Name: Studie van eiwitdynamica via neutronenspinechospectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Leer hoe u een Neutron Spin Echo-experiment opzet om eiwitdynamica in oplossing te bestuderen. Deze methode maakt observatie van domeinherordening op pico- tot nanosecondeschaal mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek gebruikte middelen bij de Spallation Neutron Source (BL-15, BL-6, Biology and Chemistry labs), een DOE Office of the Science User Facility beheerd door het Oak Ridge National Laboratory. Dit onderzoek maakte ook gebruik van middelen in de MLZ-FRM2-reactor Garching (KWS-2, Phoenix-J-NSE) en de JCNS1 in Forschungszentrum Jülich GmbH, Duitsland. De auteur erkent Dr. Ralf Biehl en Dr. Andreas Stadler voor hun hulp bij het modelleren en hun bijdrage aan zowel IgG- als MBP-eiwitonderzoek, Dr. Piotr A. Żołnierczuk voor ondersteuning van NSE-gegevensreductie, Dr. Changwoo Do voor ondersteuning met SANS-metingen en Rhonda Moody en Dr. Kevin Weiss voor SNS biochemische laboratoriumondersteuning.

Het huidige werk kenmerkt twee eiwitten: een regulier humaan antilichaameiwit IgG en het intrinsiek ongeordende MBP. De gelyofiliseerde vorm van de eiwitten werd verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel).
1. Bereiding van eiwitmonsters
<ol><li>Bereid een natriumfosfaat van 50 mM + 0,1 M NaCl-buffer door de respectieve vaste reagentia in zwaar water (D2O) te wegen en op te lossen (zie materiaaltabel). Dit is het gedeutereerde bufferoplosmiddel voor IgG.<ol>
<li>Stel de pH van de bufferoplossing in op 6,6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid een 20 mM natriumfosfaat + 6 M ureumbuffer voor door de respectieve vaste componenten in zwaar water (D2 O)te wegen en op te lossen. Dit is het gedeutereerde bufferoplosmiddel voor MBP.<ol>
<li>Stel de pH van de bufferoplossing in op 4,7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtreer de bufferoplosmiddelen met behulp van poriëngroottefilters van 0,2 μm (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Weeg en los het gezuiverde eiwit gelyofiliseerde poeders op in de gedeutereerde oplosmiddelen voor de respectieve eiwitten (stappen 1.1.-1.2.) bij een hoge eiwitconcentratie (~ 50 mg / ml).</li>
	<li>Laad de eiwitoplossing in dialysekorven met dialysemembranen van 3,5 K MWCO en dialyseer tegen de gefilterde buffer gedurende 24 uur bij 10 °C voor MBP en 25 °C voor IgG (zie Materiaaltabel) door de buizen lichtjes te schudden om een diffusiegradiënt te creëren.</li>
	<li>Verdun de eiwitoplossing met behulp van de dialysebuffer in een reeks concentraties: 1, 2, 5, 10 en 50 mg / ml.</li>
	<li>Bepaal de exacte concentraties met behulp van een Nanodrop spectrofotometer (zie Materiaaltabel).</li>
</ol>2. Voorlopige monsterkarakterisering door dynamische lichtverstrooiing (DLS)
<ol><li>Laad 80 μL van elke eiwitoplossing uit de hierboven voorbereide concentratiereeks (stap 1.6.) in de DLS-wegwerpcel (zie materiaaltabel) en bepaal de diffusiecoëfficiënten, gemiddeld meer dan 10 acquisities.</li>
	<li>Plot de translationele diffusiecoëfficiënten als functie van de eiwitconcentratie en extrapoleer naar nulconcentratie.</li>
	<li>Laad elke eiwitoplossing uit de concentratiereeks in de capillaire buisjes van een viscometer (zie Materiaaltabel) en meet de dynamische viscositeit.</li>
	<li>Plot de dynamische viscositeit gemeten als een functie van de eiwitconcentratie en extrapoleer naar nulconcentratie. OPMERKING: De extrapolatie van DLS-diffusie naar nulconcentratie levert de waarde van translatiediffusie voor één enkel eiwit op. De extrapolatie van dynamische viscositeit naar nulconcentratie moet de dynamische viscositeitswaarde opleveren die experimenteel is gemeten voor de bufferoplossing.</li>
</ol>3. Verzameling van verstrooiing onder kleine hoeken (neutron of röntgenstraling)
<ol><li>Meet kleinhoek neutronenverstrooiing (SANS) en/of kleinhoek x-ray scattering (SAXS) (zie Materiaaltabel) op vier eiwitconcentraties, bij voorkeur 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml en 50 mg/ml.</li>
	<li>Normaliseer SANS- en SAXS-spectra op basis van eiwitconcentratie.</li>
	<li>Pas eiwitvormfactor P(Q) aan op de SANS- en SAXS-spectra met behulp van ensembleoptimalisatie31 - en/of SasView32-software .</li>
	<li>Bereken de structuurfactor S(Q, c) door het SANS- en SAXS-signaal te delen met P(Q) voor elke concentratie. OPMERKING: Lezers die geïnteresseerd zijn in het meten en interpreteren van kleine hoekverstrooiingsgegevens als ondersteuning voor NSE-metingen, worden aangemoedigd om de referenties 23,28,31,32,33 grondig te raadplegen.</li>
