiwit) in MCF10A-Ras cellen behandeld met TGF-β (2,5 ng/ml) gedurende 6 uur. GAPDH werd gebruikt als interne controle. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± s.d, n = 3. Student's t test, ***P ≤ 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig05.jpg"> Figuur 5: TGF-β-geïnduceerde EMT in NMuMG-cellen. (A) Morfologie van NMuMG-cellen behandeld met TGF-β (2,5 ng/ml) gedurende 1 of 2 dagen. In aanwezigheid van TGF-β, NMuMG cellen getransdifferentieerd in een mesenchymal fenotype. Schaalbalk = 150 μm (B) NMuMG-cellen werden gedurende 2 dagen behandeld met of zonder TGF-β (5 ng/ml) en EMT-markers werden geanalyseerd door westerse vlekken. De maatmarkering is zoals aangegeven aan de rechterkant. Con: Controlegroep zonder TGF-β behandeling. (C) Genexpressieanalyse van EMT-markers (CDH1 (codeert voor het E-cadherine-eiwit),SNAIL en ZEB2) in NMuMG-cellen die gedurende 2 dagen zijn behandeld met TGF-β (5 ng/ml). GAPDH werd gebruikt als interne controle. De resultaten worden uitgedrukt als de gemiddelde ± s.d., n = 3. T-toets student, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001. (D) NMuMG-cellen werden gekleurd door immunofluorescentie om de expressie van de epitheelmarker E-cadherine (rood) na behandeling met TGF-β (2,5 ng/ml) gedurende 2 dagen te detecteren. Nuclei werden tegengehouden met DAPI (blauw). Beelden werden gemaakt met confocale microscopie. Schaalbalk = 50 μm (E) NMuMG-cellen werden gekleurd met fluoresceïne-falloline (groen) om F-actine te visualiseren. Nuclei werden tegengehouden met DAPI (blauw). Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig06.jpg"> Figuur 6: TGF-βsignaling en TGF-β-geïnduceerde EMT werden geremd door SB431542 en GW788388. (A) NMuMG-cellen werden gedurende 1 uur behandeld met 10 μM SB431542 (SB) of de geïndiceerde concentraties GW788388 (GW) in de aan- of afwezigheid van TGF-β (5 ng/ml). De cellysaten waren immunoblotted voor p-SMAD2, SMAD2/3 en GAPDH. (B) NMuMG-cellen werden behandeld met 5 μM SB431542 (SB) of 10 μM GW788388 (GW) in de aan- of afwezigheid van 5 ng/ml TGF-β gedurende 1 uur en gekleurd door immunofluorescentie om de nucleaire translocatie van SMAD2/3 (groen) te detecteren. Beelden werden gemaakt met confocale microscopie. (C) Expressie van TGF-β doelgenen, waaronder PAI-1 en genen die coderen voor EMT-markers, waaronder SNAIL, E-Cadherin en Fibronectin, werden geanalyseerd door reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) in NMuMG-cellen na SB- of GW-behandeling en TGF-β stimulatie gedurende 48 uur. GAPDH diende als laadcontrole. Controle geeft niet-behandelde cellen aan. Dit cijfer is gewijzigd van Petersen M. et al. 34 met toestemming van uitgever. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig07.jpg"> Figuur 7: EMT-afgeleide Py2T murine borstkankercellen kunnen worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in adipocyten. Py2T murine borstkankercellen werden gestimuleerd met 2 ng/ml TGF-β gedurende 20 dagen om volledige EMT te induceren. Vervolgens werden de cellen gedurende 10 dagen behandeld met DMSO als voertuigcontrole of rosiglitazon (2 μM) om de differentiatie van mesenchymale kankercellen mogelijk te maken en adipogenese op te wekken. Het medium werd elke 2 dagen veranderd. Na 10 dagen behandeling werden cellen bevlekt met olierood O. Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soort(en)</td>
			<td>Gennaam</td>
			<td colspan="2">Vooruit (5' tot 3')</td>
			<td colspan="2">Achteruit (5' tot 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Menselijke</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGCACCACCAACTGCTTAGC</td>
			<td colspan="2">GGCATGGACTGTGGTCATGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMAD7</td>
			<td colspan="2">TCCAGATGCTGTGCCTTCC</td>
			<td colspan="2">GTCCGAATTGAGCTGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SERPINE1</td>
			<td colspan="2">CACAAATCAGACGGCAGCACT</td>
			<td colspan="2">CATCGGGCGTGGTGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Muis</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC</td>
			<td colspan="2">AAGATGGTGATGGGCTTCCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>CDH1</td>
			<td colspan="2">ACCAAAGTGACGCTGAAGTC</td>
			<td colspan="2">GAGGATGTACTTGGCAATGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Slak</td>
			<td colspan="2">CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT</td>
			<td colspan="2">GCGAGGGCCTCCGGAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZEB2</td>
			<td colspan="2">TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC</td>
			<td colspan="2">TTCTGGCCCCATTGCATCAT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Primers gebruikt voor qRT-PCR.

