Name: Meting van de striale bloedstroom in slakkenhuis van muizen met behulp van een open vaatvenster en intravitale fluorescentiemicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Leer de meting van striale bloedstroom in muizen met behulp van een open vaatvenster en intravitale fluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar cochleaire bloedstroom mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) en Medical Research Foundation van Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).

OPMERKING: Dit is een niet-overlevingsoperatie. Alle procedures met betrekking tot het gebruik van dieren werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Oregon Health &Science University (IACUC-goedkeuringsnummer: TR01_IP00000968).
1. Bereiding van de fluorescerend gelabelde bloedcellen
<ol><li>Anesthetie de donormuizen (mannelijke C57BL/6J-muizen van ~6 weken oud) met een intraperitoneale (i.p.) injectie van ketamine/xylazine-anestheticumoplossing (5 ml/kg, zie de tabel met materialen). OPMERKING: Dit anesthesieprotocol is zeer betrouwbaar en handhaaft de systemische bloeddruk.</li>
	<li>Leg de muis op zijn rug, open de huid en leg de borstholte bloot met een pincet en een ontleedschaar. Knip het middenrif open, grijp met een klemschaar naar de basis van het borstbeen, knip door de ribbenkast en til op om het hart bloot te leggen. Verzamel 1 ml bloed in heparine (15 IE/ml bloed) door een hartpunctie en centrifugeer bij 3.000 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie na bloedafname.</li>
	<li>Verwijder het plasma, was de bloedcelkorrel met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en centrifugeer 3x bij 3000 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Label de bloedcellen met 1 ml dio of dil in PBS en incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur23,24.</li>
	<li>Centrifugeer en was de gelabelde bloedcellen met 1 ml PBS, centrifugeer 3x bij 3000 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C en resuspenseer de celpellet in 30% hematocriet met ~ 0,9 ml PBS (eindvolume ~ 1,3 ml) vóór injectie.</li>
</ol>2. Operatie om een open raam te creëren 25
<ol><li>Bereid de steriele chirurgische instrumenten en het beeldvormingsplatform voor en plaats een verwarmingskussen onder het gordijn (figuur 1A). Verdoof de muizen (mannelijke C57BL/6J-muizen van ~6 weken oud) zoals beschreven in stap 1.1 en controleer de diepte van de anesthesie door de pootreflex en de algemene spiertonus te controleren. Plaats het dier op het warme verwarmingskussen en houd de rectale temperatuur op 37 °C.</li>
	<li>Plaats de dierenstaart in het CODATM-monitorsysteem voor het controleren van de bloeddruk en hartslag (zie de materiaaltabel). Noteer de systolische bloeddruk van het dier, diastolische bloeddruk en gemiddelde bloeddruk (MBP) in de verdoofde toestand. OPMERKING: Er wordt geen verschil gezien bij dierlijke MBP in verdoofde en niet-verdoofde toestand (107 ± 11 mmHg versus 97 ± 7 mmHg). De hartslag van het dier is stabiel onder anesthesie, hoewel lager (nog steeds binnen het normale bereik) dan in de niet-verdoofde toestand (357 ± 12 bmp versus 709 ± 3 bmp). Een licht verhoogde hartslag moet worden verwacht bij dieren die in terughoudendheid zijn geplaatst26.</li>
	<li>Open de linker trommelvlies bulla via een laterale en ventrale benadering onder een stereomicroscoop (zie de Tabel van Materialen), waarbij het trommelvlies en de gehoorbeentjes intactblijven 21.<ol><li>Maak een incisie langs de middellijn van de nek van het dier met de kop geïmmobiliseerd en gepositioneerd om beweging te minimaliseren (figuur 1B). Verwijder de linker submandibulaire klier en achterste buik van de digastrische spier en cauteriseren. OPMERKING: Injecteer buprenorfine subcutaan met 0,05 mg / kg om de pijn tijdens de operatie te verminderen.</li>
		<li>Lokaliseer en stel de benige bulla bloot door de sternocleidomastoïde spier en gezichtszenuw te identificeren die zich anterieur naar de bulla uitstrekt.</li>
