PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Dit protocol om het enzym tryptofaansynthase uit Salmonella typhimurium te zuiveren is snel, eenvoudig en kort. Ammoniumsulfaat fractievorming en grootte-exclusiechromatografie maken het mogelijk om het wild type en mutante tryptofaansynthasecomplex in één dag te zuiveren. Deze techniek kan worden toegepast om andere gerelateerde eiwitten te zuiveren, aangezien ammoniumsulfaat fractievorming en grootte-exclusiechromatografie vaak worden gebruikt om niet-gelabelde eiwitten te zuiveren.

Om te beginnen, verstoren de celpellet door sonicatie op een ijswaterbad bij 80% amplitude gedurende 20 cycli met behulp van 10-seconde pulsen en 20-seconde pauzes. Centrifugeer de cellysaat bij 30.000 keer g gedurende 30 minuten bij 25 graden Celsius, en zuig de supernatant op zonder de pellet te verplaatsen. Filter de verdunde supernatantfractie met een 0,45-micrometer filter bij kamertemperatuur.

Voeg langzaam kleine hoeveelheden ammoniumsulfaat toe aan het filtraat tot 20% verzadiging is bereikt. Voer de ammoniumsulfaat fractievorming uit bij 25 graden Celsius, en roer de oplossing voorzichtig gedurende 10 minuten, zorgvuldig zonder bellen te maken. Centrifugeer de oplossing opnieuw gedurende 10 minuten, en breng het supernatant over in een schone kolf voor verder gebruik.

Suspeneer voorzichtig de pellet opnieuw in 20 milliliter monsterbuffer, en bereid een monster voor om SDS-PAGE uit te voeren. Voeg ammoniumsulfaat toe aan het supernatant tot 30% verzadiging is bereikt, en roer de oplossing, zorgvuldig zonder bellen te maken. Centrifugeer de oplossing opnieuw gedurende 10 minuten, en breng het supernatant over in een schone kolf voor verder gebruik.

Suspeneer voorzichtig de verkregen 40% pelletfractie in 10 milliliter monsterbuffer twee, en bereid een monster voor om SDS-PAGE uit te voeren. Microcentrifugeer vervolgens het 40% eiwitmonster bij 10.000 keer g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius, en laad het verkregen supernatant op een eerder geëquilibreerde HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR kolom die is bevestigd aan een fast protein liquid chromatography instrument bij een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut. Beoordeel de verzamelde piekfracties en de ammoniumsulfaatfracties op een 12% SDS-PAGE gel die is gekleurd met Coomassie briljantblauw.

Concentreer het wilde type of mutante alfa-twee bèta-twee Salmonella typhimurium tryptofaansynthasecomplex met een 100-kilodalton centrifugaalfilter door te centrifugeren bij 3.000 keer g, bij vier graden Celsius. Breng het geconcentreerde eiwit over in een verse twee-milliliter buis, en centrifugeer opnieuw bij 10.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden om aggregaten te verwijderen. Na het bepalen van de eiwitconcentratie van het monster, bereid 0,5 milliliter aliquoten voor bij 20 tot 25 milligram per milliliter.

Vries ze snel in in vloeibaar stikstof, en bewaar ze bij min 80 graden. Bereid een vijf-milliliter stamoplossing van 200 millimolair spermine in water voor, en bewaar deze in 500 microliter aliquoten bij min 20 graden. Bereid vervolgens een 50-milliliter stamoplossing van 30% polyethyleenglycol 8.000 in water voor, en bewaar 25 milliliter in een 50-milliliter wegwerpcentrifuge kegelkolf bij 25 graden Celsius.

Bereid 25-milliliter stamoplossingen van één-molair cesiumchloride en natriumchloride, elk in water, en bewaar deze bij 25 graden Celsius. Bereid drie sets van 50-milliliter stamoplossingen van één-molair bicine voor, en titrateer deze met cesiumhydroxide of natriumhydroxide om oplossingen met buffer bij pH 7,6, 7,8 en acht te verkrijgen. Bewaar 25-milliliter aliquoten van de oplossingen bij vier graden Celsius.

Ontdooi een monster van alfa-twee bèta-twee Salmonella typhimurium tryptofaansynthasecomplex in een ijsbad. Microcentrifugeer het vervolgens bij 10.000 keer g gedurende 10 minuten bij 25 graden Celsius. Breng de heldere supernatantfractie over in een schone centrifugeerbuis.

Schat de eiwitconcentratie van het supernatant, en verdun de aliquoten tot 15 milligram per milliliter met 50-millimolair bicine cesiumhydroxide of bicine natriumhydroxide van pH 7,8, bevattend 50-millimolair cesium of natriumchloride. Bereid 500 microliter reservoiroplossingen voor voor drie 24-well zittingsdruppelplaten in steriele 1,5-milliliter microcentrifugebuisjes. Varieer de concentratie van PEG 8.000 en spermine, en verander de buffer-pH zoals beschreven in het tekstmanuscript voor elke set.

Dicht de buisjes af, en schud ze krachtig gedurende 10 seconden, voordat ze worden gecentrifugeerd bij 10.000 keer g gedurende 10 minuten bij 25 graden Celsius om luchtbellen te verwijderen. Doe 500 microliter van deze oplossing in elk reservoir. Doe vijf microliter eiwitoplossing bij 15 microgram per liter in elk zittingsdruppelputje met behulp van een P-10 micropipet.

Voeg vervolgens vijf microliter van elke bijbehorende reservoiroplossing toe aan de eiwitdruppel. Vermijd luchtbellen tijdens het mengen, en pipet niet op en neer. Bedek tenslotte de plaat met transparant plakband en bewaar deze bij 25 graden.

De kristallen verschijnen in twee tot vijf dagen en groeien binnen twee weken tot hun volledige afmetingen. Dit protocol werd gebruikt om de alfa-subeenheid en de bèta-subeenheid van de Salmonella typhimurium tryptofaansynthase in de gemodificeerde pET SUMO vector te subcloneren. Representatieve SDS-PAGE resultaten van twee sterke banden die overeenkomen met de His6-SUMO-alfa en His6-SUMO-bèta tryptofaansynthase fusie-eiwit worden hier getoond.

Elk eiwit werd gezuiverd door middel van nikkel-nitrilotriacetaat affiniteitschromatografie en ammoniumsulfaatprecipitatie, gevolgd door His-SUMO-tag splitsing, verwijdering van His-SUMO-tag sporen, en eiwitconcentratiemeting. Het elutieprofiel van de alfa-subeenheid, bèta-subeenheid, en alfa-twee bèta-twee Salmonella typhimurium tryptofaansynthasecomplex op SEC, en de zuiverheid van hun piekfracties worden hier getoon