</ol>4. Meting van NSE
<ol><li>Stel het experiment in en monteer het voorbeeld volgens de onderstaande stappen.<ol>
<li>Selecteer de dikte van de cel voor het laden van het monster op basis van de concentratie van de eiwitoplossing, de temperatuur die nodig is voor de meting en de beschikbare hoeveelheid oplossing. OPMERKING: In deze studie werden transparante kwartscontainers van 40 mm x 30 mm x 4 mm gebruikt.</li>
		<li>Reinig de cel herhaaldelijk, afwisselend fosfaatvrij afwasmiddel (zie Tabel van materialen), gedeïoniseerd water en 70% ethanol.</li>
		<li>Droog de cel in de heteluchtoven; niet hoger zijn dan 80 °C voor de kwartscellen.</li>
		<li>Laad 4 ml eiwitoplossing in de cel en sluit af met doppen. Gebruik wasfolie of een andere kit (zie Materiaaltabel) om de monstercellen af te dichten. OPMERKING: In deze studie werd 4,8 ml oplossing bij ~ 50 mg / ml gebruikt om voldoende verstrooiingsintensiteit te verkrijgen.</li>
		<li>Laad 4 ml dialysebuffer in een identieke container als het eiwitmonster en sluit af.</li>
		<li>Transporteer monsters naar de beamline, sluit de sluiter en betreed de spectrometer enclosure cave area34.</li>
		<li>Monteer de monstercel op de aluminium monsterhouder door de schroeven en de vasthoudplaten aan te draaien (figuur 2, linkerpaneel). OPMERKING: Men kan twee monstercellen tegelijkertijd monteren, aangezien voor alle monsters hetzelfde meetprotocol nodig is.</li>
		<li>Monteer het grafietmonster en/of het Al2O3-poedermonster dat in een identieke container als het eiwitmonster is geladen. Dit zijn normen van de SNS-NSE beamline support.</li>
		<li>Plaats de monsterhouder door deze voorzichtig in het blik van het temperatuurforceringssysteem te schuiven (TFS, zie Materiaaltabel). OPMERKING: TFS is de meest gebruikte monsteromgeving bij SNS-NSE en pompt droge lucht in de monsterbus om de gewenste temperatuur te bereiken (figuur 2, midden- en rechterpanelen).</li>
		<li>Sluit het TFS-deksel en stel de temperatuur in op de gewenste waarde door naar het interactieve scherm van de TFS te gaan.</li>
		<li>Monteer de neutronencamera (zie Materiaaltabel) voor de uitlijning van de monsters op de bundel.</li>
		<li>Veeg de instrumentbehuizing schoon, evacueer, sluit de deuren en open de balksluiter. OPMERKING: Voorbeeldcellen worden geleverd door de SNS-NSE beamline-ondersteuning. Voor beschikbare voorbeeldcellen en de voorbeeldomgevingsbibliotheek verwijzen wij u naar de SNS-NSE beamline webpagina 7,35.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verzamel de NSE-gegevens volgens de onderstaande stappen.<ol>
<li>Lijn het monster in de neutronenbundel uit met behulp van de neutronencamera en de vier onafhankelijke monsteropeningen.</li>
		<li>Open de SNS-NSE-software voor gegevensverzameling36 en verzamel steekproefstatistieken door diffractiescans uit te voeren voor de gewenste verstrooiingshoeken en golflengte.</li>
		<li>Stel de meetparameters in op basis van de statistieken die voor elk monster zijn verzameld door de meetmacro's te bewerken die door de assisterende instrumentwetenschapper zijn verstrekt.</li>
		<li>Begin met scannen door de protocolnaam bij de opdrachtprompt te typen en echo's voor het voorbeeld te verkrijgen.</li>
		<li>Begin met scannen en verkrijg echo's ook voor de elastische referentie en het gebufferde oplosmiddel. Voer intermitterende bundelsluiterbewerking uit voor de monsterwissel.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig02.jpg"> Figuur 2: NSE meetsysteem. Linkerpaneel: eiwitoplossingsmonsters in kwartscontainer gemonteerd met schroeven en platen op de aluminium (Al) monsterhouder. De Al monsterhouder biedt de mogelijkheid om twee monsters tegelijkertijd in de monsteromgeving te monteren. Middenpaneel: Het monster van het temperature forcing system (TFS) kan worden gemonteerd in de monsterfase, het neutronenbundelvenster bevindt zich aan de rechterkant, terwijl de neutronencamera die wordt gebruikt voor uitlijning aan de linkerkant zichtbaar is. Rechterpaneel: het plaatsen van de monsterhouder met twee monsters in het monster kan werken met silicium (Si) vensters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
5. NSE-gegevensreductie
OPMERKING: SNS-NSE is uitgerust met een speciale software genaamd DrSpine (datareductie voor spin-echo)37,38 beschikbaar op de ORNL Neutron Sciences Remote Analysis Cluster, een Quick User Guide en ingebouwde helpondersteuning.