		<li>Open de benige bulla met een naald van 30 G en verwijder voorzichtig het omliggende bot met een chirurgisch pincet om een duidelijk zicht te bieden op het slakkenhuis en de stafslagader, met de mediale rand die over de rand van de ronde raamnis ligt en anterieur-superieur naar het ovale venster loopt (figuur 1C, D). OPMERKING: Tracheotomie wordt uitgevoerd om de luchtweg onbelemmerd te houden en mag alleen worden gedaan wanneer het dier tijdens de operatie een ademhalingsprobleem heeft. Over het algemeen hebben de meeste dieren onder narcose een soepele ademhaling. Als dieren echter tijdens de operatie een tracheotomie hebben gekregen, mag de geregistreerde bloedstroom niet worden gebruikt voor vergelijking.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een klein mesblad (op maat gefreesd # 16 scalpel) om het laterale wandbot te schrapen bij de top-middelste draai van het slakkenhuis van de muis, ongeveer 1,25 mm van de top totdat een dunne plek is gebarsten. Verwijder de botchips met kleine draadhaken (figuur 1E).</li>
	<li>Bedek het vaatvenster met een gesneden afdeksel om normale fysiologische omstandigheden te behouden en een optisch beeld te bieden voor het opnemen van vaatbeelden. OPMERKING: Alle procedures moeten met voorzichtigheid worden uitgevoerd. Naast het controleren van de lichaamstemperatuur, moeten de vitale functies van het dier, waaronder bloeddruk en hartslag, ook tijdens de operatie worden gecontroleerd.</li>
</ol>3. Beeldvorming van CoBF onder FIVM
<ol><li>Maak een incisie van ~ 1 cm langs de rechter sapheneuze ader om het vat bloot te stellen (figuur 1F).</li>
	<li>Injecteer 100 μL van de FITC-dextran-oplossing (2000 kDa, 40 mg/ml in PBS) en 100 μL van een bloedcelsuspensie (30% hematocriet) achtereenvolgens in het dier via de sapheneuze ader (figuur 1G) om visualisatie van de bloedvaten en het volgen van de bloedstroomsnelheid mogelijk te maken.</li>
	<li>Observeer de bloedstroom in realtime rechtstreeks op een videomonitor 5 minuten na de injectie. Beeld de bloedvaten af met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een lange werkafstand (W.D.) objectief (W.D. 30,5 mm, 10x, 0,26 numeriek diafragma) en een lampbehuizing met een meervoudig band excitatiefilter en compatibel emissiefilter (Tabel van materialen). Neem de video op met een digitale zwart-witcamera met hoge resolutie (materiaaltabel) met 2 frames/s). Verkrijg meer dan 350 afbeeldingen per video om een succesvolle analyse van de stroomsnelheid te garanderen. OPMERKING: Bloedvaten van zowel het spiraalband als de stria vascularis kunnen in beeld worden gebracht door de optische focus aan te passen (aanvullende video 1).</li>
</ol>4. Video-analyse
<ol><li>Meet de diameter van het vat met behulp van de juiste software (Tabel van materialen) en bepaal de afstand tussen twee vaste punten over het vat in de verkregen afbeeldingen.</li>
	<li>Bereken de bloedstroomsnelheid van vastgelegde videoframes door de beweging van gelabelde bloedcellen te volgenin de ruimtelijke afstand tussen beeldlocaties27.<ol><li>Open de video van de bloedstroom in de software (Fiji [ImageJ] werd in dit protocol gebruikt) en stel de schaal van de afbeeldingen in.</li>
		<li>Volg de geselecteerde DiO-gekleurde bloedcellen met behulp van de trackingfunctie. Gebruik de afstand die de cellen hebben verplaatst en het tijdsinterval tussen beeldframes in de video voor automatische berekening van de stroomsnelheid.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereken de volumetrische stroom (F) volgens de volgende vergelijking: F = V × A. (V: snelheid; A: dwarsdoorsnede van het schip).</li>
</ol>5. Blootstelling aan lawaai
<ol><li>Plaats de dieren in gaaskooien. Stel ze bloot aan breedbandgeluid bij een geluidsdrukniveau van 120 dB in een geluidsblootstellingscabine gedurende 3 uur en de volgende dag nog eens 3 uur. OPMERKING: Dit regime voor blootstelling aan lawaai, dat routinematig in dit laboratorium wordt gebruikt, veroorzaakt permanent verlies van cochleaire gevoeligheid28.</li>
</ol>

