Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel

Gerichte proteomische benaderingen worden snel de methode bij uitstek voor validatie van eiwitten uit op proteomics gebaseerde experimenten op korte termijn of uit op moleculaire biologie gebaseerde experimenten. Meervoudige reactiebewaking is zo'n gerichte aanpak die steeds vaker wordt gebruikt om eiwitten uit biologische monsters te detecteren en te kwantificeren. In deze studie hebben we de verschillende stappen doorlopen die betrokken zijn bij het detecteren en kwantificeren van eiwitten uit menselijk hersenweefsel met de bedoeling de lezers kennis te laten maken met de basisvereisten van een MRM-experiment.

Weeg ongeveer 50 mg hersenweefsel en was het weefsel met 300 microliter 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing. Deze stap wordt uitgevoerd om bloed op het externe oppervlak van het weefsel te verwijderen en daarom is het raadzaam om zoveel mogelijk bloed te verwijderen. Voeg na het wassen met PBS 300 microliter lysisbuffer toe aan de buis die het weefsel bevat.

Lyse het weefsel met behulp van een sonde sonicator terwijl het houden van de buis op een ijsbad. Ga verder met weefselhomogenisatie met behulp van een kraalklopper om het weefsel volledig te lyseren. Centrifugeer de inhoud van de buis gedurende 15 minuten op 6000 g bij vier graden Celsius.

Breng het supernatant over in een verse buis en meng homogeen. Neem een kleine aliquot van het supernatant en kwantificeer het eiwitgehalte met behulp van een standaard eiwittest. Hier laten we een voorbeeld zien van eiwitschatting met behulp van Bradford Assay.

Neem 50 microgram eiwit in een microcentrifugebuisje en verminder de inhoud door TCEP toe te voegen, zodat de uiteindelijke concentratie 20 millimol is. Incubeer de inhoud een uur lang op 37 graden. Na incubatie alkyleren de verminderde eiwitten door iodoacetamide aan de buis toe te voegen, zodat de uiteindelijke concentratie 40 millimolar is.

Incubeer de tube in het donker gedurende 30 minuten. Voeg nu buffer B toe aan de buis met de gereduceerde en gekalkte eiwitten, zodat de uiteindelijke concentratie ureum minder dan één kies is. Voeg trypsine toe in 1 tot 30 enzym-eiwitverhouding en incubeer de buizen 's nachts op 37 graden met constant schudden.

Concentreer na de spijsvertering de verteerde peptiden in een vacuümconcentrator. Bij deze stap kunnen de peptiden worden gereconstitueerd en ontzout of opgeslagen op min 80 voor toekomstig gebruik. Ontsalting, of peptide clean-up, is essentieel voordat de monsters op een LC-MS MS worden geladen. Zouten en andere verontreinigingen in het monster kunnen de kolom verstoppen en de gevoeligheid van het instrument op de lange termijn beïnvloeden.

Dit proces kan worden uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgde C18 STAGE-tips of -kolommen. Hier hebben we de workflow voor peptide desalting weergegeven met behulp van een C18 STAGE-tip. Droog na het ontsalten de peptiden in een vacuümconcentrator.

Reconstituteer deze schone peptiden en ga verder met kwantificering met behulp van de Scopes-methode. Laad hiervoor twee microliters van het monster in een microdruppelplaat en bereken de concentratie zoals weergegeven in de dia. Het opstellen van een transitielijst is een cruciale stap in een SRM- of MRM-experiment.

Een overgangslijst bevat alle informatie die de massaspectrometer nodig heeft om de overgang te bewaken. Dit omvat de m-bij-z-waarden van de precursor- en productionen, botsingsenergie van de overgang, polariteit van het instrument en het tijdsbereik voor gegevensverzameling. Bereid de overgangslijst voor met Skyline.

Bereid een achtergrond proteome met behulp van Human Proteome Fasta bestand van UniProt en zorg ervoor dat het is geselecteerd onder het tabblad Achtergrond van Peptide-instellingen. Stel op het tabblad Filter een minimumlengte van 8 en een maximale lengte van 25 in. Blijf de standaardinstellingen gebruiken als er geen andere wijzigingen in de peptiden zijn.

Zodra de peptide-instellingen zijn gemaakt, klikt u op Overgangsinstellingen. Stel onder het tabblad Filter precursorladingen in als 2 en 3. Stel Ionenladingen in op 1 en stel Ion types in op y.