<ol><li>Log in op Neutron Sciences Remote Analysis Cluster (zie Tabel met materialen) met de ORNL-gebruikersreferenties en druk op de knop Sessie starten .</li>
	<li>Stel de software voor gegevensreductie in volgens de onderstaande stappen.<ol>
<li>Open in de gebruikersmap een terminalvenster en typ: source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh.</li>
		<li>Typ vervolgens: drspine_create_env.sh.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maak een map voor de gegevensreductie in de basismap en kopieer de meegeleverde scripts en macro's uit de gedeelde map.</li>
	<li>Bewerk, hernoem en sla de opgegeven reductiemacro dienovereenkomstig op.</li>
	<li>Typ drspine bij de opdrachtprompt en druk op enter om de softwarereductieomgeving te starten.</li>
	<li>Typ "de naam van de reductiemacro" die is bewerkt bij stap 5.4. in de opdrachtprompt in de softwareomgeving en druk op Enter.</li>
</ol>6. NSE-gegevensaanpassing
<ol><li>Bewerk het python-script "stapler-drspine.py", verstrekt door de assisterende Instrument Scientist, met de namen van de gereduceerde bestandsgegevens. OPMERKING: Het python-script is vrij beschikbaar voor gebruikers van het instrument.</li>
	<li>Bewerk de functie die past in de meegeleverde bibliotheek.</li>
	<li>Typ de naam van het bewerkte script "stapler-drspine.py" in de opdrachtprompt en druk op Enter om gereduceerde NSE-gegevens te lezen, te passen en te plotten. OPMERKING: De Instrument Scientist zal een sjabloon leveren voor de reductiemacro en het python-script "stapler-drspine.py" dat NSE-gereduceerde gegevens kan lezen en passen. De uiteindelijke gereduceerde NSE-gegevens zijn in ASCII-formaat en kunnen worden gelezen door verschillende voorkeurssoftware.</li>
</ol>

<ol><li>Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFitter%2C+J+%22Neutron+Scattering+in+Biology%3A+Techniques+and+Applications%22">Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications</a>. , New York. (2006).</li>
<li>Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+spin-echo+and+TOF+reveals+protein+dynamics+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Physical+Society+of+Japan%22%5BJournal%5D)">Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 82, (2013).</li>
<li>Inoue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+domain+fluctuations+on+50-ns+timescale+enable+catalytic+activity+in+phosphoglycerate+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Large domain fluctuations on 50-ns timescale enable catalytic activity in phosphoglycerate kinase.</a> Biophysical Journal. 99 (7), 2309-2317 (2010).</li>
<li>Callaway, D. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+activation+of+nanoscale+dynamics+in+a+disordered+protein+alters+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Controllable activation of nanoscale dynamics in a disordered protein alters binding kinetics.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (7), 987-998 (2017).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Biehl, R., Changwoo, D., Richter, D., Stadler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+internal+friction+by+osmolyte+interaction+in+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Reduced internal friction by osmolyte interaction in intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (1), 292-296 (2020).</li>
<li>Monkenbusch, M., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+neutron+spectroscopy-a+tool+for+the+investigation+of+dynamics+of+polymers+and+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Physique%22%5BJournal%5D)">High resolution neutron spectroscopy-a tool for the investigation of dynamics of polymers and soft matter.</a> Comptes Rendus Physique. , (2007).</li>
<li>Richter, D., Monkenbusch, M., Schwahn, D. Neutron Scattering. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRichter%2C+D+%22Polymer+Science%3A+A+Comprehensive+Reference%2C+10+Volume+Set%22">Polymer Science: A Comprehensive Reference, 10 Volume Set</a>. , (2012).</li>
<li>Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+CC+%22Single+Crystal+Neutron+Diffraction+From+Molecular+Materials%22">Single Crystal Neutron Diffraction From Molecular Materials</a>. , World Scientific. Singapore. (2000).</li>
<li>Marshall, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarshall%2C+W+%22Theory+of+thermal+neutron+scattering%22">Theory of thermal neutron scattering</a>. , Oxford University Press. (1971).</li>
<li>Roger Pynn Introduction & Neutron Scattering &#34;Theory&#34. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf">https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf</a> (2004).</li>
<li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+scattering+in+polymer+physics%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+B%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Neutron scattering in polymer physics.</a> Physica B: Condensed Matter. 276-278, 22-29 (2000).</li>
<li>Harroun, T. A., Wignall, G. D., Katsaras, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+scattering+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neutron+Scattering+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutron scattering for biology.</a> Neutron Scattering in Biology. , (2006).</li>
