Name: Laservrije hydroxyl radicale eiwitvoetafdruk om structurele analyse van eiwitten in hogere orde uit te voeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Leer laservrije hydroxyl radicale eiwitvoetafdruk voor structurele analyse van eiwitten met inline radicaal dosimetrie. Deze methode verbetert reproduceerbaarheid en bespaart tijd en monster.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 en R44GM125420).

1. Installatie van de capillaire buis
<ol><li>Met behulp van een silica kloven steen, splitsen 250 μm binnendiameter (ID) silica capillair tot 27 inch. Controleer de capillaire uiteinden op een schone, rechte snede.</li>
	<li>Maak twee ramen van ongeveer 15 mm lang door de polyimide coating weg te branden. Vanaf het "onderste uiteinde" maakt u het eerste fotolysevenster op 90 mm afstand van het "onderste uiteinde" en het tweede dosimetervenster op 225 mm afstand van het "onderste uiteinde". OPMERKING: Zodra de coating is weggebrand, is het capillair erg kwetsbaar.</li>
	<li>Schroef de moer en de ferrule los bij poort 5 en steek het "onderste uiteinde" van het capillair net voorbij het conische uiteinde van de ferrule (figuur 1A).</li>
	<li>Verwijder op de fotolysemodule de fotolyseceldop door deze er recht uit te trekken en verwijder vervolgens het magnetisch gemonteerde metalen masker dat het capillair op zijn plaats houdt. LET OP: In de fotolyseceldop bevindt zich een gebogen spiegel, laat niets de spiegel raken.</li>
	<li>Open op de dosimetermodule de dosimetercel door op het lipje aan de linkerkant te drukken en de dosimetercel naar rechts te zwaaien. Verwijder de magnetisch gemonteerde clips die het capillair op zijn plaats houden.</li>
	<li>Plaats het capillair in het gegroefde kanaal in de basis van de fotolysecel. Centreer het capillaire venster met het fotolysecelvenster. Terwijl u het capillair met één hand op zijn plaats houdt, voegt u het magnetische masker toe om het capillair op zijn plaats te houden. Plaats de fotolysedop weer op zijn plaats.</li>
	<li>Plaats het capillair in het gegroefde kanaal in de basis van de dosimetercel. Centreer het tweede capillaire venster op het kleine diafragma in het midden van de dosimetercelbasis. Terwijl u het capillair met één hand op zijn plaats houdt, plaatst u de twee magnetische clips in positie om het capillair op zijn plaats te houden. Sluit de dosimetercel totdat deze dichtklikt.</li>
	<li>Steek het capillair door de gekartelde moer bovenop de capillaire lift van de productcollector (afbeelding 1B). Verleng het capillair tot net boven de onderkant van de flacon. OPMERKING: Het is belangrijk dat het capillair de bodem van de flacon bereikt om ervoor te zorgen dat het capillair tijdens een experiment in de blusoplossing wordt ondergedompeld.</li>
</ol>2. Een injectielus installeren
<ol><li>Gebruik Teflon-buizen met een buitendiameter van 1/16" en een binnendiameter van 0,015" (381 μm). Volg vergelijking 1 om de lengte van de slang te berekenen die nodig is voor het gewenste volume met behulp van vergelijking 1. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ01.jpg"> Waarbij L de lengte van de slang in millimeters is, is V het gewenste volume in microliters en d de binnendiameter van de buis in millimeters. Voor een injectievolume van 25 μL en een binnendiameter van 381 μm moet de buislengte ongeveer 219,3 mm bedragen. OPMERKING: Gebruik PTFE-buizen met een binnendiameter van 0,01" voor volumes kleiner dan 20 μL.</li>
	<li>Snijd de Teflon-slang op de benodigde lengte met behulp van een buissnijder. Controleer de uiteinden van de buis op een schone, rechte snede.</li>
