Het bestuderen van de activiteit van neuropeptiden en andere regulatoren van het uitscheidingssysteem in de volwassen mug

Dit protocol beschrijft technieken die kunnen worden gebruikt door fysiologen van kleine dieren om de rol van neuropeptiden en andere hormonale factoren die het spijsverterings- en of uitscheidingssysteem reguleren, op te helderen. Deze technieken maken het mogelijk om biologische monsters van microformaat te meten die anders niet mogelijk zouden zijn met behulp van technieken die speciaal zijn ontworpen voor grotere diermodellen, waaronder bijvoorbeeld knaagdieren en teleus. Deze methode kan inzicht geven in de endocriene regulatie van de darm, inclusief het transporteren van epitheel, evenals gladde spieren geassocieerd met het maagdarmkanaal bij insecten en bij niet-insectensoorten van vergelijkbare grootte.

Farwa Sajadi, een promovendus uit mijn laboratorium, demonstreert de renale tubale procedures van insecten. Daarnaast zal een voormalige afgestudeerde student van mijn lab Aryan Lajevardi de op hindgut gerichte protocollen demonstreren. Begin met het bereiden van de Ramsay- en contractie-assays-gerechten voor de experimenten.

Gebruik pipet en vul putjes met maximaal 20 microliter oplossing. Voor niet-gestimuleerde controles vult u de putten met 20 microliter Aedes zoutoplossing Schneider's medium. Zodra alle putten zijn gevuld, giet u gehydrateerde minerale olie in de testschaal totdat de putten en Minutien-pinnen zijn ondergedompeld.

Nadat u de tubulus in de put hebt ondergedompeld, pakt u het proximale uiteinde van de tubulus met een tang op, verwijdert u deze van de baddruppel en wikkelt u het uiteinde rond de pin. Wikkel de tubulus tweemaal rond de pen en houd de lengte van de tubulus die in de baddruppel achterblijft consistent met de andere tubuli. Om een natriumselectieve micro-elektrode te maken, gebruikt u een spuit van één milliliter om de elektrode op te vullen met 100 millimolair natriumchloride.

Zorg ervoor dat de opvuloplossing zich vult tot de punt van de elektrode. Als er luchtbellen verschijnen, veegt u voorzichtig met de micro-elektrode of verwijdert u de oplossing en vult u deze opnieuw. Dompel een pipetpunt van 10 microliter in de natriumselectieve ionofooroplossing.

Lijn de elektrode loodrecht op de pipet en plaats vervolgens een gehandschoende vinger over de onderkant van de punt om druk te creëren en een kleine druppel ionofoor te verdrijven. Raak de druppel ionofoor voorzichtig aan op de micro-elektrodepunt en zorg ervoor dat u deze niet breekt. Vul een klein bekerglas halverwege met 100 millimolnatriumchloride en plaats wat boetseerklei aan de binnenkant aan de bovenkant van het bekerglas.

Nadat de ionofoor is opgenomen, plaatst u de elektrodepunt op de wand van het bekerglas en laat u de uiteinden in het natriumchloride. Bewaar ISME in het bekerglas totdat het klaar is voor gebruik. Om de ISME-referentie-elektrode te maken, vult u een elektrode op met 500 millimolar kaliumchloride en slaat u deze op in een bekerglas.

Coat de elektrodepunten met een oplossing van ongeveer 3,5% polyvinylchloride, opgelost in tetrahydrofuraan, om verplaatsing van de ionofoor te voorkomen wanneer ondergedompeld in paraffineolie. Om de natriumelektrode te kalibreren, plaatst u 10 microliter druppeltjes natriumchloride standaardconcentraties op de rand van de Ramsey schotel met de geïncubeerde Malpighian tubuli. Plaats de standaard druppels twee centimeter uit elkaar met de hogere concentratie erop.

Plaats zowel de referentie-elektrode als de ionselectieve elektrode over de chloridezilverdraden en bevestig ze stevig met behulp van elektrodehouders die aan micromanipulatoren zijn bevestigd. Navigeer beide elektroden naar de 200 millimolaire natriumchloridedruppel met behulp van de micromanipulatoren, zodat de elektrotips de bodem van de schotel niet raken. Schakel de elektrometer in om de opname te starten en laat de meting stabiliseren.

Neem de meting op en ga verder met de volgende standaard. Na het verkrijgen van metingen van de vloeistofsecretiesnelheid, verplaatst u voorzichtig de referentie- en ionselectieve elektroden in de uitgescheiden druppel met behulp van de micromanipulatoren. Schakel de opname in en laat de meting stabiliseren en neem vervolgens op.

Schakel de IPA-2 ionen-/polarografische versterker, de lichtmicroscoop en de computers in. Plaats de natriumselectieve micro-elektrode op een houder bestaande uit een zilverchloridedraad en bevestig deze in de vrouwelijke connectoraansluiting. Verwijder één referentie-elektrode uit het bekerglas met het kaliumchloride, plaats één vinger aan het ene uiteinde en kantel het glazen capillair naar deze vinger om te voorkomen dat de agar eruit valt.