<ol><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li>
<li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li>
<li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+%5Bcorrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li>
<li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li>
<li>Miller, J., Ren, T. -Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li>
<li>Miller, J. M., Ren, T. -Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound-induced+cochlear+ischemia%2Fhypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Noise+and+Health%22%5BJournal%5D)">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17(1999).</li>
<li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Hearing%22%5BJournal%5D)">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , Thieme Medical Publishers. 242-250 (2012).</li>
<li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li>
<li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+%28ALDF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li>
<li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laser+Doppler%3A+a+non-invasive+measure+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngologica%22%5BJournal%5D)">The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow.</a> Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).</li>
<li>Le Floc'h, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cochlear+inflammation+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Markers of cochlear inflammation using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).</li>
<li>Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngologica%22%5BJournal%5D)">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li>
<li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology & Neurotology. 27 (2), 144(2006).</li>
<li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978(2018).</li>
<li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%22%5BJournal%5D)">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li>
<li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li>
<li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li>
<li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041(2012).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+blood+flow%3A+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li>
<li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li>
<li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+platelets+from+mouse+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803(2019).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li>
<li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular%2C+renal%2C+and+pulmonary+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li>
<li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652(2011).</li>
<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li>
<li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel laat zien hoe haarvaten in de cochleaire laterale wand (en in de stria vascularis) van een muismodel kunnen worden gevisualiseerd met fluorofooretikettering in een open vaatvenstervoorbereiding onder een FIVM-systeem. Muismodel wordt veel gebruikt en heeft de voorkeur als zoogdiermodel voor het onderzoeken van de menselijke gezondheid en ziekte. Het hier beschreven protocol is een haalbare benadering voor het afbeelden en onderzoeken van CoBF in de zijwand van de muis (met name in de stria vascularis) met beh...

De normale functie van de microcirculatie in de laterale cochleaire wand (bestaande uit de meerderheid van de haarvaten in het spiraalvormige ligament en de stria vascularis) is van cruciaal belang voor het behoud van de gehoorfunctie1. Abnormale CoBF is betrokken bij de pathofysiologie van veel binnenooraandoeningen, waaronder lawaai-geïnduceerd gehoorverlies, oorhydrops en presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Visualisatie van intravitale CoBF zal een beter begrip mogelijk maken van de verbanden tussen gehoorfunctie en cochleaire vasculaire pathologie.
Hoewel de complexiteit en locatie van het slakkenhuis in het temporale bot directe visualisatie en meting van CoBF uitsluit, zijn er verschillende methoden ontwikkeld voor de beoordeling van CoBF, waaronder laser-doppler flowmetrie (LDF)10,11,12, magnetische resonantie beeldvorming (MRI)13, fluorescentie intravitale microscopie (FIVM)14, fluorescentiemicro-endoscopie (FME)15, endoscopische laser spikkelcontrast beeldvorming (LSCI)16 , en benaderingen op basis van de injectie van gelabelde markers en radioactief gelabelde microsferen in de bloedbaan (optische microangiografie, OMAG)17,18,19,20. Geen van deze methoden heeft echter absolute real-time tracking van veranderingen in CoBF in vivo mogelijk gemaakt, met uitzondering van FIVM. FIVM, in combinatie met een vessel-window in de laterale cochleaire wand, is een aanpak die bij cavia's onder verschillende experimentele omstandigheden door verschillende laboratoria is gebruikt en gevalideerd 14,21,22.
Een FIVM-methode werd met succes ontwikkeld voor het bestuderen van de structurele en functionele veranderingen in de cochleaire microcirculatie bij muizen met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran als contrastmiddel en een fluorescentiekleurstof - ofwel DiO (3, 3 ′-dioctadecyloxacarbocyanineperchloraat, groen) of Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3-tetramethylindocarbocyanineperchloraat, rood) - voor het vooraf labelen van bloedcellen, het visualiseren van bloedvaten en het volgen van de bloedstroomsnelheid. In deze studie is het protocol van deze methode beschreven voor het afbeelden en kwantificeren van veranderingen in CoBF bij muizen onder normale en pathologische omstandigheden (zoals na blootstelling aan lawaai). Deze techniek geeft de onderzoeker de tools die nodig zijn om de onderliggende mechanismen van CoBF met betrekking tot gehoordisfunctie en pathologie in de stria vascularis te onderzoeken, vooral wanneer toegepast in combinatie met direct beschikbare transgene muismodellen.