	<li>Steek het ene uiteinde van de nieuwe injectielus door een van de moeren en plaats een nieuwe ferrule op het uiteinde van de buis. Houd de ferrule en moer op hun plaats en steek de buis in poort 3 van de injectieklep totdat deze in de klep uitvalt. Houd de buis stevig vast en draai de moervinger strak. Draai de moer met een moersleutel 1/4 draai verder. Verwijder en inspecteer het montage. OPMERKING: Als de ferrule niet op zijn plaats is bevestigd, installeert u deze opnieuw en draait u deze 1/8 draai verder. Herhaal dit met het andere uiteinde van de lus.</li>
	<li>Zodra beide uiteinden een moer en een vaste ferrule hebben, schroeft u het ene uiteinde losjes aan poort 3 en het andere uiteinde aan poort 6 (figuur 1C). Eenmaal in positie beide zijden vastdraaien om de vinger strak te houden en vervolgens 1/4 draai voorbij vinger strak met een moersleutel.</li>
</ol>3. Initialiseer het fotolysesysteem
<ol><li>Schakel de fotolysemodules in de volgende volgorde in: (1) Fluidics Module (2) Fotolysemodule (3) Dosimetriemodule (4) Productverzamelaar, en ten slotte (5) de systeemcomputer en start de besturingssoftware OPMERKING: Laat de Dosimeter Module minstens een half uur opwarmen vanaf een koude start.</li>
	<li>Dompel de slang volledig onder vanuit de stand "Klep" op de spuitpomp (figuur 1D) in 10 ml buffer. Plaats de slang vanuit de stand "Afval" (figuur 1D) en de slang van poort 2 op de spuitpoort (figuur 1C) in een lege container om afval op te halen. OPMERKING: Gebruik de buffer waarin uw eiwit wordt gesuspendeerd. Een aanbevolen buffer is 10 mM NaPO4.</li>
	<li>Plaats op de carrousel productcollector 1,5 ml microcentrifugebuizen op de plaats met de aanduiding H en 6.</li>
	<li>Als u 250 μm ID capillair gebruikt, stelt u het belastingsdebiet in op 500 μL/min, het verwerkingsdebiet op 7,5 μL/min en het afvaldebiet op 500 μL/min.</li>
	<li>Bereken de flitsvertraging, producttijd en verspillingstijd om de semiautomatische modus te gebruiken met vergelijking 2. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ02.jpg"> Waarbij t de tijd in minuten is, s de capillaire afstand in millimeters, d de binnendiameter van het capillair in millimeters en f het debiet in μL/min.<ol>
<li>Voor de flitsvertraging is de afstand van het "onderste uiteinde" van het capillair tot het eerste venster, dat ongeveer 90 mm moet zijn. Met behulp van 250 μm ID capillair en een verwerkingsdebiet van 7,5 μL/min komt het monster in ongeveer 35 seconden in het fotolysevenster. Laat twee flitsen bij 1 Hz optreden voordat de monsters aankomen, dus stel de flitsvertraging in op 33 seconden.</li>
		<li>Voer voor de producttijd de hoeveelheid tijd in die de geïnjecteerde oplossing nodig heeft om van de injectieklep naar het einde van het capillair te stromen. Stel voor een 27" lange 250 μm ID capillair de producttijd in op 4,5 minuten.</li>
		<li>Voer voor de afvaltijd de hoeveelheid tijd in die het totale volume geïnjecteerde oplossing nodig heeft om te worden verzameld. Op dit moment zal de productinzamelaar van de productpositie naar de afvalflacon gaan. Stel voor een injectievolume van 25 μL en een debiet van 7,5 μL/min de afvaltijd in op 7,8 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spoel de injectielus vijf keer uit door 25 μL HPLC-water in de injectiepoort te injecteren terwijl de injectieklep in de belastingsstand is ingesteld.</li>
	<li>Draai de injectieklep handmatig omhoog om de rest van het systeem in 'injecteerpositie' te zetten. Selecteer Proces (Uit) op de besturingssoftware om stromend water te starten. Verhoog tijdens het stromen de capillaire lift van de productcollector door Omhoog onder de productverzamelaar te selecteren, zodat u het einde van het capillair kunt zien. Vloei water door het capillair totdat er een druppel ontstaat. OPMERKING: Als er geen druppel ontstaat, controleer dan de injectorklep op lekken. Als er een lek is, maakt u de moer los, sluit u het capillaire om en maakt u het weer vast.</li>
