Name: Het voeden en kwantificeren van dierlijk bloed en kunstmatige maaltijden in Aedes aegypti-muggen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Leer een methode voor het voeden en kwantificeren van bloedmaaltijden bij Aedes aegypti-muggen met behulp van een kunstmatige membraanvoeder. Deze techniek maakt nauwkeurige meting van ingenomen maaltijdvolumes mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai en Trevor Sorrells voor opmerkingen over de manuscripten, en Zhongyan Gong en Kyrollos Barsoum voor technische hulp. We danken Alex Wild voor de foto's die in figuur 1 zijngebruikt. K.V. werd ondersteund door het Boehringer Ingelheim Fonds PhD fellowship. V.J. werd mede ondersteund door NIH T32-MH095246. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie aan de Rockefeller University van het Howard Hughes Medical Institute via het James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study-programma aan V.J. Dit materiaal is gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program onder Grant No. NSF DGE-1325261 naar V.J. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen in dit materiaal zijn die van de auteur(s) en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Science Foundation.

<ol><li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+distribution+and+burden+of+dengue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).</li>
<li>Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+distribution+of+yellow+fever+and+dengue%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The global distribution of yellow fever and dengue.</a> Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).</li>
<li>Chouin-Carneiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibilities+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+from+the+Americas+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).</li>
<li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+Zika+virus+infection%2C+Chiapas+State%2C+Mexico%2C+2015%2C+and+first+confirmed+transmission+by+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+the+Amercias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li>
<li>Weaver, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+history%2C+emergence%2C+biology%2C+and+prospects+for+control%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control.</a> Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).</li>
<li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+regulation+of+vitellogenesis+in+mosquitoes%3A+implications+for+anautogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).</li>
<li>Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+agonists+of+Ae.+aegypti+neuropeptide+Y+receptor+block+mosquito+biting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting.</a> Cell. 176 (4), 687-701 (2019).</li>
<li>Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acids+required+for+egg+production+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Entomologist%22%5BJournal%5D)">The amino acids required for egg production in Aedes aegypti.</a> The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).</li>
<li>Guerrero, D., Cantaert, T., Missé, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+mosquito+salivary+components+and+their+effect+on+the+immune+response+to+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).</li>
<li>Raquin, V., Lambrechts, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+virus+replicates+and+accumulates+in+Aedes+aegypti+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands.</a> Virology. 507, 75-81 (2017).</li>
<li>Farjana, T., Tuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+blood+feeding+and+host-seeking+behavior+in+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+%28diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).</li>
<li>Scott, T. W., Takken, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+strategies+of+anthropophilic+mosquitoes+result+in+increased+risk+of+pathogen+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission.</a> Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).</li>
<li>Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+membrane+feeding+compromise+the+quality+of+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes.</a> PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).</li>
<li>Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+Aedes+aegypti+mosquitoes+infected+with+wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).</li>
<li>Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+during+sequential+gonotrophic+cycles+in+large+and+small+female+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti.</a> Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).</li>
<li>McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+integration+of+carbon+dioxide+and+other+sensory+cues+drives+mosquito+attraction+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans.</a> Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).</li>
<li>Pakes, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPakes%2C+SP+%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , National Academic Press. Washington, DC, USA. (2011).</li>
<li>Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mosquito+feeding+system+for+routine+blood-feeding+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus.</a> Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).</li>
<li>Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+blood+sources+and+artificial+blood+feeding+methods+in+rearing+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+for+sterile+insect+technique+and+incompatible+insect+technique+approaches+in+Sri+Lanka%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka.</a> BioMed Research International. 2017, 3196924(2017).</li>
<li>Costa-da-Silva, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glytube%3A+a+conical+tube+and+parafilm+M-based+method+as+a+simplified+device+to+artificially+blood-feed+the+Dengue+vector+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> PLoS ONE. 8 (1), 53816(2013).</li>
<li>Carvalho, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+genetically+modified+Aedes+aegypti+for+field+releases+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil.</a> Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).</li>
<li>Kogan, P. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitute+blood+meal+for+investigating+and+maintaining+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).</li>
<li>Gonzales, K. K., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+diets+for+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Artificial diets for mosquitoes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), (2016).</li>
<li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142(2017).</li>
<li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+stimuli+and+artificial+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Feeding stimuli and artificial feeding.</a> Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).</li>
<li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+response+in+Aedes+aegypti%3A+stimulation+by+adenosine+triphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate.</a> Science. 142, 1674-1675 (1963).</li>
<li>Jové, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+Discrimination+of+Blood+and+Floral+Nectar+by+Aedes+aegypti+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Neuron. 108, 1-18 (2020).</li>
<li>Petersen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+age+of+first+blood+meal+and+Zika+virus+infection+on+Aedes+aegypti+egg+production+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity.</a> PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).</li>
<li>Sissoko, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+sugar+feeding+behavior+by+Aedes+aegypti+in+Bamako%2C+Mali+makes+them+ideal+candidates+for+control+with+Attractive+Toxic+Sugar+Baits+%28ATSB%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB).</a> PLoS ONE. 14 (6), 0214170(2019).</li>
<li>Houseman, J. G., Downe, A. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+measuring+blood+meal+size+and+proteinase+activity+for+determining+the+effects+of+mated+state+of+digestive+processes+of+female+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diperta%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Entomologist%22%5BJournal%5D)">Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae).</a> The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).</li>