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium Chloride</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-1966-02</td><td>0.6 mL (voor 1 mL)</td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;-tetramethylindocarbocyanine perchloraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td>20 µM</td></tr><tr><td>3,3&prime;-Dioctadecyloxyacarbocyanine perchloraatDio (3,3&prime;-Dioctadecyloxyacarbocyanine perchloraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292</td><td>20 µM</td></tr><tr><td>CODA Monitor systeem</td><td>Kent scientific</td><td></td><td>CODA Monitor, voor het bewaken van bloeddruk en hartslag</td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperatuurregelaar</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Meting van vaatdiameter</td></tr><tr><td>FITC-dextran (2000 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD2000s</td><td>40 mg/mL</td></tr><tr><td>Heparine Sodium Injectie, USP MDV</td><td>Mylan</td><td>NDC 67457-374-12</td><td>5000 USP eenheden/mL</td></tr><tr><td>Katathesia (100 mg/mL)</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0702-1</td><td>0.2 mL (voor 1 mL)</td></tr><tr><td>Microscoopobjectief</td><td>Mitutoyo</td><td>378-823-5</td><td>Model: M Plan Apo NIR 10x</td></tr><tr><td>ORCA-ER Camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>Model: C4742-80-12AG</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>2085387</td><td></td></tr><tr><td>Xyzaine (100 mg/ml, 5x verdund voor gebruik )</td><td>Lloyd</td><td>LPFL04821</td><td>0.2 mL (voor 1 mL)</td></tr><tr><td>Zoom Stereo Microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Model: SZ61, fluorescentiemicroscoop</td></tr></tbody></table>

meting van de striale bloedstroom in slakkenhuis van muizen met behulp van een open vaatvenster en intravitale fluorescentiemicroscopie

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Transductie van geluid is metabolisch veeleisend en de normale functie van de microvasculatuur in de laterale wand is van cruciaal belang voor het behoud van endocochleaire potentiaal, ionentransport en vloeistofbalans. Verschillende vormen van gehoorstoornissen worden gemeld met abnormale microcirculatie in het slakkenhuis. Onderzoek naar hoe cochleaire bloedstroom (CoBF) pathologie de gehoorfunctie beïnvloedt, is een uitdaging vanwege het gebrek aan haalbare ondervragingsmethoden en de moeilijkheid om toegang te krijgen tot het binnenoor. Een open vaatvenster in de laterale cochleaire wand, gecombineerd met fluorescentie intravitale microscopie, is gebruikt voor het bestuderen van CoBF-veranderingen in vivo, maar meestal bij cavia's en pas onlangs bij de muis. Dit artikel en de bijbehorende video beschrijven de open vaatvenstermethode voor het visualiseren van de bloedstroom in het slakkenhuis van de muis. Details omvatten 1) bereiding van de fluorescerend gelabelde bloedcelsuspensie van muizen; 2) constructie van een open vaatvenster voor intravitale microscopie in een verdoofde muis, en 3) meting van de bloedstroomsnelheid en -volume met behulp van een offline opname van de beeldvorming. De methode wordt gepresenteerd in videoformaat om te laten zien hoe de open vensterbenadering in de muis kan worden gebruikt om structurele en functionele veranderingen in de cochleaire microcirculatie onder normale en pathologische omstandigheden te onderzoeken.