</ol>4. Bepaal de werkelijke ▪OH-opbrengst om radicale opruimeffecten uit de buffer te testen.
<ol><li>Start de stroom in de besturingssoftware door Proces (Uit)te selecteren. Stel op het tabblad Instellingen de flitsspanning in op 0 V. Selecteer onder het tabblad Handmatige bediening in de sectie dosimetergegevens de optie Gegevens starten + AutoZero.</li>
	<li>Selecteer de positie voor de productflacon (H) en de afvalflacon (6).</li>
	<li>Selecteer Gereed, draai de injectieklep handmatig naar beneden in de belastingspositie en injecteer 25 μL 1 mM Adenine met 100 mM H2O2 in de injectiepoort. Eenmaal geïnjecteerd, draait u de injectieklep handmatig in de injectiepositie. OPMERKING: Dit activeert automatisch het systeem om de stroom te starten, de plasmabron in te schakelen en de dosimetriegegevens te verkrijgen.</li>
	<li>Verhoog de spanning door naar het tabblad Instellingen te navigeren en de flitsspanning te wijzigen. Herhaal stap 4.2 en 4.3 met 500 V, 750 V, 1000 V en 1250 V. Voer de aflezing van adenineabsorpantie bij elke spanning in drievoud uit.</li>
	<li>Selecteer het tabblad Berekeningen om de gemiddelde absorptie van elk monster te bepalen. Klik eerst op Selecterenen selecteer vervolgens handmatig het begin en einde van de piekabsorpance. Schrijf in de beschikbare ruimte een beschrijving van het voorbeeld. Herhaal dit voor alle verkregen gegevens. OPMERKING: Er kunnen bellen ontstaan die een piek in de dosimetermeting veroorzaken. Wanneer u gegevens selecteert om de gemiddelde absorptie te bepalen, laat u gebieden met bellen weg.</li>
	<li>Kopieer en plak gegevens in Excel om de gemiddelde verandering in adenineabsorpiteit voor elke spanning te berekenen, waardoor de effectieve ▪OH-opbrengst wordt bepaald.</li>
	<li>Herhaal stap 4.1-4.6 als meerdere monstercondities (verschillende buffer/additieven) worden gebruikt om de effectieve ▪OH-opbrengst voor elke aandoening te normaliseren.</li>
</ol>5. Wijziging van eiwitten om veranderingen in de hogere ordestructuur te detecteren.
<ol><li>Meng 4 mM adenine met 20 μM eiwit in een één-op-één verhouding om een oplossing te maken die 2 mM adenine en 10 μM eiwit bevat.</li>
	<li>Maak de quench-oplossing met 0,3 mg/ml catalase om overtollig waterstofperoxide en 35 mM methionineamide af te breken om eventuele resterende radicalen te doven. Aliquot 25 μL blusoplossing in een microbuis van 200 μL, zodat een gelijk volume blusmiddel en het gelabelde product worden gemengd.</li>
	<li>Verdun H2O2 tot 200 mM en houd op ijs.</li>
	<li>Start op de besturingssoftware op het tabblad Instellingen de flitsspanning op 0 V om eventuele achtergrondoxidatie te bepalen.</li>
	<li>Selecteer op het tabblad handmatige bediening de optie Gegevens + AutoZero starten, gevolgd door Proces (Uit),vervolgens Gereeden draai ten slotte de injectieklep naar beneden in de belastingspositie.</li>
	<li>Plaats een blusoplossing in stand 1 op de productopvangcarrousel. Wijzig op de System Control Software de productflacon in 1.</li>
	<li>Meng vlak voor injectie 12,5 μL van het adenine- en eiwitmengsel met 12,5 μL H2O2 om een eindconcentratie van 1 mM Adenine, 5 μM-eiwit en 100 mM H2O2te maken. Pipetteer voorzichtig op en neer om te mengen, draai snel naar beneden en injecteer 25 μL met behulp van de injectiepoort binnen 10 seconden na het mengen.</li>
	<li>Zet de injectieklep in de injectiestand en wacht terwijl het monster wordt verwerkt.</li>
	<li>Herhaal acquisitie met 500 V, 750 V, 1000 V en 1250 V. Voer elke spanningsmeting in drievoud uit.</li>