<li>Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+estimating+blood+meal+volume+in+Aedes+aegypti+using+a+radioisotope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope.</a> Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).</li>
<li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+SkitoSnack%2C+an+artificial+blood+meal+replacement%2C+on+Aedes+aegypti+life+history+traits+and+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endogenous+regulation+of+mosquito+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior.</a> Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).</li>
<li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486(2013).</li>
<li>Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+of+the+response+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+uninfected+and+infected+with+Dengue+virus+to+Deet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet.</a> Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).</li>
<li>Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+mosquitoes+use+their+legs+to+sense+DEET+on+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact.</a> Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).</li>
<li>Harrington, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+feeding+patterns+of+the+Dengue+vector%2C+Aedes+aegypti%2C+on+individual+human+hosts+in+rural+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048(2014).</li>
<li>Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiteOscope%2C+an+open+platform+to+study+mosquito+biting+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior.</a> eLife. 9, 1-24 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor veel laboratoriumtoepassingen bieden kunstmatige membraanvoeders duidelijke voordelen in vergelijking met live hosts door onderzoekers de mogelijkheid te bieden om de inhoud van de maaltijd rechtstreeks te manipuleren. Hoewel er meerdere methoden beschikbaar zijn voor kunstmatige membraanvoeding, biedt de hier beschreven methode voordelen in flexibiliteit, kosten en doorvoer. In vergelijking met andere commerciële membraanvoeders vereist de Glytube-test een klein maaltijdvolume, waardoor het een efficiënt leveringsmechanisme is voor dure reagentia, waaronder geneesmiddelen of ziekteverwekkers, door het totale vereiste volume te minimaliseren7,35. Aangezien zowel de eiwitvrije zoutoplossing als kunstmatige bloedmaaltijden engorgement bevorderen, kunnen verbindingen of pathogenen aan beide maaltijden worden toegevoegd als een hoog doorvoereffect en niet-invasief alternatief voor injecties. Bovendien kan elk onderdeel van de Glytube gemakkelijk worden gewassen, vervangen of opgeschaald om meerdere meelsoorten te leveren en te kwantificeren zonder kruisbesmetting van het voedingsapparaat.
Om maaltijdvolumes die door muggen worden geconsumeerd te kwantificeren, maakt de op fluorescentie gebaseerde methode nauwkeurigere kwantificering van de meelgrootte mogelijk dan het wegen van de muggen voor en na het voeren. Opgemerkt moet worden dat deze methode een eindpunttest is. Met wegen kunnen de muggen daarentegen in leven worden gehouden voor verdere experimenten. Door een plaatlezer te gebruiken, kan de op fluorescentie gebaseerde methode eenvoudig worden opgeschaald voor kwantificering met hoge doorvoer van maaltijden die door honderden individuele vrouwen worden geconsumeerd.
Om hoge voedingssnelheden te bereiken, moet een combinatie van voldoende gastheersignalen aanwezig zijn om vrouwelijk gastheerzoekend gedrag te activeren en vrouwtjes naar de feeder te trekken. Als muggen zich niet onder de Glytube verdringen, kan de maaltijd niet goed worden opgewarmd of is de CO2-levering mogelijk niet voldoende. Toevoeging van menselijke geur aan het membraanoppervlak verhoogt op betrouwbare wijze de aantrekkelijkheid van het kunstmatige membraan. Als muggen onder de Glytube worden waargenomen, maar zich niet voeden, kan de samenstelling van de maaltijd fout zijn. Vrouwtjes mogen zich niet voeden als de maaltijd zelf niet warm is, het bloed te oud is of als de additieven aan de maaltijd intrinsiek aversief zijn of een ongewenste chemische reactie veroorzaken36. Extra ATP verhoogt ook op betrouwbare wijze de voedingssnelheden en kan worden opgeschaald naar een uiteindelijke concentratie van 2 mM in elk van de verstrekte recepten. Vrouwtjes mogen zich niet voeden als de parafilm niet strak over de Glytube-dop wordt getrokken; de parafilm moet uniform transparant zijn en mag geen gesp maken, omdat dit voorkomt dat het vrouwtje de parafilm effectief kan doorboren met haar stylet. Als de maaltijd door de Glytube op het gaas lekt, kan de parafilm tijdens het uitrekken gescheurd zijn en vervangen worden.
Het veranderen van de maaltijdsamenstelling kan onderzoekers ook in staat stellen om de tijd te manipuleren die nodig is om de maaltijd uit de mug te wissen, evenals het daaropvolgende gastheerzoekende gedrag. De hier gepresenteerde maaltijden vereisen 24-36 uur voor de spijsvertering7 vergelijkbaar met dierlijk bloed. Na het voeden met een van deze maaltijden, zullen vrouwtjes het zoeken naar gastheer onderdrukken tijdens het verteringstijdvenster. Omdat de zoutoplossing geen eiwit heeft, keren vrouwtjes terug naar gastheerzoekend nadat de maaltijd is geklaard. Als een snellere terugkeer wenselijk is, kunnen onderzoekers alternatieve "quick clearing" zoutoplossingmaaltijden kiezen die in ongeveer 6 uur27worden uitgescheiden. Hoewel de samenstelling van het hier gepresenteerde zoutmeel is afgestemd om de resultaten rechtstreeks te vergelijken met het kunstmatige bloedmeel, komt de "quick clearing"-maaltijd beter overeen met fysiologische zoutniveaus in gewerveld bloed.
De hier beschreven methoden hebben beperkingen die moeten worden overwogen voordat de test wordt geselecteerd die het meest geschikt is voor de experimentele doelen van de onderzoeker. De beschreven fluoresceïnemetingen laten niet toe dat muggen opnieuw worden gebruikt voor extra experimenten. Gewichtsmetingen kunnen echter worden uitgevoerd voorafgaand aan de kwantificering van de meelgrootte met behulp van de fluoresceïnetest. Als gewicht en maaltijdgrootte consistent zijn in meerdere proeven voor een bepaalde maaltijd, kan gewicht worden gebruikt als proxy in toekomstige experimenten. Bovendien maakt dit protocol geen onderscheid tussen tekorten in gastheerzoekend versus bloedvoedgedrag; muggen die beperkingen vertonen bij het vinden van de membraanvoeder zullen een vermindering van de voedersnelheden en / of maaltijdgrootte hebben. Door een camera toe te voegen om gedrag tijdens de test vast te leggen, kunnen onderzoekers bepalen of de vrouwtjes de Glytube niet kunnen vinden, of dat ze de Glytube vinden, maar niet voeden.
De hier beschreven test kan worden aangepast om veel openstaande vragen met betrekking tot voedingsgedrag bij muggen te verkennen. De bijdrage van specifieke bloedeiwitten kan bijvoorbeeld worden onderzocht door de verhouding van samenstellende eiwitten of de totale eiwitconcentratie in het kunstmatige bloedmeel te wijzigen. Om maaltijdgroottes te evalueren van meerdere voedingsgebeurtenissen, kunnen kleurstoffen met verschillende fluorescentiespectra worden toegevoegd om maaltijden te onderscheiden van unieke bronnen37. Dit protocol kan ook worden aangepast om de interne monddelen die bloed detecteren afzonderlijk te stimuleren en die worden gebruikt voor inname (d.w.z. stylet), en de chemosensorische aanhangsels die contact maken met de huid (d.w.z. labium, benen) als de mug landt om te beginnen met bloedvoeding36. Als liganden bijvoorbeeld rechtstreeks aan de maaltijd worden toegevoegd, komen ze niet in contact met het labium en de benen, omdat het membraan alleen doorboord wordt door de stylet. Als in plaats daarvan liganden aan het buitenoppervlak van de parafilm worden toegevoegd, blijven ze gescheiden van de maaltijd en kunnen ze worden gecontacteerd door het labium en de benen36. Ten slotte worden de gedetailleerde kinetiek van bloedvoedgedrag niet goed begrepen en kan de hier gepresenteerde methode worden gewijzigd om tracking met hoge resolutie te combineren met machine learning-tools om gedragsuitlezingen van voortbeweging, houding en voedingsdynamiek te extraheren38.
Dit protocol is gericht op gebruiksvriendelijk en kosteneffectief zijn, met de mogelijkheid om onderzoekers te dienen die farmacologische en genetische manipulaties gebruiken om muggenbloedvoeding en post-bloedvoedingsgedrag te bestuderen.