We beschrijven een systematische workflow om TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT te onderzoeken door de eiwit- en genexpressie te bestuderen die betrokken zijn bij deze signaleringsroute. De methoden omvatten western blotting, een luciferase reporter assay, qPCR, en immunofluorescentie vlekken.

TGF-β Signalering en TGF-β-geïnduceerde Epitheel-naar-mesenchymale overgang bij borstkanker en normale cellen bestuderen

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

TGF-beta is een belangrijke aanjager van epitheliale-tot-mesenchymale transitie, kortweg EMT, die zowel in normale als in kankercellen kan optreden. De methoden die in ons protocol worden beschreven, stellen onderzoekers in staat om de impact van modulatoren op zowel TGF-beta SMAD-signalering als TGF-beta-geïnduceerde EMT te meten. De ongetransformeerde NMuMG-cellen, die zijn geïsoleerd uit een muisborstklier, zijn een veelgebruikt modelsysteem voor TGF-beta-geïnduceerde EMT.TGF-beta veroorzaakt in deze cellen, deze NMuMG-cellen, een zeer sterke EMT-respons. Een soortgelijke respons kan ook worden waargenomen in borstkankercellen, waar het bijdraagt aan kankerprogressie. De gecombineerde kleuring van epitheliaal micro E-cadherine en de organisatie van filamenteus-actine helpt om de morfologische veranderingen die optreden tijdens epitheliale-tot-mesenchymale transitie te valideren en beter te visualiseren.Het verwerven van een mesenchymale fenotypie door kankercellen is in verband gebracht met een verhoogde capaciteit van cellen om te migreren, binnen te dringen en te metastaseren, evenals met resistentie tegen chemotherapie. Deze methode kan belangrijke inzichten opleveren in kankerprogressie, maar ook in andere processen zoals weefselfibrose. Houd er bij het toepassen van dit protocol rekening mee dat de celdichtheid goed gecontroleerd moet worden.Een hoge dichtheid van de cellen maakt epitheliale-tot-mesenchymale transitie moeilijk. Met deze visuele demonstratie zullen onderzoekers een goed begrip krijgen van hoe ze TGF-beta-signalering en TGF-beta-geïnduceerde EMT-experimenten kunnen uitvoeren. Om indirecte immunofluorescente kleuring van E-cadherine uit te voeren, begint u door steriele 18 millimeter vierkante glazen dekglasjes in zes-well platen te plaatsen, één dekglas per well.Zaai 100.000 NMuMG-cellen met twee milliliters compleet DMEM in elke well en laat de cellen overnacht hechten. Niet-getransformeerde NMuMG-cellen worden vaak gebruikt als modelsysteem om TGF-beta-geïnduceerde EMT te onderzoeken. Op de volgende dag, verplaatst u voorzichtig de dekglasjes met aderente cellen naar een nieuwe zes-well plate en voegt u twee milliliters kweekmedium toe aan de wells.Behandel de cellen met ligandbuffer als controle of vijf nanogram per milliliter TGF-beta gedurende twee dagen. Het toegevoegde ligandbuffer moet hetzelfde volume hebben als het toegevoegde TGF-beta. Na de behandeling, verwijdert u het kweekmedium en wast u de cellen voorzichtig twee keer met één milliliter voorverwarmd PBS.Fixeer de cellen door één milliliter 4% paraformaldehyde toe te voegen en 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen, wast u vervolgens de cellen twee keer met één