	<li>Bereken de gemiddelde absorptie zoals beschreven in stap 4.5. Kopieer en plak alle gegevens in Excel.</li>
</ol>6. Sluit het systeem af
<ol><li>Nadat alle monsters zijn verzameld, spoelt u de spuitpoort en de monsterlus weg door de injectieklep in de belastingsstand te zetten en injecteert u vijf keer 25 μL HPLC-water.</li>
	<li>Draai de injectieklep in de injectiepositie om de rest van het systeem met HPLC-water te spoelen.</li>
	<li>Stop de stroom, sluit de systeembesturingssoftware en schakel de modules uit die beginnen met de productcollector, dosimetermodule, fotolysemodule en ten slotte de fluidics-module.</li>
</ol>7. Monstervoorbereiding en vloeibare chromatografie-massaspectrometrie
<ol><li>Denature het eiwit door incubatiemonsters bij 80 °C gedurende 20 minuten in aanwezigheid van 50 mM Tris en 1 mM CaCl2. Koel monsters op kamertemperatuur en voeg 1:20 trypsine toe aan eiwitten. Verteer het eiwit 's nachts bij 37 °C met monstermenging. Beëindig de volgende ochtend de trypsinevertering door monsters gedurende 10 minuten op 95 °C te verhitten.</li>
	<li>Detecteer peptiden met behulp van een LC-MS/MS-systeem met hoge resolutie dat is aangesloten op een UPLC-systeem.</li>
	<li>Plaats het monster eerst op de valkolom (300 μm ID X 5 mm 100 Å poriegrootte, deeltjesgrootte van 5 μm) en was gedurende 3 minuten op 5,0 μL/ml met water dat 2% oplosmiddel B (acetonitril en 0,1% mierenzuur) bevat.</li>
	<li>Scheid de peptiden op een C18 nanocolumn (0,75 mm x 150 mm, 2 μm deeltjesgrootte, 100 Å poriegrootte) met een debiet van 300 nL/min met een gradiënt tussen oplosmiddel A (water dat 0,1% mierenzuur bevat) en oplosmiddel B. De gradiënt voor peptide-elutie bestaat uit een lineaire toename van 2 tot 35% B over 22 minuten, verhoogd tot 95% B gedurende 5 minuten en 3 minuten vastgehouden om de kolom te wassen, en vervolgens teruggebracht naar 2% B gedurende 3 minuten en 9 minuten vastgehouden om de kolom opnieuw te equilibreren.</li>
	<li>Verzamel de gegevens in de positieve ionenmodus. Stel de spuitspanning in op 2400 V en de temperatuur van de ionenoverdrachtsbuis op 300 °C.</li>
	<li>Verkrijg de volledige MS-scans van 250-2000 m/z, gevolgd door acht daaropvolgende gegevensafhankelijke MS/MS-scans op de top acht meest voorkomende peptide-ionen. Gebruik botsing-geïnduceerde dissociatie bij 35% genormaliseerde energie om de peptiden te fragmenteren.</li>
	<li>Identificeer alle ongewijzigde peptiden die zijn gedetecteerd uit MS/MS-analyse met behulp van een beschikbare eiwitanalysesoftware aan de hand van het benodigde FASTA-bestand met de eiwitsequentie en het relevante proteolytische enzym.</li>
	<li>Zoek en kwantificeer gemodificeerde peptiden met behulp van een HRPF Data Processing Software. De mate van oxidatie voor elk geïdentificeerd peptide wordt berekend door het opgetelde chromatografische piekgebied van een gemodificeerd peptide te delen door het totale chromatografische piekgebied van dat peptide gewijzigd en ongewijzigd met behulp van vergelijking 3. P = [I(singly geoxideerd) X 1 + I (dubbel geoxideerd) X 2 + I(triply geoxideerd) X 3 + .../[Iunoxidized + I(singly oxidized) + I(dubbel geoxideerd) + I(triply geoxideerd) ...] waarbij P het gemiddelde aantal oxidatiegebeurtenissen per peptidemolecuul aangeeft, en ik het piekgebied van het niet-geoxideerde peptide (Iunoxidized) en het peptide met n oxidatiegebeurtenissen vertegenwoordigt.</li>
</ol>8. Herhaal voor een differentieelonderzoek stap 5-7 op de tweede voorwaarde.
OPMERKING: Om de reproduceerbaarheid te bevestigen, worden twee biologische replica's naast technische triplicaten voor elke aandoening aanbevolen.