We presenteren een protocol voor het voeren van gemodificeerde bloedmaaltijden aan Aedes aegypti-muggen met behulp van een kunstmatige membraanvoeder en het nauwkeurig meten van het maaltijdvolume dat door elke individuele mug wordt geconsumeerd. Dit protocol kan flexibel worden aangepast om de inhoud van de maaltijd te wijzigen of om het maaltijdvolume te vergelijken dat door verschillende experimentele groepen muggen wordt geconsumeerd.
De Ae. aegypti mug bedreigt de wereldwijde gezondheid door het verspreiden van ziekteverwekkers die ziekten veroorzaken, waaronder gele koorts, knokkelkoorts, chikungunya en Zika1,2,3,4,5. Ae. aegypti-vrouwtjes zijn obligate bloedvoeders; zij moeten gewerveld bloed consumeren om het nodige eiwit voor de ontwikkeling van eieren te verkrijgen, en elke koppeling van eieren vereist een volledige bloedmaaltijd van ten minste één gastheer6,7,8. De vrouwelijke mug bijt eerst haar gastheer door de huid te doorboren met haar stylet en speeksel te injecteren, dat verbindingen bevat die de immuunrespons van de gastheer activeren9. Ze voedt zich dan door bloed door haar stylet in haar middenrif te pompen. Tijdens het consumeren van een bloedmaaltijd van een geïnfecteerde gastheer, kan ze door bloed overgedragen ziekteverwekkers6,8innemen, die vervolgens migreren van de muggenmuggen naar haar speekselklieren10. Vrouwelijke muggen die op deze manier zijngeïnfecteerd,kunnen ziekte verspreiden door ziekteverwekkers samen met speeksel te injecteren bij het bijten van volgende gastheren11,12. Het begrijpen en kwantificeren van de mechanismen van bloedvoedgedrag zijn cruciale stappen in het beheersen van de overdracht van door muggen overgedragen ziekten.
Veel laboratoriumprotocollen voor het fokken en experimenteren van muggen gebruiken levende dieren, waaronder muizen, cavia's of mensen als bloedbron13,14,15,16. Het gebruik van levende dieren legt ethische zorgen op, evenals complexe vereisten voor personeelstraining, dierenhuisvesting en -verzorging, en naleving van het beleid van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Het beperkt ook de soorten verbindingen die aan muggen kunnen worden geleverd, wat de studies beperkt die kunnen worden uitgevoerd17.
Kunstmatige bloedvoedapparatuur, die meestal een membraansysteem gebruikt om de gastheerhuid te simuleren, zijn nuttige hulpmiddelen voor het bestuderen van bloedvoedgedrag dat de noodzaak van het onderhoud van levende gastheren omzeilt. Volbloed kan bij een aantal leveranciers worden gekocht en aan muggen worden gevoerd met behulp van verwarmde kunstmatige membraanvoeders met watermantel of soortgelijke apparaten18,19. In dit protocol demonstreren we het gebruik van kleine, wegwerpmembraanvoeders die "Glytubes" worden genoemd. Deze membraanvoeder, eerder gepubliceerd door Costa-da-Silva et al. (2013)20, kan eenvoudig worden samengesteld uit standaard laboratoriumapparatuur, waardoor het ideaal is voor het leveren van bloedmaaltijden aan matige aantallen muggen en eenvoudig op te schalen voor het testen van grotere groepen of meerdere maaltijdformuleringen. De Glytube is een goedkoop en efficiënt alternatief voor andere commerciële kunstmatige feeders, die grotere maaltijdvolumes kunnen vereisen en meer geschikt zijn voor het batchvoeding van grote groepen muggen op een enkele maaltijdformulering21.
Dit protocol omvat twee secties: het bereiden/leveren van kunstmatige maaltijden en het kwantificeren van consumptie. In het eerste deel worden Glytubes gebruikt als een efficiënt middel om gemanipuleerde diëten te leveren. Volbloed kan worden vervangen door een volledig kunstmatige maaltijd om de effecten van bloedvervangers in plaats van een bloedmaaltijd te vergelijken. Een recept aangepast van Kogan (1990)22 wordt hier gepresenteerd, hoewel meerdere kunstmatige maaltijdformuleringen zijn ontwikkeld23,24. Bovendien is voeding een minder invasieve en minder bewerkelijke methode om farmacologische verbindingen in te voeren dan injectie. Vanwege het lage totale volume dat nodig is voor elke maaltijd (1-2 ml), biedt dit protocol een aantrekkelijke leveringsmethode om de hoeveelheden dure reagentia te verminderen. Ae. aegypti-vrouwtjes consumeren gemakkelijk eiwitvrije maaltijden van zoutoplossing met adenosine 5′-trifosfaat (ATP)25,26,wat een basislijn biedt voor het meten van de effecten van enkelvoudige maaltijdcomponenten. Bijvoorbeeld, Neuropeptide Y-achtige receptor 7 (NPYLR7) in Ae. aegypti is bekend om te bemiddelen gastheer-zoekende onderdrukking na een eiwitrijke bloedmaaltijd, en wanneer NPYLR7 agonisten worden toegevoegd aan een eiwitvrije zoutoplossing maaltijd, vrouwelijke muggen vertonen gastheer-zoekende onderdrukking vergelijkbaar met degenen die volbloed hebben geconsumeerd7.
In het tweede deel worden stappen gepresenteerd voor het kwantificeren van het volume van elke maaltijd die door een individuele vrouwelijke mug wordt geconsumeerd. Deze test is gebaseerd op fluorescentie en vangt de voedingsstatus in een hogere resolutie dan methoden waarbij vrouwtjes worden geclassificeerd als "gevoed" of "ongefed" op basis van visuele beoordeling van alleen opgezette buik. Door fluoresceïne aan de maaltijd toe te voegen voorafgaand aan de voeding, kunnen maaltijdvolumes die door individuen worden ingenomen, worden gekwantificeerd door elke mug in een plaat van 96 putten te homogeniseren en fluorescentie-intensiteit als uitlezing te meten. Deze test kan verschillen in voedingskracht meten als reactie op variabelen zoals de samenstelling van de maaltijd of de genetische achtergrond van de muggen. Nauwkeurige kwantificering is van cruciaal belang voor tussenliggende maaltijdmaten, bijvoorbeeld wanneer vrouwen suboptimale maaltijden worden aangeboden die voedings afschrikmiddelen bevatten of wanneer ze sacharosemaaltijden van variabele grootte27consumeren. Als gevoede muggen nodig zijn voor latere gedragstests na kwantificering van de maaltijdgrootte, kan de grootte van de maaltijd in plaats daarvan worden berekend door verdoofde vrouwtjes in groepen te wegen en de gemiddelde verhoogde massa per persoon te schatten. Hoewel minder nauwkeurig dan fluoresceïnemarkering, biedt wegen nog steeds een geaggregeerde schatting van het maaltijdvolume en maakt het mogelijk om het effect van de maaltijd op downstreamprocessen, zoals vruchtbaarheid of daaropvolgende gastheeraantrekkelijkheid, te onderzoeken. Hoewel de grootte van bloedmeel variabel is en kan worden beïnvloed door een groot aantalfactoren 11,28,29, zijn ingenomen meelgrootten, gemeten met de hier beschreven methoden , consistent met eerdere kwantificeringen7,30,31.