<li>SNS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/sna">https://neutrons.ornl.gov/sna</a> (2020).</li>
<li>HFIR. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/hfir">https://neutrons.ornl.gov/hfir</a> (2020).</li>
<li>CNCS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/cncs">https://neutrons.ornl.gov/cncs</a> (2020).</li>
<li>Perticaroli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+hydration+water+in+protein+%28green+fluorescent+protein%29+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Description of hydration water in protein (green fluorescent protein) solution.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (3), 1098-1105 (2017).</li>
<li>Perticaroli, S., Nickels, J. D., Ehlers, G., Sokolov, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigidity%2C+secondary+structure%2C+and+the+universality+of+the+boson+peak+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rigidity, secondary structure, and the universality of the boson peak in proteins.</a> Biophysical Journal. 106 (12), 2667-2674 (2014).</li>
<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+flexibility+change+in+cytochrome+p450cam+substrate+binding+determined+by+neutron+scattering%2C+NMR%2C+and+molecular+dynamics+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Coupled flexibility change in cytochrome p450cam substrate binding determined by neutron scattering, NMR, and molecular dynamics simulation.</a> Biophysical Journal. 103 (10), 2167-2176 (2012).</li>
<li>Mamontov, E., Zamponi, M., Hammons, S., Keener, W. S., Hagen, M., Herwig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BASIS%3A+A+new+backscattering+spectrometer+at+the+SNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neutron+News%22%5BJournal%5D)">BASIS: A new backscattering spectrometer at the SNS.</a> Neutron News. 19 (3), 22-24 (2008).</li>
<li>Mamontov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+diffusion+processes+measured+in+living+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microscopic diffusion processes measured in living planarians.</a> Scientific Reports. 9, 8708(2018).</li>
<li>Alpert, Y., Cser, L., Faragó, B., Franěk, F., Mezei, F., Ostanevich, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+flexibility+in+pig+immunoglobulin+G+studied+by+neutron+spin-echo+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Segmental flexibility in pig immunoglobulin G studied by neutron spin-echo technique.</a> Biopolymers. 24 (9), 1769-1784 (1985).</li>
<li>Bu, Z., Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D., Callaway, D. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+protein+domain+motion+in+Taq+polymerase+revealed+by+neutron+spin-echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (49), 17646-17651 (2005).</li>
<li>Biehl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+correlated+interdomain+motion+in+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Direct observation of correlated interdomain motion in alcohol dehydrogenase.</a> Physical Review Letters. 101, 138102(2008).</li>
<li>Farago, B., Li, J., Cornilescu, G., Callaway, D. J. E., Bu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+nanoscale+allosteric+protein+domain+motion+revealed+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activation of nanoscale allosteric protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 99 (10), 3473-3482 (2010).</li>
<li>Bu, Z., Callaway, D. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+propagation+of+long-range+allosteric+signals+by+nanoscale+protein+domain+motion+revealed+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamic propagation of long-range allosteric signals by nanoscale protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 100 (3), 223(2011).</li>
<li>Hong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+a+compact+state+of+a+multidomain+protein%2C+the+mercuric+ion+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of a compact state of a multidomain protein, the mercuric ion reductase.</a> Biophysical Journal. 107 (2), 393-400 (2014).</li>
<li>Longeville, S., Stingaciu, L. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+diffusion+and+the+dynamics+of+oxygen+capture+by+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin diffusion and the dynamics of oxygen capture by red blood cells.</a> Scientific Reports. 7, 10448(2017).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+antibody+fragment+motion%3A+Flexible+linkers+act+as+entropic+spring%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring.</a> Scientific Reports. 6, 22148(2016).</li>
<li>Hahn, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+induction+due+to+free+larmor+precession%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Nuclear induction due to free larmor precession.</a> Physical Review. 77, 297(1950).</li>
<li>Hahn, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+echoes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Spin echoes.</a> Physical Review. 80, 580(1950).</li>