milliliter PBS. Permeabiliseer de gefixeerde cellen met 0,1% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en was de cellen twee keer met PBS. Blokkeer de niet-specifieke eiwitbinding aan cellen met 5% BSA in PBS gedurende één uur bij kamertemperatuur, was vervolgens opnieuw met PBS.Voeg het primaire antilichaam tegen E-cadherine toe aan de bovenkant van elk dekglas en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder het primaire antilichaam en was elk dekglas drie keer met PBS. Voeg de Alexa Fluor 555 secundaire antilichamen en de Alexa Fluor 488 phalloidine toe aan de bovenkant van elk dekglas.Dek vervolgens af met aluminiumfolie en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder het secundaire antilichaam en was het dekglas drie keer met PBS. Monteer het dekglas met de cellen naar beneden op glasplaatjes met montagemedium met DAPI en bewaar de gemonteerde plaatjes in een doos op vier graden Celsius beschermd tegen licht.Observeer de kleuring met SP8 confocale microscopie. In de MCF10A-Ras-cellijn nam de fosforylering van SMAD2 significant toe als reactie op TGF-beta-stimulatie, terwijl de expressie van totale SMAD2 en 3 niet werd beïnvloed. TGF-beta induceerde ook opmerkelijk de luciferase reporter in de MCF10A-Ras-cellijn vergeleken met niet-behandelde cellen.Goed gekarakteriseerde directe transcriptionele gendoelen van TGF-beta, inclusief SMAD7 en SERPINE1, werden sterk tot expressie gebracht in TGF-beta-behandelde MCF10A-Ras borstcellen. NMuMG-epitheelcellen behandeld met TGF-beta veranderden van een klassieke epitheelmorfologie naar een spilvormige mesenchymale-achtige morfologie. In overeenstemming met de morfologische veranderingen leidde behandeling met TGF-beta tot een toename in de eiwitexpressie van mesenchymale markers.In tegenstelling daarmee, werd E-cadherine, een epitheelmarker, gereguleerd na twee dagen van behandeling met TGF-beta. Kwantitatieve real-time polymerase PCR werd gebruikt om de genexpressie van EMT-markers na TGF-beta-stimulatie te onderzoeken. CDH1 was significant verminderd terwijl mesenchymale markers toenamen.Na TGF-beta-stimulatie, drukten NMuMG-cellen minder E-cadherine uit dan de cellen in de controlegroep. Bovendien vormden de cellen meer actine stressvezels in de aanwezigheid van TGF-beta. Behandeling met GW788388 remde TGF-beta-geïnduceerde SMAD2-fosforylering op dosis-afhankelijke wijze.Bovendien werd de door TGF-beta gemedieerde fosforylering van SMAD2 geblokkeerd door behandeling met SB-431542. Zowel SB-431542 als GW788388 remden significant de door TGF-beta geïnduceerde nucleaire translocatie en accumulatie van SMAD2 en 3 in NMuMG-cellen. Na deze procedure kan immunofluorescente kleuring van andere epitheliale-tot-mesenchymale macroproteïnen worden uitgevoerd door de specifieke primaire en secundaire antilichamen te veranderen om de expressieniveau en lokalisatie van deze eiwitten binnen de cel te onderzoeken.

studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Een eenvoudige werkwijze beschreven voor de inductie van epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) in verschillende celtypen. Methoden voor de analyse van cellen in EMT toestanden met immunocytochemie inbegrepen.