Na chirurgische blootstelling van de cochleaire haarvaten in de laterale wand (figuur 1), was intravitale fluorescentiemicroscopische observatie met hoge resolutie van Dil-gelabelde bloedcellen in FITC-dextran-gelabelde bloedvaten haalbaar via een open vaatvenster. Figuur 2A is een representatieve afbeelding genomen onder FIVM die de haarvaten van de cochleaire apex-middle turn laterale wand van de muis toont. De lumina van deze ...

Een open vaatvensterbenadering met behulp van fluorescerende tracers biedt voldoende resolutie voor cochleaire bloedstroom (CoBF) -meting. De methode vergemakkelijkt de studie van structurele en functionele veranderingen in CoBF bij muizen onder normale en pathologische omstandigheden.

Meting van de striale bloedstroom in slakkenhuis van muizen met behulp van een open vaatvenster en intravitale fluorescentiemicroscopie

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining ...

Normale bloedtoevoer naar slakkenhuis is van cruciaal belang voor cochlea De ziekte van Ménière, vooral voor het behoud van cochleair potentieel binnenshuis, wat de essentiële drijvende kracht is voor haarcellentransactie. Deze functie van de bloedcirculatie is nauw verbonden met verschillende vormen van gehoorverlies. Een beter begrip van de cochleaire bloedstroom zal een effectievere behandeling van gehoorstoornissen als gevolg van bloedstroomdisfunctie mogelijk maken.Directe bloedstroommeting is echter zeer uitdagend vanwege de moeilijkheid om het binnenoor te beoordelen. Technieken voor het beoordelen van de cochleaire bloedstroom zijn momenteel nog in ontwikkeling. Hier demonstreren we een van de recente methoden die zijn vastgesteld in ons laboratorium open spiervenster in accommodatie met hoge resolutie fluorescentiemicroscoop om de cochleaire bloedstroom bij kleine diersoorten zoals muizen te versmallen.Toepassing van deze techniek met transgenetische massamodellen heeft het potentieel voor het bevorderen van onderzoek om de verbanden tussen gehoorfunctie en de pathologie gerelateerd aan cochleaire bloedstroom in intravasculair risico te ontrafelen. Onze procedures moeten met de nodige voorzichtigheid worden uitgevoerd. Naast een kortstondige lichaamsbloeding moeten de vitale functies van het dier, waaronder bloeddruk en hartslag, tijdens uw operatie worden gecontroleerd.Begin met het verzamelen van ongeveer een millimeter bloed in heparine door hartpunctie. Centrifugeer het bloed op 3000 maal G gedurende drie minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het plasma en was vervolgens de bloedcelkorrel met één milliliter PBS drie keer door centrifugeren op 3000 keer G gedurende drie minuten bij vier graden Celsius.Label de bloedcellen met een milliliter van 20 micromolaire DiO of Dil in PBS en incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de gelabelde bloedcellen met één milliliter PBS en centrifugeer drie keer op 3000 maal G gedurende drie minuten. Resuspendeer de celpellet in 30% hematocriet met ongeveer 0,9 milliliter PBS vóór injectie.Bereid steriele chirurgische instrumenten en beeldvormingsplatform voor en plaats een verwarmingskussen onder het gordijn. Controleer de slechte reflex en algemene spiertonus van de verdoofde muizen om de diepte van de anesthesie te controleren. Plaats het dier op het warme verwarmingskussen en zijn staart in het monitorsysteem voor het controleren van de bloeddruk en hartslag.Houd de rectale temperatuur op 37 graden Celsius en noteer de systolische bloeddruk van het dier, de diastolische bloeddruk en de gemiddelde bloeddruk in de verdoofde toestand. Open de linker trommelvlies bulla via een laterale en ventale benadering onder een stereomicroscoop en laat het trommelvlies en de gehoorbeentjes intact. Maak een incisie langs de middellijn van de nek van het dier met zijn hoofd geïmmobiliseerd om beweging te minimaliseren.Verwijder de linker submandibulaire klier en achterste buik van de