Co-translationele insertie van membraaneiwitten in voorgevormde nanodiscs

Het protocol is zeer efficiënt en veelzijdig. Het kan op bijna elk membraaneiwit worden toegepast en de hele productieprocedure is binnen een dag voltooid. De gesynthetiseerde membraaneiwitten kunnen al co-translationeel worden gestabiliseerd door geleverde liganden.

Detergentcontacten worden volledig vermeden en de eiwitten worden direct in de aangeboden en op maat gemaakte membraanomgevingen geïnserteerd en gevouwen. Structurele benaderingen, functionele karakterisering en antilichaamgeneratie zijn belangrijke toepassingsgebieden. De techniek is bovendien eenvoudig in het analyseren van lipide-effecten op het vouwen en de functie van membraaneiwitten.

Op dag drie van de cultuur, inoculeer 10 liter steriel 37 graden Celsius YPTG-medium in een 15-liter geroerde-tankreactor met 100 milliliter pre-cultuur. En cultiveer de bacteriën bij 37 graden Celsius met 500 omwentelingen per minuut bij hoge beluchting. Om overmatig schuimen te voorkomen, voeg steriel anti-schuim toe.

Wanneer de cellen de mid-log fase bereiken, voeg 300 milliliter ethanol toe aan de cultuur en incubeer de cellen bij 42 graden Celsius met 500 rotaties per minuut bij hoge beluchting voor nog eens 45 minuten. Aan het einde van de incubatie, oogst de cellen door centrifugatie en gebruik een spatel en een pipet om de cellen volledig te resuspenderen in 300 milliliter S30A-buffer. Centrifugeer de gesuspendeerde bacteriën twee keer, waarbij de pellet wordt gewassen met 300 milliliter verse S30A per wasbeurt.

Na de tweede wasbeurt, resuspendeer de cellen in een 1,1 volume S30B-buffer. Laad de suspensie in een voorgekoelde French-press drukcel en vernietig de cellen één keer bij 1.000 pond per vierkante inch meter. Om onstabiele componenten te verwijderen en het mRNA van de ribosomen te bevrijden, pas het lysaat aan tot 0,4 molair natriumchloride en incubeer het monster gedurende 45 minuten in een waterbad van 42 graden Celsius.

Om de membraanskelet-eiwit-nanodiscs samen te stellen, meng de MSP1E3D1-oplossing met de lipide-oplossing en voeg DPC toe tot een eindconcentratie van 0,1%. Pas de reactie aan tot het juiste eindvolume volgens de tabel en incubeer de reacties gedurende een uur bij 21 graden Celsius onder lichte agitatie. Aan het einde van de incubatie, bevochtig de membraan van een dialysecassette vooraf met schijfvormingsbuffer en gebruik een spuit om het assemblagemengsel in de cassette te laden. Dialyseer vervolgens de reactie tegen drie vijf-liter volumes schijfvormingsbuffer gedurende 10 tot 20 uur bij kamertemperatuur met roeren voordat u het mengsel overbrengt naar schijfvormingsbuffer geëquilibreerde centrifugale filtereenheden met een moleculair gewicht van 10 kilodalton.

Concentreer vervolgens de reactie tot ten minste 300 micromolair door centrifugatie met behulp van een UV-Vis-lezer om de concentratie te meten. Om een drie-milliliter continue uitwisselingsvrije celreactie voor te bereiden, breng de membraan van een drie-milliliter dialysecassette in evenwicht in 100 millimolair tris-acetaat. En gebruik een spuit om het reactiemengsel in de cassette over te brengen.

Verwijder met behulp van een spuit overtollig lucht uit het reactiemengselcompartiment en plaats de cassette in de dialysekamer. Vul de kamer met 60 milliliter voedingsmengsel en plaats het deksel op de kamer. Nadat het deksel op zijn plaats is gefixeerd, incubeer de kamer gedurende 12 tot 16 uur bij 30 graden Celsius bij 200 omwentelingen per minuut.

Om een 60-microliter celuitwisselingsvrije reactieopstelling voor magnesiumionenscreening voor te bereiden, voeg 60 microliter van onze vers bereide 3X Master Mix toe aan het reactiemengsel en 825 microliter aan het voedingsmengsel. En vul het voedingsmengsel met water. Na het vortexen, voeg 825 microliter voedingsmengsel toe aan elk van de drie putjes van een 24-putjes microplaat.

Snijd geregenereerde cellulose dialysebuizen met een moleculair gewicht van 10 tot 14 kilodalton in ongeveer 25-bij-20 millimeter grote stukken en bewaar de stukken in water aangevuld met 0,05% natriumaziet. Voor het mini-celuitwisselingsvrije containerassemblage, gebruik een doek om overtollig water van de dialysemembranen te verwijderen en plaats een membraanstuk op elke container. Fixeer de membranen met een polytetrafluorethyleenring en breng de mini-container over naar één putje met voedingsmengsel.

Voeg de hoogmoleculaire componenten toe aan het reactiemengsel, zoals aangegeven in de tabel, en meng door middel van pipetteren. Voeg 60 microliter reactiemengsel toe aan de reactiecontainer, zorg ervoor dat u luchtbellen vermijdt. En wikkel twee acht-bij-10 centimeter vellen van een afdichtende thermoplastische film om de 24-putjesplaat.

Fixeer het deksel van de putjesplaat met plakband en plaats de plaat bij 30 graden Celsius in 200 omwentelingen per minuut met agitatie gedurende 12 tot 16 uur. De volgende ochtend, gebruik een pipettip om door de dialyse membraan te prikken bij de mini-celuitwisselingsvrije container en aspireer het reactiemengsel. Breng het reactiemengsel over in nieuwe centrifugeerbuisjes en centrifugeer om precipitaat te verwijderen.

Vervolgens brengt u het supernatant over in een nieuwe buis. Hier wordt een representatief effect van het fijnafstemmen van reactiecomponenten op de uiteindelijke opbrengst of kwaliteit van gesynthetiseerde membraaneiwitten getoond. In deze analyse was de algehele synthese en nanodisc-solubilisatie van de T-bèta-een adrenerge receptor vergelijkbaar onder alle geanalyseerde membraansamenstellingen.

In tegenstelling daarmee werd een veel hogere variatie gedetecteerd in de kwaliteit van het gesynthetiseerde G-eiwit-gekoppelde receptor, met de laagste activiteit verkregen met de DMPC en POPC lipiden, en de hoogste waargenomen bij het gebruik van DOPG en POPG. Samenvattend geven deze resultaten aan dat de lading van de lipidekopgroep evenals de flexibiliteit van de vetzuurketen belangrijke modulatoren zijn voor het vouwen en de activiteit van dit celmembraaneiwit