<ol><li>Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein+higher+order+structure+using+vibrational+circular+dichroism+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).</li>
<li>Giezen, T. J., Schneider, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+assessment+of+biosimilars+in+Europe%3A+a+regulatory+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Generics+and+Biosimilars+Initiative+Journal%22%5BJournal%5D)">Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective.</a> Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).</li>
<li>Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety-related+regulatory+actions+for+biologicals+approved+in+the+United+States+and+the+Europena+Union%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Society%22%5BJournal%5D)">Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union.</a> Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).</li>
<li>Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+decision-making+with+higher+order+structure+data%3A+starting+a+new+dialogue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).</li>
<li>Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catching+RNA+polymerase+in+the+act+of+binding%3A+intermediates+in+transcription+illuminated+by+synchrotron+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).</li>
<li>Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+actin+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the actin filament.</a> Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).</li>
<li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+flash+photochemical+oxidataion+to+locate+heme+binding+and+conformataional+changes+in+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).</li>
<li>Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+%28FPOP%29+for+Higher+Order+Structure+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).</li>
<li>Watson, C., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Analysis+of+Therapeutic+Proteins+by+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22American+Association+of+Pharmaceutical+Scientists+Journal%22%5BJournal%5D)">Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).</li>
<li>Deperalta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+a+therapeutic+monoclonal+antibody+dimer+by+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.</a> mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).</li>
<li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li>
<li>Storek, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+targeting+the+%CE%B2-barrel+assembly+machine+of+Escherichia+coli+is+bactericidal%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).</li>
<li>Vij, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+boost-and-sort+immunization+strategy+using+Escherichia+coli+BamA+identifies+rare+growth+inhibitory+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7136(2018).</li>
<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes%2C+Order+of+Binding%2C+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Maps+the+Topology+of+Intrinsic+Membrane+Proteins%3A+Light-Harvesting+Complex+2+in+a+Nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).</li>
<li>Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+and+Deconvolution+of+Nanodisc+Native+Mass+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).</li>
<li>Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins%28FPOP%29%3A+A+powerful+mass+spectrometry+based+structural+proteomics+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2019).</li>
<li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li>
<li>Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosetta+Protein+Structure+Prediction+from+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Mass+Spectrometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data.</a> Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).</li>
<li>Linde. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Linde+Specialty+Gases+of+North+America%22">Linde Specialty Gases of North America</a>. , (2009).</li>
<li>Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+laser-induced+photochemical+oxidation+method+for+protein+surface+mapping+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).</li>
<li>Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosimetry+determines+the+initial+OH+radical+concentration+in+fast+photochemical+oxidation+of+proteins+%28FPOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP).</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).</li>
<li>Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensated+Hydroxyl+Radical+Protein+Footprinting+Measures+Buffer+and+Excipient+Effects+on+Conformation+and+Aggregation+in+an+Adalimumab+Biosimilar%5BTitle%5D)+AND+%22American+Association+of+Pharmaceutical+Scientists+Journal%22%5BJournal%5D)">Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar.</a> American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87(2019).</li>
<li>Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+of+lysosomal+enzyme+recognition+by+the+cation-independent+mannose+6-phosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor.</a> Communications Biology. 3 (1), 498(2020).</li>
<li>Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+Time+Normalization+of+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Experiments+by+Inline+Adenine+Radical+Dosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry.</a> Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).</li>
<li>Misra, S. K., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+Real-Time+Compensation+in+Fast+Photochemical+Oxidations+of+Proteins+for+the+Determination+of+Protein+Topography+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes.</a> Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).</li>
<li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li>
<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Protein+Footprinting+for+Higher-Order+Structure+Analysis%3A+Fundamentals+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications.</a> Chemical Reviews. 120 (10), 4355(2020).</li>
<li>Ultraviolet Absorption Spectrum of Hydrogen Peroxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum">http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum</a> (2016).</li>
<li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Energetic+Epitope+of+an+Antibody%2FInterleukin-23+Interaction+with+Hydrogen%2FDeuterium+Exchange%2C+Fast+Photochemical+Oxidation+of+Proteins+Mass+Spectrometry%2C+and+Alanine+Shave+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis.</a> Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).</li>
<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes%2C+Order+of+Binding%2C+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li>
<li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li>
<li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li>
<li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+paramyxovirus+fusion+%28F%29+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li>
<li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris%28hydroxymethyl%29aminomethane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li>
<li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li>
<li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li>
</ol>