<table><tbody><tr><td>15 mL conische buizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>3 mm diameter borosilicaat solid-glass kralen</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z143928</td><td>Voor gebruik voor kralenmolen homogenisator; niet vereist als gebruik wordt gemaakt van een pellet pestle grinder</td></tr><tr><td>32 oz. hoge dichtheid polyethyleen (HDPE) plastic beker</td><td>VWR</td><td>89009-668</td><td>Voorbeeld muggen container gebruikt voor voedingstests getoond; alternatieve opties kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>50 mL conische buizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>96-well zwarte polystyreen plaat</td><td>ThermoFisher</td><td>12-566-09</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plaat verzegelingsfolie</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Alternatieve opties kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>96-well PCR platen</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9621</td><td>Alternatieve opties kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Adenosine 5'-trifosfaat (ATP) dinatriumzout hydraat</td><td>MilliporeSigma</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Albumine (menselijke serum)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A9511</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213</td><td>Alternatieve opties kunnen worden gebruikt om licht binnen te komen in de fluoresceïne container</td></tr><tr><td>Balans</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-911</td><td>Alternatieve opties kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Kralenmolen homogenisator</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>Niet vereist als gebruik wordt gemaakt van een pellet pestle grinder</td></tr><tr><td>Katoenen bal</td><td>Fisher Scientific</td><td>22456880</td><td>Voor nectar-voeding; alternatieve opties kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Defibrineerde schapenbloed</td><td>Hemostat Laboratories</td><td>DSB100</td><td>Alternatieve opties kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Drosophila CO2 vlieg pad</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td>Alternatieve opties kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Fluoresceïne</td><td>MilliporeSigma</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie plate-reader</td><td>ThermoFisher</td><td>VL0000D0</td><td>Alternatieve opties kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Gamma-globuline (menselijk bloed)</td><td>MilliporeSigma</td><td>H7379</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Hemoglobine (menselijke)</td><td>MilliporeSigma</td><td>G4386</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoriumwikkelfolie - parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374</td><td></td></tr><tr><td>Magneetstoker</td><td>Fisher Scientific</td><td>90-691</td><td>Alternatieve magnetische roerders kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Microcentrifuge voor 96-well plaat</td><td>VWR</td><td>80094-180</td><td>Alternatieve opties kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen</td><td>MilliporeSigma</td><td>2236412</td><td>Alternatieve opties kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Pellet pestle grinder</td><td>VWR</td><td>KT749521-1500</td><td>Niet vereist als gebruik wordt gemaakt van een kralenmolen homogenisator</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde oplossing (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-516F</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>Scheermessen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>Alternatieve opties kunnen worden gebruikt, zoals een draaibank voor een betere consistentie van het snijden</td></tr><tr><td>Elastieke banden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siliconen buis</td><td>McMaster Carr</td><td></td><td>Nodig als er een vliegpad voor CO2 levering wordt gebruikt</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>MilliporeSigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Roerstaven</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512</td><td>Alternatieve magnetische roerstaven kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Doorschijnende polypropyleen opbergdoos met afneembaar deksel</td><td></td><td></td><td>Voorbeeld doos gebruikt voor voedingstests getoond</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td></td><td></td><td>Alternatieve verwarmingsapparaat kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Witte 0,8 mm polyester muggennet</td><td>American Home & Habit Inc.</td><td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td><td>Alternatieve opties kunnen worden gebruikt</td></tr></tbody></table>

het voeden en kwantificeren van dierlijk bloed en kunstmatige maaltijden in aedes aegypti-muggen

