Het voeden en kwantificeren van dierlijk bloed en kunstmatige maaltijden in Aedes aegypti-muggen

Deze techniek stelt onderzoekers in staat om voeding aan te bieden en zelfstandig hoogwaardige metingen uit te voeren om maaltijdvolumes te vergelijken die door honderden individuele muggen zijn geconsumeerd. Het kan aanpassen aan het veranderen van de inhoud van de maaltijd, of om het volume te vergelijken dat door verschillende experimentele groepen is geconsumeerd. Dit protocol is bedoeld om gebruiksvriendelijk en goedkoop te zijn.

Voor farmacologische en genetische manipulaties, om het bloedvoedingsgedrag van muggen en het gedrag na voeding te bestuderen. Organisatie is cruciaal voor dit protocol. Bereid de opstelling en reagentia van tevoren voor, zodat u de maaltijden snel aan de muggen kunt leveren.

Om te beginnen, breng 1,98 tot twee milliliter gedefibrineerde schapenbloed over in een conische buis van 15 milliliter. Als u fluorescentiegebaseerde kwantificering van de maaltijdgrootte wilt uitvoeren, voegt u fluoresceïne-oplossing toe tot een eindconcentratie van 0,002%, waardoor het bloedvolume met dezelfde hoeveelheid wordt verminderd als de toegevoegde fluoresceïne. Bewaar een milliliter van de uiteindelijke maaltijdformulering om de referentie-standaardcurve te genereren.

Alle maaltijden en oplossingen die fluoresceïne bevatten, moeten worden verpakt in aluminiumfolie of in het donker worden bewaard. Om eiwitvrije zoutoplossingsmaaltijden te bereiden, combineer 600 microliters van 400 millimolair natriumbicarbonaat met 1,39 milliliter dubbel gedistilleerd water in een conische buis van 15 milliliter. Als fluorescentiegebaseerde kwantificering van de maaltijdgrootte vervolgens moet worden uitgevoerd, voegt u fluoresceïne-oplossing toe tot een eindconcentratie van 0,002%. Verminder het watervolume met dezelfde hoeveelheid als de toegevoegde fluoresceïne.

Bewaar minimaal een milliliter van de uiteindelijke maaltijdformulering die 0,002% fluoresceïne bevat om de referentie-standaardcurve te genereren. Zet de bereide maaltijden opzij totdat u klaar bent om ze te leveren. Alle maaltijden en oplossingen die fluoresceïne bevatten, moeten worden verpakt in aluminiumfolie of in het donker worden bewaard.

Plaats de experimentele groep vrouwelijke muggen in een container en bedek ze met gaas. Laat deze vrouwtjes acclimatiseren in de voedingskamer. Zet een controlegroep ongevoerde muggen opzij die geen maaltijd zullen krijgen aangeboden.

Om een GLI-buis te construeren, vul een conische buis van 50 milliliter met 40 milliliter 100% glycerol. Sluit de open conische buis af met twee stukken parafilm om de kans op lekkage te minimaliseren. Optioneel kunt u de parafilm op zijn plaats houden met behulp van elastiekjes.

Keer de buis om om er zeker van te zijn dat er geen gaten of openingen zijn. Om het maaltijddistributienetwerk te maken, snijdt u een gecentreerd gat van 2,5 centimeter in de schroefdop van de conische buis met behulp van een scherp mes of een lave. Rek een stuk parafilm gelijkmatig uit zodat het ongeveer verdubbelt in grootte.

De parafilm moet dun genoeg zijn zodat muggen er gemakkelijk doorheen kunnen, maar er mogen geen lekken zijn. Verzegeld de buitenoppervlakte van de schroefdop met de parafilm om het gat volledig te bedekken, en leg de dop opzij. Verwarm zowel de verzegeld buis met glycerol als de bloed- en zoutoplossingsmaaltijden en een waterbad van 42 tot 45 graden Celsius gedurende ten minste 15 minuten.

Voeg ATP toe aan de verwarmde maaltijd en vortex grondig. Pipetteer twee milliliter van de verwarmde maaltijd in de binnenkamer van de schroefdop en plaats de omgekeerde verwarmde glycerolgevulde conische buis er voorzichtig op. Schroef de dop met de maaltijd gedeeltelijk op de glycerolgevulde buis, net genoeg om lekkage van de maaltijd of het glycerol te voorkomen.

Plaats de geassembleerde gly-buis op de mugcontainer, breng koolstofdioxide aan en laat de muggen minimaal 15 minuten toegang tot voeding om maximale voedingssnelheden te bereiken. Na het voeren kan de GLI-buisdop worden weggegooid als biogevaarlijk afval of opnieuw worden gebruikt na weken in een oplossing met een lage percentage bleekmiddel en grondig spoelen in water. Om een referentie-standaardcurve te genereren, bereid een seriële verdunning van dezelfde maaltijd met 0,002% fluoresceïne voor die aan de experimentele groep muggen werd aangeboden.

Voeg voor het maken van de eerste oplossing van de standaardcurve 50 microliters maaltijd met 0,002% fluoresceïne toe aan 950 microliters PBS en vortex grondig. Voer tweevoudige verdunningen uit voor de rest van de oplossingen voor de standaardcurve, waarbij u goed vortext voor elke verdunning. Pipetteer 100 microliters van elk van de oplossingen van de standaardcurve in elk van de acht putjes in de eerste kolom van een 96-wells PCR-plaat.

Voeg een verdoofd of bevroren ongevoede controlemug toe aan elk van dezelfde acht putjes. Herhaal dit in de tweede kolom van de plaat voor een replicaatmeting. Voeg 100 microliters PBS toe aan elk resterende putje voor de ongevoede controle- en experimentele groepen.

Voeg als negatieve controle een ongevoede mug toe aan elk putje in de volgende twee kolommen van de plaat. Voeg een mug per putje toe aan de resterende putjes van de experimentele groepen die een maaltijd kregen aangeboden. Voeg drie millimeter borosilicaat vast glaskralen toe aan elk putje als u weefsel verstoort met behulp van een bead mill homogenisator.

Verzegeld de plaat zorgvuldig en verstoort het weefsel en vervolgens centrifugeert u de plaat bij 2000 RPM gedurende een tot twee minuten om het lysaat te verzamelen. Bereid een zwarte 96-wells plaat voor met 180 microliters PBS in elk putje. Voeg vervolgens 20 microliters lysaat toe aan elk putje en meng.

Meet de fluoresceïne-intensiteit met behulp van een plate reader met de 485 excitatie- en 520 emissiekanalen. Genereer de referentie-standaardcurve door de bekende volume maaltijd