E.E.C., J.S.S., en S.R.W. onthullen een aanzienlijk financieel belang in GenNext Technologies, Inc., een bedrijf in een vroeg stadium dat technologieën wil commercialiseren voor analyse van eiwitstructuur van hogere orde. De verstrekte representatieve gegevens zijn beoordeeld door S.K.M., die geen financieel belangenconflict heeft.

Er zijn verschillende kritieke stappen om een goede etikettering van eiwitten tijdens elk HRPF-experiment te garanderen. Ten eerste worden een geschikt debiet en de bronflitssnelheid geselecteerd om ervoor te zorgen dat elke bolus van het monster eenmaal wordt bestraald. Dit zorgt ervoor dat het eiwit wordt blootgesteld aan een enkele bolus van nieuw gevormde ▪OH. Zodra een eiwit is geoxideerd, kan de eiwitstructuur van een hogere orde worden gewijzigd. Om er zeker van te zijn dat de inheemse eiwitstructuur wo...

Eiwitconformatie en bijbehorende hogere ordestructuur (HOS) zijn de belangrijkste determinanten van een goede biologische functie en afwijkend gedrag1. Hetzelfde geldt voor biofarmaceutica, waarvan de structuur en functionele activiteit afhankelijk zijn van verschillende aspecten van hun productie en omgeving. Biofarmaceutische veranderingen in HOS zijn gekoppeld aan bijwerkingen (ADR) toegeschreven aan ongewenste farmacologie en immunologische respons van de patiënt2,3. Het verschijnen van ADR's heeft de biofarmaceutische industrie gewaarschuwd voor de cruciale rol die eiwit-HOS speelt in de veiligheid en werkzaamheid van biotherapeutica, en ze hebben de behoefte aan nieuwe en verbeterde HOS-analyses vastgesteld4.
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is een veelbelovende techniek om de verandering in eiwit HOS te volgen. HRPF omvat de onomkeerbare etikettering van de buitenkant van een eiwit met ▪OH gevolgd door massaspectrometrie (MS) analyse om het oplosmiddel toegankelijke oppervlak van het eiwit5,6,7te identificeren . HRPF is met succes gebruikt om defecten in eiwit HOS en zijn functie te detecteren8,9, karakteriseren de HOS van monoklonale antilichamen (mAb)10,11,12,13, bepalen de binding Kd van een ligand14, en nog veel meer15,16,17,18,19. Een veel voorkomende methode om de ▪OH voor HRPF te genereren is Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP), die gebruik maakt van energierijke, snelle UV-lasers om ▪OH te produceren uit fotolyse van H2O2. FPOP maakt voor het grootste deel gebruik van dure excimerlasers die gevaarlijk gas (KrF) gebruiken en die aanzienlijke waarborgen vereisen om ademhalings- en oogletsel te voorkomen20. Om inhalatiegevaren te voorkomen, hebben anderen frequentie verviervoudigde neodymium yttrium aluminium granaat (Nd:YAG) lasers21gebruikt, die het gebruik van giftig gas elimineert, maar nog steeds duur is, aanzienlijke operationele expertise vereist en uitgebreide verdwaalde lichtcontroles vereist om gebruikers te beschermen tegen oogletsel.
Hoewel er voldoende informatie kan worden verkregen met behulp van HRPF, is niet voldaan aan een brede acceptatie in biofarma. Twee barrières voor de beperkte HRPF-goedkeuring zijn: 1) het gebruik van gevaarlijke en dure lasers die aanzienlijke veiligheidsmaatregelen vereisen20; en 2) de onherproduceerbaarheid van HRPF veroorzaakt door achtergrondopruiming van ▪OH die vergelijkende studies beperken22. Om lasergebruik te verdringen, werd een high-speed, high energy plasmaflitser fotolyse-eenheid ontwikkeld om FPOP veilig op een facile manier uit te voeren. Om de onherproductieve hrpf-experimenten te verbeteren, wordt real-time radicale dosimetrie geïmplementeerd.
De praktijk van HRPF is beperkt door onherkenbaarheid toegeschreven aan achtergrondopruiming van ▪OH22. Hoewel ▪OH uitstekende sondes van eiwittopografie zijn, reageren ze ook met veel bestanddelen die in preparaten worden aangetroffen, waardoor het noodzakelijk is om de effectieve concentratie van radicalen te meten die beschikbaar is om een doeleiwit te oxideren. Variaties in buffervoorbereiding, waterstofperoxideconcentratie, ligandeigenschappen of fotolyse kunnen leiden tot oxidatieverschillen tussen controle- en experimentele groepen die ambiguïteit creëren in HOS-differentiaalstudies. De toevoeging van real-time radicale dosimetrie maakt het mogelijk om het effect ▪ OH-belasting aan tepassen en verhoogt daardoor het vertrouwen en de reproduceerbaarheid tijdens een HRPF-experiment. Het gebruik van radicale dosimetrie in FPOP is elders beschreven23,24,25, en wordt verder in detail besproken in een recente publicatie26. Hier beschrijven we het gebruik van een nieuw flitsfotolysesysteem en real-time dosimetrie om equine apo-myoglobine (aMb) te labelen, waarbij we de niveaus van peptideoxidatie in een FPOP-experiment vergelijken met die van verkregen bij het gebruik van een excimerlaser.

```html
<table><tbody><tr><td>15 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>elke merk is voldoende</td></tr><tr><td>50 &micro;L SGE Gastight Syringes</td><td>Fisher Scientific</td><td>SG-00723</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 &micro;m)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile met 0,1% Mierenzuur (v/v), LC/MS Grad</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>Apomyoglobine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Task Wipers</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>elke 30% waterstofperoxide is voldoende</td></tr><tr><td>Methionine amide</td><td>Chem-Impex</td><td>03109</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massaspectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massaspectrometer</td><td>andere hoge resolutie instrumenten (bijv. Q exactive Orbitrap of Orbitrap Fusion) kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Pierce Trypsin Protease, MS Grad</td><td>Thermo Scientific</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32&rdquo;</td><td>Molex</td><td>1068680064</td><td>elke capillaire buissnijder is voldoende</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water met 0,1% Mierenzuur (v/v), LC/MS Grad</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS118-500</td><td></td></tr><tr><td>Water, LC/MS Grad</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>
```