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Dit videoartikel beschrijft een gewijzigde in vitro methode om de rol van hormonen, cytokinen en/of groeifactoren bij het aanjagen van kankercelinvasie te onderzoeken.

Gemodificeerd<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Assay naar de mogelijke rol van hormonen, cytokines en / of groeifactoren in Bemiddelen Cancer Cell Invasion Bepaal

Het is aangetoond dat de regulatie van alternatieve splicing bijdraagt aan de epitheel-mesenchymale overgang (EMT), een essentieel cellulair programma in verschillende fysiologische en pathologische processen. Hier beschrijven we een methode die gebruikmaakt van een induceerbaar EMT-model voor de detectie van alternatieve splicing tijdens EMT.

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

Hier beschrijven we de ontwikkeling en toepassing van een gelcontractie-assay voor het evalueren van contractiele functie in mesenchymale cellen die een epitheel-mesenchymale overgang hebben ondergaan.

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer

Hier beschrijven we een driedimensionale cultuur-methode voor het analyseren van de morfologie van primaire borstkankercellen, alsmede over de studie van hun directe/indirecte interacties met monocyten en de resultaten zoals de aantasting van het collageen, immuun cel aanwerving, cel invasie, en bevordering van kanker-gerelateerde ontsteking.

Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem

Een protocol voor in vitro inductie van endotheel-mesenchymale overgang (EndMT), die nuttig is voor het onderzoeken van cellulaire signaalroutes die betrokken zijn bij EndMT, wordt beschreven. In dit experimenteel model wordt EndMT veroorzaakt door behandeling met TGF-β in MS-1 endotheliale cellen.

Moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering

Hier presenteren we een protocol voor levende cellen beeldvorming van de signalering activiteit TGF-β/Smad3 met behulp van een adenovirus verslaggever systeem. Dit systeem transcriptionele activiteit in real time worden bijgehouden en kunnen worden toegepast op beide afzonderlijke cellen in vitro en in levende diermodellen.

Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem

We presenteren een hoge doorvoer tractiekracht assay gefabriceerd met silicone rubber (PDMS). Deze nieuwe assay is geschikt voor het bestuderen van fysieke veranderingen in cel contractiliteit tijdens verschillende biologische en biomedische processen en ziekten. We demonstreren het nut van deze methode door het meten van een TGF-β afhankelijke toename van de contractiliteit tijdens de epitheel-naar-mesenchymale overgang.

Hoge doorvoer Tractiekracht microscopie met behulp van PDM'S onthult dosisafhankelijke effecten van het transformeren van groei factor-β op de epitheliale-naar-mesenchymale overgang

We beschrijven methoden om TGF-β2-geïnduceerde EndMT in endotheelcellen te onderzoeken door celmorfologieveranderingen te observeren en de expressie EndMT-gerelateerde markerveranderingen te onderzoeken met behulp van immunofluorescentiekleuring. CRISPR/Cas9 genbewerking werd beschreven en gebruikt om het gen dat codeert voor Snail uit te putten om zijn rol in TGF-β2-geïnduceerde EndMT te onderzoeken.

TGF-β-gemedieerde Endotheel naar Mesenchymal Transition (EndMT) en de functionele beoordeling van EndMT-effectoren met crispr/cas9 genbewerking

Leer TGF-β-signalering en epitheel-naar-mesenchymale overgang bestuderen bij borstkanker met behulp van Western blotting, luciferase-assays en immunofluorescentie. Deze methode biedt inzicht in kankerprogressie.

TGF-β Signalering en TGF-β-geïnduceerde Epitheel-naar-mesenchymale overgang bij borstkanker en normale cellen bestuderen

Meer video's verkennen