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Vrouwtjes van bepaalde muggensoorten kunnen ziekten verspreiden terwijl ze gewervelde gastheren bijten om eiwitrijke bloedmaaltijden te verkrijgen die nodig zijn voor de ontwikkeling van eieren. In het laboratorium kunnen onderzoekers dierlijke en kunstmatige bloedmaaltijden leveren aan muggen via membraanvoeders, die manipulatie van de mesamenstelling mogelijk maken. Hier presenteren we methoden voor het voeden van bloed en kunstmatige bloedmaaltijden aan Aedes aegypti-muggen en het kwantificeren van het volume dat door individuele vrouwtjes wordt geconsumeerd.
Gerichte voeding en kwantificering van kunstmatige/bloedmaaltijden hebben brede toepassingen, waaronder het testen van de effecten van maaltijdcomponenten op muggengedrag en fysiologie, het leveren van farmacologische verbindingen zonder injectie en het infecteren van muggen met specifieke pathogenen. Het toevoegen van fluoresceïnekleurstof aan de maaltijd voorafgaand aan de voeding maakt verdere kwantificering van de maaltijdgrootte mogelijk. Het maaltijdvolume dat door muggen wordt geconsumeerd, kan worden gemeten op gewicht, als de vrouwtjes later moeten worden gebruikt voor gedragsexperimenten, of door individuele vrouwtjes in platen van 96 putten te homogeniseren en fluorescentieniveaus te meten met behulp van een plaatlezer als eindpunttest. Maaltijdgroottekwantificering kan worden gebruikt om te bepalen of het veranderen van de maaltijdcomponenten het ingenomen maaltijdvolume verandert of dat de maaltijdconsumptie verschilt tussen muggenstammen. Nauwkeurige kwantificering van de meelgrootte is ook van cruciaal belang voor downstreamtests, zoals die welke effecten op de aantrekkingskracht of vruchtbaarheid van de gastheer meten. De hier gepresenteerde methoden kunnen verder worden aangepast om de maaltijdvertering in de loop van dagen te volgen of om meerdere onderscheidende markers op te nemen die aan verschillende maaltijden (zoals nectar en bloed) zijn toegevoegd om de consumptie van elke maaltijd door één mug te kwantificeren.
Deze methoden stellen onderzoekers in staat om eigenhandig metingen met hoge doorvoer uit te voeren om het maaltijdvolume te vergelijken dat door honderden individuele muggen wordt geconsumeerd. Deze tools zullen daarom in grote lijnen nuttig zijn voor de gemeenschap van muggenonderzoekers voor het beantwoorden van uiteenlopende biologische vragen.