digastrische spier en cauteriseren. Lokaliseer en stel de benige bulla bloot door de sternocleidomastoïde spier en gezichtszenuw te identificeren die zich anterieur naar de bulla uitstrekt. Open de benige bulla met een naald van 30 gauge en verwijder voorzichtig het omliggende bot met een chirurgisch pincet om een duidelijk zicht te bieden op de cochleaire en niet-gestapelde slagader met zijn mediale marge die over de rand van de ronde raamnis ligt en anterieur superieur naar het ovale venster veroorzaakt.Gebruik een klein mesblad om het laterale wandbeen bij de bovenste middelste draai van het slakkenhuis van de muis ongeveer 1,25 millimeter van de top te schrapen totdat een dunne plek is gebarsten. Verwijder de botchips met kleine draadhaken. Bedek het venster van het vat met een afgesneden afdeksel om normale fysiologische omstandigheden te behouden en een optisch beeld te bieden voor het opnemen van vaatbeelden.Maak een incisie van één centimeter langs de rechter sapheneuze ader om het vat bloot te leggen. Injecteer achtereenvolgens 100 microliter elk van de FITC-Dextran-oplossing en de bloedcelsuspensie in het dier via de sapheneuze ader om visualisatie van de bloedvaten en het volgen van de bloedstroom mogelijk te maken. Observeer de bloedstroom in realtime op een videomonitor vijf minuten na de injectie.Breng de bloedvaten in beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een lange werkafstandsobjectief en een lampbehuizing met een meervoudig band excitatiefilter en een compatibel emissiefilter. Neem de video op met een hoge resolutie digitale zwart-wit charge gekoppelde apparaatcamera die meer dan 350 afbeeldingen per video verwerft. Om een succesvolle analyse van de stroomsnelheid te garanderen.Meet de diameter van het vat met behulp van de juiste software en bepaal de afstand tussen twee vaste punten over het vat in de verkregen beelden. Open de video van de bloedstroom in de software en stel de schaal van de afbeeldingen in. Volg de geselecteerde DiO-gekleurde bloedcellen met behulp van de trackingfunctie.Gebruik vervolgens de afstand die de cellen hebben verplaatst en het tijdsinterval tussen beeldframes in de video voor automatische berekening van de stroomsnelheid. Bereken de volumetrische stroom met behulp van de vergelijking in het tekstmanuscript. Om het model voor geluidsblootstelling te maken voordat de bloedstroom wordt geregistreerd, plaatst u de dieren in gaaskooien en stelt u ze gedurende drie uur bloot aan breedbandgeluid bij een geluidsdrukniveau van 120 decibel in een geluidsblootstellingscabine.Daarna nog eens drie uur op de volgende dag. Registreer de bloedstroom twee weken na blootstelling aan lawaai. Na chirurgische blootstelling van de cochleaire haarvaten in de laterale wand, werd intravitale hoge resolutie fluorescentie microscopische observatie van DiL-gelabelde bloedcellen in FITC Dextran-gelabelde vaten uitgevoerd door een open vaatvenster.DiL gelabelde bloedcellen in Stria-vaten gelabeld met FITC Dextran worden hier weergegeven. Dio gelabelde bloedcellen gelabeld met FITC Dextran tonen aan dat de vaatdichtheid van het spiraalvormige ligament spaarzamer is dan die van de dichtere Stria vascularis. Hoge resolutie IVM toont de bloedstroompatronen in controle- en ruisbelichte groepen.Het verstoorde patroon van de bloedcirculatie is te zien in de aan lawaai blootgestelde groepen. Anomalieën omvatten een verminderde diameter van het vat en een grotere variatie in de diameter van het vat. De bloedstroomsnelheden in de controle- en ruisbelichte groepen werden berekend door de wortels van de Met DiO gelabelde bloedcellen te volgen.De bloedsnelheid en het volume in de aan lawaai blootgestelde groep waren significant lager dan in de controlegroep. De succesvolle oprichting van het open vatvenster vereist een hoge mate van chirurgische vaardigheid. Voorzichtigheid is geboden bij het verwijderen van het bot van de cochleaire zijwand.