laservrije hydroxyl radicale eiwitvoetafdruk om structurele analyse van eiwitten in hogere orde uit te voeren

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is een opkomende en veelbelovende hogere orde structurele analysetechniek die informatie biedt over veranderingen in eiwitstructuur, eiwit-eiwit interacties of eiwit-ligand interacties. HRPF maakt gebruik van hydroxylradicalen(▪OH) om het oplosmiddeltoegankelijke oppervlak van een eiwit onomkeerbaar te labelen. De inherente complexiteit, kosten en gevaarlijke aard van het uitvoeren van HRPF hebben een aanzienlijk beperkte brede acceptatie in biopharma. Deze factoren omvatten: 1) het gebruik van gecompliceerde, gevaarlijke en dure lasers die aanzienlijke veiligheidsmaatregelen vereisen; en 2) de onherproduceerbaarheid van HRPF veroorzaakt door achtergrondopruiming van ▪OH die vergelijkende studies beperken. Deze publicatie biedt een protocol voor de werking van een laservrij HRPF-systeem. Dit laservrije HRPF-systeem maakt gebruik van een hoge energie, hoge druk plasma lichtbron flash oxidatie technologie met in-line radicale dosimetrie. De plasmalichtbron is veiliger, gemakkelijker te gebruiken en efficiënter in het genereren van hydroxylradicalen dan lasergebaseerde HRPF-systemen, en de in-line radicale dosimeter verhoogt de reproduceerbaarheid van studies. Gecombineerd pakt het laservrije HRPF-systeem de genoemde tekortkomingen en beperkingen van lasergebaseerde technieken aan en overtreft het deze.

De hogedrukplasmabron in combinatie met real-time dosimetrie maakt een betere controle van ▪OH-opbrengst mogelijk om veranderingen in de eiwitstructuur van hogere orde nauwkeuriger te observeren. De toevoeging van adenine zorgt voor een effectieve real-time radicale dosimeter. Bij oxidatie verliest adenine uv-absorptie bij 265 nm (figuur 2A). De verandering in adenineabsorpties houdt rechtstreeks verband met de concentratie radicalen die beschikbaar is voor HRPF en biedt zo een mi...

Dit protocol presenteert een methode om inline radicale dosimetrie en een plasma lichtbron te gebruiken om flash oxidatie eiwit footprinting uit te voeren. Deze methode vervangt de gevaarlijke UV-laser om de reproduceerbaarheid van snelle fotochemische oxidatie van eiwitstudies te vereenvoudigen en te verbeteren.

Laservrije hydroxyl radicale eiwitvoetafdruk om structurele analyse van eiwitten in hogere orde uit te voeren

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) is an emerging and promising higher order structural analysis technique that provides information on changes ...