Figuur 1 bevat een schema voor het monteren van de Glytube, terwijl figuur 2 een overzicht geeft van het experimentele ontwerp om de grootte van de maaltijd te meten met behulp van de hier beschreven op fluorescentie gebaseerde test. Figuur 3 geeft representatieve fluoresceïnemeelgroottemetingen van een bloedvoedexperiment. Figuur 4, figuur 5en figuur 6 illustreren een bemonstering van biologische vragen die met dit protocol kunnen worden aangepakt. Toepassingen van het protocol zijn breed en omvatten het veranderen van de samenstelling van bloedmeel, het voeden van farmacologische verbindingen, het nauwkeurig kwantificeren van suboptimale bloedmaaltijden of kleinere nectarmaaltijden en het vergelijken van voedingsgedrag tussen muggengenotypen.
Om een standaardcurve voor maaltijdvolumeberekeningen te genereren, worden fluorescentiemetingen uitgezet uit de aangewezen referentieputten die elk een niet-gefeerde mug en een bekend volume van de maaltijd met 0,002% fluoresceïne bevatten (figuur 3A). Fluorescentiemetingen van de resterende putten, die muggen bevatten van de negatieve controlegroep van niet-gefeerde muggen of de experimentele groep muggen die een maaltijd worden aangeboden, worden vergeleken met deze standaardcurve om het maaltijdvolume (μL) dat door elke mug wordt geconsumeerd te kwantificeren (figuur 3B). Om de basismetingen in deze test te valideren, moet worden bevestigd dat muggen uit de niet-gefed negatieve controlegroep geen positieve waarde van verbruikte μL krijgen toegewezen (figuur 3B, links). Hoewel alle vrouwtjes in de experimentele groep de bloedmaaltijd kregen aangeboden, voedden sommige muggen (figuur 3B, midden) en sommige niet (figuur 3B, rechts). Dit resultaat toont aan dat uit dit protocol twee soorten gegevens kunnen worden verkregen: 1) het percentage totale vrouwtjes dat zich voedt met een bepaalde maaltijd, en 2) het volume dat wordt ingenomen door de vrouwtjes die zich voeden met een bepaalde maaltijd.
Dit protocol kan worden gebruikt om maaltijden met verschillende eiwitsamenstellingen te leveren en te kwantificeren. Figuur 4A,B toont gegevens verzameld met behulp van maaltijden met toegevoegde fluoresceïne. Het aandeel muggen dat voedde en het maaltijdvolume dat ze innamen, werden berekend op basis van de fluorescentiemetingen. Deze metingen zijn zeer gevoelig en maken een nauwkeurige kwantificering van μL mogelijk, maar hebben de beperking dat muggen niet kunnen worden gebruikt voor toekomstige live experimenten. Figuur 4C,D toont gegevens verzameld van een onafhankelijk experiment met muggen die werden gescoord als gevoed of niet gefed door het oog nadat ze maaltijden zonder fluoresceïne kregen aangeboden. De grootte van de maaltijd werd berekend als gemiddeld gewicht / vrouwtje uit groepen van 5 muggen. Hoewel deze gewichtsmetingen minder gevoelig zijn dan fluorescentiemetingen, maken ze het mogelijk om de vrouwtjes te herstellen en te gebruiken voor verdere live experimenten. Het aandeel muggen dat voedt, kan variëren over verschillende experimentele dagen, zoals weerspiegeld in figuur 4A en figuur 4C.
Figuur 5 toont het volume dat wordt geconsumeerd van maaltijden die medicijnen bevatten die het zoeken naar muggenhosts reguleren. In deze experimenten kregen vrouwtjes bloed, zoutoplossing + ATP of zoutoplossing + ATP-maaltijden aangeboden met 100 μM van de menselijke NPY Y2-receptoragonist, TM30338. Dit medicijn verandert gastheerzoekend gedrag door activering van Ae. aegypti NPY-achtige receptor 7. Het meten van meelgrootten is van cruciaal belang voor de interpretatie van experimenten om het effect van dit medicijn op post-bloedvoedingsgedrag te beoordelen, omdat het de onderzoeker in staat stelt om de dosis te berekenen die door elke vrouw wordt geconsumeerd.
In de vorige voorbeelden kregen vrouwen bloed of vervangende bloedmaaltijden, die allemaal resulteerden in 3-5 μL-maaltijden (figuur 3, figuur 4, figuur 5). Deze op fluorescentie gebaseerde test kan ook worden gebruikt om kleinere en/of meer variabele meelgroottes te meten die niet nauwkeurig kunnen worden onderscheiden van gemiddelde groepsgewichtmetingen. In figuur 6werd hetzelfde fluorescentiekwantificeringsprotocol gebruikt om nectarvoedingsgedrag te meten door de Glytube in te ruilen voor een katoenen bal verzadigd met 10% sacharose die 0,002% fluoresceïne bevat. Nectarsuikers kunnen niet worden gepresenteerd in de Glytube-test omdat vrouwtjes de aanwezigheid van nectarsuikers met de stylet niet kunnen detecteren en geen voeding initiëren27. Deze gegevens stellen de onderzoeker in staat om vast te stellen dat suikermaaltijden consistent kleiner zijn dan bloedmaaltijden, in overeenstemming met eerder werk34 (figuur 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> Figuur 1: Opstelling van de Glytube-methode die wordt gebruikt om maaltijden aan muggen te voeren. (A) Schematisch van een gedeconstrueerde Glytube die wordt gebruikt om bloed en andere maaltijden aan muggen te voeren. (B) Schema van een Glytube gepresenteerd bovenop een container met muggen met een gaasdeksel. Vrouwelijke muggen kunnen door het gaasdeksel prikken om te voeden. (C) Foto's van de Glytube (boven) en vrouwelijke Aedes aegypti-muggen voor, tijdens en na het voeren (onder, van links naar rechts) op een door Glytube geleverde maaltijd. Muggen worden getoond piercing door het gaas dat hun container bedekt om toegang te krijgen tot de membraanvoeder. (D) Foto's die het uiterlijk laten zien van vrouwelijke Ae. aegypti-muggen die niet zijn gefed (links) en die zijn ingekapseld op een kunstmatige bloedmaaltijd (rechts, boven) of een zoutoplossing + ATP-maaltijd (rechts, onder). De Glytube-methode werd eerder gepubliceerd in Costa-da-Silva et al. (2013)20. Foto's in (C) en (D) zijn met dank aan Alex Wild. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> Figuur 2: Schematisch van hoe de grootte van de maaltijd te kwantificeren na het Glytube-bloedvoedingsprotocol. (A) Muggen worden een maaltijd aangeboden met fluoresceïne (boven, experimentele groep) of geen maaltijd (bodem, niet-gefed negatieve controlegroep). (B) Individuele muggen worden toegevoegd aan een plaat van 96 putten na beëindiging van het voedingsexperiment. (C) Standaardcurve wordt gegenereerd met behulp van bekende hoeveelheden meel die 0,002% fluoresceïne bevatten. (D) Muggen worden gehomogeniseerd om verbruikt fluoresceïne vrij te geven, en fluorescentieniveaus in elke put worden gekwantificeerd met behulp van een plaatlezer. Deze fluorescentiekwantificeringsmethode is gewijzigd van Liesch et al. (2013)34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> Figuur 3: Glytube-bloedvoedexperiment met op fluoresceïne gebaseerde kwantificering. (A) Standaardcurvemetingen verkregen uit de putten waar een mug uit de niet-gefeerde controlegroep werd toegevoegd aan een bekende hoeveelheid meel die 0,002% fluoresceïne bevat (y-asschaal = willekeurige eenheden). (B) Maaltijdvolume berekend aan de hand van fluorescentiemetingen voor vrouwtjes in de niet-gefeerde controlegroep (links, zwart, n = 40), de experimentele groep die zich voedde met bloed (midden, rood, n = 37) en de experimentele groep die zich niet voedde met bloed (rechts, rood, n = 23). Elk punt vertegenwoordigt een meting van een individuele vrouw. Gegevens worden weergegeven als mediaan met bereik. Letters geven statistisch verschillende groepen aan, Kruskal-Wallis test met Dunn's meervoudige vergelijking, p<0.01. Deze gegevens zijn gepubliceerd in Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> Figuur 4: Kwantificering van maaltijden met verschillende eiwitsamenstelling. Vrouwtjes kregen maaltijden aangeboden van schapenbloed (rood), kunstmatig bloed met menselijke bloedeiwitten (Kogan (1990)22) (oranje), of eiwitvrije zoutoplossing + ATP-maaltijd (aqua)7. (A) Percentage gevoerde vrouwtjes scoorde met fluorescentiemetingen. Elk punt vertegenwoordigt een groep van 12-16 vrouwen. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken, n = 12. (B) Maaltijdvolume berekend aan de hand van fluorescentiemetingen. Elk punt vertegenwoordigt een meting van een individuele vrouw in een enkele studie uit figuur 4A. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken, n = 12. (C) Percentage vrouwtjes volledig engorged na kunstmatige membraanvoeding, gescoord door het oog. Elk punt vertegenwoordigt het percentage vrouwen dat is ingesnijd uit groepen van 20-30 vrouwen. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken, n = 23. (D) Maaltijdmaten gescoord als gewicht/vrouw na voedingsstatus werd gescoord door het oog. Gewichten werden berekend als het gemiddelde van groepen van 5 muggen. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken, n = 23. A–D: Letters geven statistisch verschillende groepen aan, Kruskal-Wallis test met Dunn's meervoudige vergelijking, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> Figuur 5: Kwantificering van maaltijden met farmacologische verbindingen. Vrouwtjes consumeren maaltijden van dezelfde grootte schapenbloed (rood), zoutoplossing + ATP (aqua) en zoutoplossing + ATP + 100 μM dosis humaan NPY Y2-receptoragonist TM30338 (donkerblauw). Maaltijdvolume berekend aan de hand van fluorescentiemetingen. Elk punt vertegenwoordigt een meting van een individuele vrouw. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken, n = 12. Letters geven statistisch verschillende groepen aan, Kruskal-Wallis test met Dunn's meervoudige vergelijking, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> Figuur 6: Kwantificering van kleinere nectarmaaltijden. (A) Schematische nectarvoedingstest. (B) Het meelvolume berekend aan de hand van fluorescentiemetingen voor wilde vrouwtjes bood maaltijden aan van water (blauw, n = 36) of 10% sacharose (groen, n = 53), elk met 0,002% fluoresceïne, in de nectarvoedingstest. Elk punt vertegenwoordigt een meting van een individuele vrouw. Gegevens worden weergegeven als medianen met bereiken. Letters geven statistisch verschillende groepen aan, Mann-Whitney test, p<0.05. Deze gegevens zijn gepubliceerd in Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Kunstmatige bloedmaaltijd</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentratie van de voorraadoplossing (mg/ml)</td>
			<td>Volume van de voorraadoplossing in meel (μL/ml)</td>
			<td>Uiteindelijke maaltijdconcentratie (mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Eiwitcomponenten*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ-Globulinen</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemoglobine</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albumine</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal eiwit</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Niet-eiwitcomponenten</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentratie van voorraadoplossing (mM)</td>
			<td>Volume van de voorraadoplossing in meel (μL/ml)</td>
			<td>Uiteindelijke maaltijdconcentratie (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>In γ-globuline voorraad</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO
</td>
			<td>In γ-globuline voorraad</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Water</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*Eiwitcomponenten worden bereid in voorraadoplossing van dubbel gedestilleerd water, met uitzondering van γ-Globulinen, die zijn opgelost in 400 mM NaHCO3 en een variabele hoeveelheid NaCl bevatten (2-4%) in het product.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Recept voor het bereiden van kunstmatige bloedmaaltijden (aangepast aan Kogan (1990)22). Kunstmatig bloed bestaat uit eiwit- en niet-eiwitcomponenten die regelmatig in menselijk bloed worden aangetroffen en biedt de mogelijkheid om de verhoudingen van deze componenten te variëren. Muggen kunnen eieren produceren na het voeden met kunstmatig bloed7,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Zoute maaltijd</td>
		</tr>
<tr>
<td>Component</td>
			<td>Concentratie van voorraadoplossing (mM)</td>
			<td>Volume van de voorraadoplossing in meel (μL/ml)</td>
			<td>Uiteindelijke maaltijdconcentratie (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Water</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Recept voor zoute maaltijd met ATP (aangepast van Duvall et al. (2019)7). Eiwitvrije zoutoplossingsmaaltijden kunnen worden gebruikt om verbindingen te leveren die van belang zijn voor muggen, terwijl ze nog steeds de opgezette buik nabootsen die optreedt na bloedvoeding, maar zonder de eiontwikkeling te activeren die optreedt wanneer eiwitten worden ingenomen.