Productionen kunnen worden geselecteerd afhankelijk van de keuze van de gebruiker. Laat alle parameters als standaard. Voeg nu de toetredings-ID's van de geselecteerde doeleiwitten in.

Dit kan door op het tabblad Bewerken te klikken en vervolgens Invoegen te selecteren en ten slotte de toetredings-ID's te plakken. De ID's worden toegewezen aan de eiwitten in het achtergrond proteoom en een overgangslijst gemaakt op basis van de eerder ingestelde peptide- en overgangsinstellingen. Exporteer deze overgangslijst.

Zorg ervoor dat het juiste instrument is geselecteerd door op de vervolgkeuzelijst Van instrumenttype te klikken. In dit geval is het instrument Thermo Altis. Aangezien de ongedefinieerde overgangs lijst te veel overgangen heeft, moet u een limiet van slechts 350 overgangen per lijst behouden en exporteren als meerdere methoden.

Er wordt gebruik gemaakt van een binair oplosmiddelsysteem. Oplosmiddel A is 1%FA en Oplosmiddel B is 80%ACN. Houd het debiet op 450 microliter per minuut en het verloop zoals afgebeeld.

Stel de temperatuur van het kolomcompartiment in op 45 graden Celsius. Raadpleeg de tekst voor meer informatie over kolom- en LC-systeem. Zorg ervoor dat de MS-instellingen in uw TSQ Altis zijn zoals hier wordt weergegeven.

Importeer één overgangslijst om een nieuwe methode te maken. We raden aan om de resolutie voor quadrupole 1 en quadrupole 3 op 7 te houden. Deze kunnen indien nodig verder worden geoptimaliseerd.

Om consistentie in uitvoeringen en bijgevolg de gegevens kwaliteit te garanderen, bereidt u uw uitvoerings reeks voor zoals wordt weer gegeven. Begin met een paar spaties, verwijs naar de tekst voor de samenstelling van het blancomengsel, gevolgd door een QC standaardlicht BSA van bekende concentratie om elke variatie in de dagrespons van het instrument te controleren. De QC gedaan moet net voor de monsters.

Zet vervolgens alle monsters op een rij met losse flodders ertussen. Injecteer gelijke volumes van elk monster, goed voor 25 tot 1 nanogram peptiden per injectie. Als u een verfijnde methode wilt maken, voert u eerst de ongedefinieerde methoden uit op hele monsters.

Importeer resultaten in Skyline en controleer handmatig elk peptide. Selecteer voor elk peptide één precursor met consistent goede pieken in alle monsters. Verwijder precursoren en peptiden die geen goede pieken vertonen.

Zorg ervoor dat alle pieken goed zijn geannoteerd. Om de juiste piek te selecteren en de overgangen onder elke precursor verder te verfijnen, kan een bibliotheek worden gebruikt. Een bibliotheek is een set MS-MS spectrale gegevens die overeenkomen met peptiden en overgangen van de huidige experimentele gegevens.

Kies pieken met DART P-waarden dichter bij 1 en verwijder overgangen die niet overeenkomen met de bibliotheek. Een DART P-waarde geeft aan hoe goed de overeenkomst is tussen de experimentele piek en de bibliotheekpiek. Na een of twee optimalisatierondes is een verfijnde lijst klaar.

Deze verfijnde lijst kan worden uitgevoerd voor afzonderlijke voorbeelden. Importeer de verfijnde runs in Skyline en maak een goede aantekeningen van pieken. Gebruik het tabblad Annotatie onder Documentinstellingen om elk voorbeeld in het documentraster zorgvuldig te annoteren.

Gebruik de functie Groepsvergelijking om vergelijkingen te maken tussen voorwaarde 1 en voorwaarde 2 van uw experiment. Dit geeft tabel met aangepaste P-waarden en vouwwisselwaarden tussen de twee groepen. Voor zover wij weten, is dit de eerste studie die het gebruik van MRM gebruikt om peptiden te detecteren voor de eiwitten Apolipoproteïne A-1, Vimentin en Nicotinamide phosphoribosyltransferase in menselijke hersenweefselmonsters.

Het optimaliseren van verschillende parameters zoals LC-gradiënt, verblijftijd, cyclustijd en botsingsenergie kan het succes van een MRM-experiment sterk beïnvloeden. Wij geloven dat deze techniek kan worden gebruikt om patronen van biomarkers te ontwikkelen met het vermogen om onderscheid te maken tussen verschillende klinische aandoeningen en ziekten.