Plaats voorzichtig het ene uiteinde in de houder en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan. Als er een bel is, verwijdert u de referentie-elektrode, vult u de houder met drie kiezen kaliumchloride en herhaalt u dit. Plaats de elektrodehouder in de vrouwelijke connectoraansluiting.

Ontleed na de kalibratie het orgel. Plaats de poly-L-lysineschaal met het ontlede monster op het microscoopstadium en plaats de punt van de referentie-elektrode in de zoutoplossing. Dompel de punt van de ionselectieve micro-elektrode onder in de zoutoplossing en zorg ervoor dat de punt niet breekt.

Gebruik de handmatige instelknoppen om de micro-elektrodepositie aan te passen terwijl u onder de lichtmicroscoop kijkt. Pas de verticale positie van de micro-elektrode zodanig aan dat de punt zich op hetzelfde vlak bevindt als het orgaan of weefsel en draai vervolgens aan de motorschakelaar om in te schakelen. Gebruik de pijltjestoetsen van de computer om de micro-elektrode horizontaal te verplaatsen naar een positie op drie millimeter afstand van het weefsel om achtergrondopnamen te meten.

Wanneer u klaar bent, begint u met opnemen door op F5 te drukken en vijf metingen van achtergrondactiviteit te verkrijgen. Beweeg de micro-elektrodepunt dicht bij het weefsel en zorg ervoor dat u het orgaan niet doorboort. Verminder de gevoeligheid voor het indrukken van de toets om de micro-elektrodepunt twee micrometer direct naar rechts te plaatsen, loodrecht op het weefsel.

Verkrijg drie opnames op de plaats langs het rectale pad om de plaats van de grootste ionenactiviteit te identificeren en verkrijg vervolgens baseline zoutmetingen op de site met de grootste activiteit. Om hindgut-weeën op te nemen, vult u een van de putten in het gerecht met een bekend volume Aedes-zoutoplossing. Breng na de dissectie het ontleede achterbeen dat aan de middelste darm is bevestigd voorzichtig over in een put in een ander gerecht, zorg ervoor dat u het ileum niet knijpt.

Dompel de darm onder in de zoutoplossing in de put en plaats Minutien-pinnen in de middelste darm en het rectum. Het ileum mag niet onder spanning staan en spontane samentrekkingen afkomstig van de pylorische klep bij het voorste ileum moeten worden waargenomen. Sluit de videocamera aan op de stereoscopische microscoop.

Plaats vervolgens de schaal met het ontleedde orgaan onder de microscoop en neem twee minuten lang een video op. Toepassing van DH31 tegen niet-gestimuleerde Malpighian tubuli resulteert in een significante toename van de secretiesnelheid van vloeistoffen, wat de rol ervan als een diuretisch hormoon bij Aedes-muggen bevestigt. Wanneer tubuli worden behandeld met AedaeCAPA-1, wordt een vermindering van de secretiesnelheid waargenomen in DH31 gestimuleerde Malpighian tubuli.

Ionselectieve elektroden werden gebruikt om natriumconcentraties in de uitgescheiden druppels te meten. Behandeling van DH31 op de MT's had geen effect op de natriumconcentratie in de uitgescheiden druppel. Met de toepassing van AedaeCAPA-1 was de natriumconcentratie in de uitgescheiden vloeistof echter aanzienlijk verhoogd.

Bovendien leidde DH31, in vergelijking met niet-gestimuleerde controles, tot een significant hogere natriumtransportsnelheid, terwijl AedaeCAPA-1 deze toename van DH31-gestimuleerde tubuli afschafte. De SIET werd gebruikt om veranderingen in natriumtransport langs het rectale padepitheel van volwassen vrouwelijke muggen te beoordelen. Een leucokinine-analoog werd gebruikt om veranderingen in natriumabsorptie te onderzoeken, wat resulteerde in een viervoudige afname van de natriumabsorptie in vergelijking met zoutoplossingcontrole.

Om de rol van een neuropeptide pyrokinine2 op de ileale motiliteit te beoordelen, werd een Rhodnius prolixus-analoog gebruikt, waarvan eerder werd aangetoond dat het de A.aegypti PK2-receptor verrijkt in het muggenileum activeert. Ten opzichte van de uitgangswaarden remt PK2 de ileale contracties significant. Bij het uitvoeren van een Ramsay-test met Malpighian-tubuli en het meten van ionen- of vloeistofsecretiesnelheden, is het noodzakelijk dat tubuli niet worden beschadigd tijdens dissectie of tijdens de overdracht in de testschaal.

Na de Ramsay-test kunnen specifieke membraantransporters farmacologisch of moleculair worden gericht met behulp van omgekeerde genetische technieken om hun specifieke bijdrage aan transepitheliaal transport van opgeloste stoffen in het eenvoudige epitheel te onderscheiden.