Het doel van dit protocol is om dierlijke en kunstmatige bloedmaaltijden aan Aedes aegypti-muggen te leveren via een kunstmatige membraanvoeder en het volume van de ingenomen maaltijd nauwkeurig te kwantificeren.

Het voeden en kwantificeren van dierlijk bloed en kunstmatige maaltijden in Aedes aegypti-muggen

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Deze techniek stelt onderzoekers in staat om voeding aan te bieden en zelfstandig hoogwaardige metingen uit te voeren om maaltijdvolumes te vergelijken die door honderden individuele muggen zijn geconsumeerd. Het kan aanpassen aan het veranderen van de inhoud van de maaltijd, of om het volume te vergelijken dat door verschillende experimentele groepen is geconsumeerd. Dit protocol is bedoeld om gebruiksvriendelijk en goedkoop te zijn.Voor farmacologische en genetische manipulaties, om het bloedvoedingsgedrag van muggen en het gedrag na voeding te bestuderen. Organisatie is cruciaal voor dit protocol. Bereid de opstelling en reagentia van tevoren voor, zodat u de maaltijden snel aan de muggen kunt leveren.Om te beginnen, breng 1,98 tot twee milliliter gedefibrineerde schapenbloed over in een conische buis van 15 milliliter. Als u fluorescentiegebaseerde kwantificering van de maaltijdgrootte wilt uitvoeren, voegt u fluoresceïne-oplossing toe tot een eindconcentratie van 0,002%, waardoor het bloedvolume met dezelfde hoeveelheid wordt verminderd als de toegevoegde fluoresceïne. Bewaar een milliliter van de uiteindelijke maaltijdformulering om de referentie-standaardcurve te genereren.Alle maaltijden en oplossingen die fluoresceïne bevatten, moeten worden verpakt in aluminiumfolie of in het donker worden bewaard. Om eiwitvrije zoutoplossingsmaaltijden te bereiden, combineer 600 microliters van 400 millimolair natriumbicarbonaat met 1,39 milliliter dubbel gedistilleerd water in een conische buis van 15 milliliter. Als fluorescentiegebaseerde kwantificering van de maaltijdgrootte vervolgens moet worden uitgevoerd, voegt u fluoresceïne-oplossing toe tot een eindconcentratie van 0,002%. Verminder het watervolume met dezelfde hoeveelheid als de toegevoegde fluoresceïne.Bewaar minimaal een milliliter van de uiteindelijke maaltijdformulering die 0,002% fluoresceïne bevat om de referentie-standaardcurve te genereren. Zet de bereide maaltijden opzij totdat u klaar bent om ze te leveren. Alle maaltijden en oplossingen die fluoresceïne bevatten, moeten worden verpakt in aluminiumfolie of in het donker worden bewaard.Plaats de experimentele groep vrouwelijke muggen in een container en bedek ze met gaas. Laat deze vrouwtjes acclimatiseren in de voedingskamer. Zet een controlegroep ongevoerde muggen opzij die geen maaltijd zullen krijgen aangeboden.Om een GLI-buis te construeren, vul een conische buis van 50 milliliter met 40 milliliter 100% glycerol. Sluit de open conische buis af met twee stukken parafilm om de kans op lekkage te minimaliseren. Optioneel kunt u de parafilm op zijn plaats houden met behulp van elastiekjes.Keer de buis om om er zeker van te zijn dat er geen gaten of openingen zijn. Om het maaltijddistributienetwerk te maken, snijdt u een gecentreerd gat van 2,5 centimeter in de schroefdop van de conische buis met behulp van een scherp mes of een lave. Rek een stuk parafilm gelijkmatig uit zodat het ongeveer verdubbelt in grootte.De parafilm moet dun genoeg zijn zodat muggen er gemakkelijk doorheen kunnen, maar er mogen geen lekken zijn. Verzegeld de buitenoppervlakte van de schroefdop met de parafilm om het gat volledig te bedekken, en leg de dop opzij. Verwarm zowel de verzegeld buis met glycerol als de bloed- en zoutoplossingsmaaltijden en een waterbad van 42 tot 45 graden Celsius gedurende ten minste 15 minuten.Voeg ATP toe aan de verwarmde maaltijd en vortex grondig. Pipetteer twee milliliter van de verwarmde maaltijd in de binnenkamer van de schroefdop en plaats de omgekeerde verwarmde glycerolgevulde conische buis er voorzichtig op. Schroef de dop met de maaltijd gedeeltelijk op de glycerolgevulde buis, net genoeg om lekkage van de maaltijd of het glycerol te voorkomen.Plaats de geassembleerde gly-buis op de mugcontainer, breng koolstofdioxide aan en laat de muggen minimaal 15 minuten toegang tot voeding om maximale voedingssnelheden te bereiken. Na het voeren kan de GLI-buisdop worden weggegooid als biogevaarlijk afval of opnieuw worden gebruikt na weken in een oplossing met een lage percentage bleekmiddel en grondig spoelen in water. Om een referentie-standaardcurve te genereren, bereid een seriële verdunning van dezelfde maaltijd met 0,002% fluoresceïne voor die aan de experimentele groep muggen werd aangeboden.Voeg voor het maken van de eerste oplossing van de standaardcurve 50 microliters maaltijd met 0,002% fluoresceïne toe aan 950 microliters PBS en vortex grondig. Voer tweevoudige verdunningen uit voor de rest van de oplossingen voor de standaardcurve, waarbij u goed vortext voor elke verdunning. Pipetteer 100 microliters van elk van de oplossingen van de standaardcurve in elk van de acht putjes in de eerste kolom van een 96-wells PCR-plaat.Voeg een verdoofd of bevroren ongevoede controlemug toe aan elk van dezelfde acht putjes. Herhaal dit in de tweede kolom van de plaat voor een replicaatmeting. Voeg 100 microliters PBS toe aan elk resterende putje voor de ongevoede controle- en experimentele groepen.Voeg als negatieve controle een ongevoede mug toe aan elk putje in de volgende twee kolommen van de plaat. Voeg een mug per putje toe aan de resterende putjes van de experimentele groepen die een maaltijd kregen aangeboden. Voeg drie millimeter borosilicaat vast glaskralen toe aan elk putje als u weefsel verstoort met behulp van een bead mill homogenisator.Verzegeld de plaat zorgvuldig en verstoort het weefsel en vervolgens centrifugeert u de plaat bij 2000 RPM gedurende een tot twee minuten om het lysaat te verzamelen. Bereid een zwarte 96-wells plaat voor met 180 microliters PBS in elk putje. Voeg vervolgens 20 microliters lysaat toe aan elk putje en meng.Meet de fluoresceïne-intensiteit met behulp van een plate reader met de 485 excitatie- en 520 emissiekanalen. Genereer de referentie-standaardcurve door de bekende volume maaltijd