measurement-strial-blood-flow-mouse-cochlea-utilizing-an-open-vessel

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een nieuwe veelzijdige methode voor het observeren van de microcirculatie wordt gepresenteerd. Het wordt beschouwd als geschikt voor waarneming op lange termijn, en voor de combinatie met pharmacophysiological of moleculaire biologische interventies.

In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

Corticale doorbloeding dynamiek kan worden bestudeerd in vivo door beeldvorming fluorescente kleurstoffen dextran geïnjecteerd in de staartader van knaagdieren met twee-foton microscopie. Deze video laat zien hoe u foto doorbloeding dynamiek in neocortex van muizen door middel van een met glas overdekt craniale venster voorbereiding.

Een methode voor 2-Photon Imaging van de bloedstroom in de neocortex door middel van een Cranial Window

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

We presenteren een methode om een ​​beeldvorming raam in de muis schedel die millimeter overspant en is stabiel gedurende maanden zonder ontsteking van de hersenen vormen. Deze methode is zeer geschikt voor longitudinale studies van de bloedstroom, cellulaire dynamiek en cel / vasculaire structuur met behulp van twee-foton microscopie.

Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

This video demonstrates the intravital fluorescence microscopy technique to study thrombus formation in a mouse model. The mouse is injected with a fluorophore-labeled polysaccharide to monitor blood circulation. Upon illumination with a high-intensity light, the phototoxic induction of an injury in the microvasculature of the ear leads to the formation of a thrombus, which is confirmed by visualizing the obstruction in the blood flow.

Intravital Fluorescence Microscopy to Study Microvascular Thrombus Formation

Intravitale microscopie van de muis M. cremaster microcirculatie biedt een unieke en goed gestandaardiseerd in vivo model voor de analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie.

Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie

Intravitale microscopie kan bij dieren worden gebruikt om retinale vaatdiameters, bloedstroomsnelheden en totale retinale bloedstroom te visualiseren en te meten.

Intravitale Video Microscopie Metingen van retinale bloedstroom in Muizen

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode voor de dynamische meting en kwantificering van bloedstroomsnelheid binnen individuele bloedvaten van de muizenlevervaten met behulp van intravitale microscopie-beeldvorming in combinatie met een specifieke methodologie voor beeldverwerving en analyse.

Intravitale Microscopie Imaging van de lever volgende<em&gt; Leishmania</em&gt; Infectie: een beoordeling van de lever Hemodynamica

Live-imaging van de gelabelde bloedcellen in de oculaire circulatie kan informatie verschaffen over ontsteking en ischemie bij diabetische retinopathie en leeftijdgerelateerde macular degeneratie. Een protocol om bloedcellen te labelen en de gemarkeerde cellen in de retinale circulatie af te beelden is beschreven.

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.

Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart

Het retinale vaatstelsel van muizen is bijzonder interessant voor het begrijpen van de mechanismen van vasculaire patroonvorming. Dit protocol meet automatisch de diameter van de retinale vaten van muizen op basis van fluorescerende angiografie-fundusbeelden op een vaste afstand van de optische schijf.

Het meten van de diameter van het netvliesvat van fluorescerende angiografiebeelden van muizen

Leer de meting van striale bloedstroom in muizen met behulp van een open vaatvenster en intravitale fluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar cochleaire bloedstroom mogelijk.

Meting van de striale bloedstroom in slakkenhuis van muizen met behulp van een open vaatvenster en intravitale fluorescentiemicroscopie (Video) | JoVE Journal

Meting van de striale bloedstroom in slakkenhuis van muizen met behulp van een open vaatvenster en intravitale fluorescentiemicroscopie

Meer video's verkennen