Laservrije hydroxylradicale eiwitvoetafdruk maakt het identificeren van eiwitinteractieplaatsen en gebieden van bevestigingsverandering veel gemakkelijker, waardoor onderzoek in eiwitaggregatie-, structuur- en stabiliteitsstudies wordt versneld. Met inline radicale dosimetrie kunnen gebruikers de effectieve hydroxylradicale belasting in realtime aanpassen, en met realtime radicale dosimetrie kunt u experimentele tijd en kostbaar monster besparen terwijl de reproduceerbaarheid van etiketten wordt verbeterd. Om te beginnen, splijten een 250 micrometer binnendiameter silica capillair tot 27 inch met een silica kloven steen, het controleren van de uiteinden van het capillair voor een schone en rechte snede.Maak twee vensters van ongeveer 15 millimeter lengte. Van de onderkant van het capillair, brand de polyimide coating 90 millimeter tot aan het fotolysevenster en 225 millimeter voor het dosimetervenster weg. Plaats het onderste uiteinde van het capillair net voorbij het conische uiteinde van een noot en ferrule.Voeg het capillair toe aan poort vijf en draai net voorbij de vinger vast met een moersleutel. Verwijder de fotolyseceldop van de fotolysemodule door deze er recht uit te trek

laser-free-hydroxyl-radical-protein-footprinting-to-perform-higher

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol beschrijft hoe het kwantificeren van de Mg (II)-afhankelijke vorming van RNA tertiaire structuur door twee methoden van hydroxyl-radicaal voetafdruk.

Monitoring Equilibrium veranderingen in RNA structuur door &#39;Peroxidative&#39; en &#39;Oxidatieve&#39; hydroxyl radicaal Footprinting

Nauwkeurige massa meting betekent een belangrijke stap tijdens het onderzoek van eiwitten. Matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie (MS) kan worden gebruikt voor deze vaststelling en van zijn belangrijkste voordeel is de tolerantie voor zouten, detergentia en verontreinigingen. Hier tonen we een toegankelijke benadering voor de analyse van eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-MS.

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

Eiwitconformatie en dynamiek zijn de sleutel tot het begrijpen van de relatie tussen eiwit structuur en functie. Waterstofwisselproces combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie is een veelzijdige methode om de conformationele dynamica van proteïnen en karakteriseren eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties, zoals contact interfaces en allosterische effecten.

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Een veelzijdig cryoslicing BN-MS protocol met behulp van een microtoom wordt gepresenteerd voor hoge-resolutie complexome profilering.

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

In vivo snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (IV-FPOP) is een hydroxyl radicale eiwit footprinting techniek die het mogelijk maakt voor het in kaart brengen van eiwitstructuur in hun eigen omgeving. Dit protocol beschrijft de assemblage en opzet van het IV-FPOP microfluidic flow systeem.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting voor de studie van eiwitinteracties in Caenorhabditis elegans

Hier karakteriseren we eiwitstructuur en interactiesites in levende cellen met behulp van een eiwitvoetafdruktechniek genaamd in-cell fast fotochemische oxidatie van eiwitten (IC-FPOP).

Kenmerkend voor cellulaire eiwitten met in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten is een opkomende techniek voor de structurele karakterisering van eiwitten. Verschillende oplosmiddel additieven en liganden hebben verschillende hydroxyl radicale opruimeigenschappen. Om de eiwitstructuur in verschillende omstandigheden te vergelijken, is real-time compensatie van hydroxylradicalen die in de reactie worden gegenereerd nodig om reactieomstandigheden te normaliseren.

Real-Time Compensatie mogelijk maken in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van veranderingen in eiwittopografie

De experimentele procedures voor het uitvoeren van covalente etikettering op basis van diethylpyrocarbonaat met massaspectrometrische detectie worden beschreven. Diethylpyrocarbonaat wordt eenvoudig gemengd met het eiwit- of eiwitcomplex van belang, wat leidt tot de wijziging van oplosmiddeltoegankelijke aminozuurresiduen. De gemodificeerde residuen kunnen worden geïdentificeerd na proteolytische vergisting en vloeistofchromatografie/massaspectrometrieanalyse.

Covalente etikettering met diethylpyrocarbonaat voor het bestuderen van eiwitstructuur in hogere orde door massaspectrometrie

Een nieuw statisch platform wordt gebruikt om eiwitstructuur en interactielocaties in de inheemse celomgeving te karakteriseren met behulp van een eiwitvoetafdruktechniek genaamd in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (IC-FPOP).

Platform Incubator met beweegbare XY Stage: een nieuw platform voor het implementeren van in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Leer laservrije hydroxyl radicale eiwitvoetafdruk voor structurele analyse van eiwitten met inline radicaal dosimetrie. Deze methode verbetert reproduceerbaarheid en bespaart tijd en monster.

Laservrije hydroxyl radicale eiwitvoetafdruk om structurele analyse van eiwitten in hogere orde uit te voeren

Meer video's verkennen