feeding-quantifying-animal-derived-blood-artificial-meals-aedes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel refractaire voor het dengue virus moet worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van virale infecties in de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van dengue infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor het groeien van het virus in de cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.

Protocol voor Dengue Infecties in Muggen (A. aegypti) en Infectie Fenotype Bepaling

Methoden voor het gebruik van Alphavirus transducing systemen om TL-verslaggevers uit te drukken in vitro en in volwassen muggen worden beschreven. Deze techniek kan worden aangepast aan een eiwit van belang uit te drukken in plaats van of naast een verslaggever.

Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

This video demonstrates a blood-feeding assay to evaluate the mortality and fecundity of test compounds with novel modes of action on female mosquitoes. This technique helps in screening new classes of insecticides to kill the resistant population of mosquitoes and control disease spread.

Mosquito Feeding Assay: A Method to Evaluate Test Compound Effects on Mortality and Fecundity of Adult Female Mosquitoes

Voor een efficiënte controle van mug virusverspreiding gedragen, is de kennis van het potentieel van de vector van respectieve muggen van bijzonder belang. Beschrijven we gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van vector bevoegdheid van Aedes albopictus en drie verschillende Culex taxa voordeoverdracht van Zika-virus.

Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen

Dit protocol beschrijft een microinjection methodologie die we hebben gestandaardiseerd en gebruikt jarenlang voor bepaalde hoeveelheden van nucleïnezuren rechtstreeks naar de Hemolymfe van muggen en huis vliegt. Dit protocol resulteert in minimale injectie sterfte en laat dosis gecorreleerd metingen van vruchtbaarheid.

Reproduceerbaar dsRNA Microinjection en Oviposition Bioassay in muggen en huis vliegt

Een protocol wordt gepresenteerd voor de formulering van een bloedvrij kunstmatig dieet om Anopheles muggen in gevangenschap te voeden. Dit dieet heeft een vergelijkbare prestatie als gewerveld bloed en triggers oogenese en ei rijping en produceert levensvatbare volwassen nakomelingen.

Een bloedvrij dieet om anopheline muggen rear

Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

Beschreven is een tijd- en ruimtebesparende methode om eieren te tellen en de broedsnelheden van individuele muggen te bepalen met behulp van 24 putweefselkweekplaten, die de schaal en snelheid van vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten aanzienlijk kunnen verhogen.

Verbeterde vruchtbaarheid en vruchtbaarheidstest voor Aedes aegypti met behulp van 24 well tissue kweekplaten (EAgaL-platen)

De standaard membraanvoedingstest (SMFA) wordt beschouwd als de gouden standaard voor de beoordeling en identificatie van potentiële antimalariaverbindingen. Dit kunstmatige voedingssysteem wordt gebruikt om muggen te infecteren om de effecten van dergelijke verbindingen op de intensiteit en prevalentie van de Plasmodium falciparum-parasiet verder te evalueren.

Standaard membraanvoedingstest voor de detectie van Plasmodium falciparum-infectie in Anopheles Mosquito Vectors

Deze methodologie, die orale voeding en intrathoracale injectie-infectie omvatte, kon de invloed van midgut- en / of speekselklierbarrières op arbovirusinfectie effectief beoordelen.

Experimentele virale infectie bij volwassen muggen door orale voeding en micro-injectie

Het huidige protocol beschrijft hoe gemeenschappelijke levensparametergegevens bij Aedes aegypti-muggen kunnen worden gemeten, waaronder vruchtbaarheid, vleugelgrootte, vruchtbaarheid, geslachtsverhouding, levensvatbaarheid, ontwikkelingstijden, mannelijke bijdrage en levensduur van volwassenen. Deze metingen kunnen worden gebruikt om de fitheid van transgene muggen te beoordelen.

Kwantificering van fitnesskosten bij transgene Aedes aegypti-muggen

Leer een methode voor het voeden en kwantificeren van bloedmaaltijden bij Aedes aegypti-muggen met behulp van een kunstmatige membraanvoeder. Deze techniek maakt nauwkeurige meting van ingenomen maaltijdvolumes mogelijk.

Het voeden en kwantificeren van dierlijk bloed en kunstmatige maaltijden in Aedes aegypti-muggen

Meer video's verkennen