<li>Svergun, D. I., Koch, M. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+scattering+studies+of+biological+macromolecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution.</a> Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735-1782 (2003).</li>
<li>Sasview. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sasview.org">https://www.sasview.org</a> (2020).</li>
<li>Zhao, J. K., Gao, C. Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extended+Q-range+small-angle+neutron+scattering+diffractometer+at+the+SNS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The extended Q-range small-angle neutron scattering diffractometer at the SNS.</a> Journal of Applied Crystallography. 43, 5 PART 1 1068-1077 (2010).</li>
<li>Ohl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-resolution+neutron+spin-echo+spectrometer+for+the+SNS+with+%CF%84+%E2%89%A5+1+%C2%B5s%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+B%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">The high-resolution neutron spin-echo spectrometer for the SNS with τ ≥ 1 µs.</a> Physica B: Condensed Matter. 350, 147-150 (2004).</li>
<li>SNS-NSE web page. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/nse">https://neutrons.ornl.gov/nse</a> (2022).</li>
<li>Ohl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spin-echo+spectrometer+at+the+Spallation+Neutron+Source+%28SNS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Instruments+and+Methods+in+Physics+Research%2C+Section+A%3A+Accelerators%2C+Spectrometers%2C+Detectors+and+Associated+Equipment%22%5BJournal%5D)">The spin-echo spectrometer at the Spallation Neutron Source (SNS).</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 696, 85-99 (2012).</li>
<li>Zolnierczuk, P. A., Holderer, O., Pasini, S., Kozielewski, T., Stingaciu, L. R., Monkenbusch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+data+extraction+from+neutron+time-of-flight+spin-echo+raw+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Efficient data extraction from neutron time-of-flight spin-echo raw data.</a> Journal of Applied Crystallography. 52 (5), 1022-1034 (2019).</li>
<li>Dr Spine hub. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine">https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine</a> (2022).</li>
<li>Stadler, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+nanosecond+dynamics+in+the+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (19), (2014).</li>
<li>FZJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs">https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs</a> (2022).</li>
<li>KWS2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://miz-garching.de/kws-2">https://miz-garching.de/kws-2</a> (2022).</li>
<li>Moorhouse, M., Barry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+databank%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+Biocomputing+and+Perl%22%5BJournal%5D)">The protein databank.</a> Bioinformatics Biocomputing and Perl. , (2005).</li>
<li>Tria, G., Mertens, H. D. T., Kachala, M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+ensemble+modelling+of+flexible+macromolecules+using+X-ray+solution+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering.</a> IUCrJ. 2 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Holderer, O., Monkenbusch, M., Schätzler, R., Kleines, H., Westerhausen, W., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JCNS+neutron+spin-echo+spectrometer+J-NSE+at+the+FRM+II%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II.</a> Measurement Science and Technology. 90 (4), 043107(2008).</li>
<li>Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+internal+protein+dynamics+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Exploring internal protein dynamics by neutron spin echo spectroscopy.</a> Soft Matter. 7 (4), 1299-1307 (2011).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+antibody+fragment+motion%3A+Flexible+linkers+act+as+entropic+spring%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring.</a> Scientific Reports. 6, 22148(2016).</li>
<li>Stadler, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+nanosecond+dynamics+in+the+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6987-6994 (2014).</li>
<li>Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+internal+protein+dynamics+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Slow internal protein dynamics in solution.</a> Journal of Physics: Condensed Matter. 26 (50), 503103(2014).</li>
<li>Hinsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+modeling+toolkit%3A+A+new+approach+to+molecular+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular modeling toolkit: A new approach to molecular simulations.</a> Journal of Computational Chemistry. 21 (2), 79-85 (2000).</li>
<li>Uhlenbeck, G. E., Ornstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+theory+of+the+Brownian+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">On the theory of the Brownian motion.</a> Physical Review. 36 (5), 823(1930).</li>
<li>Wang, M. C., Uhlenbeck, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+theory+of+the+Brownian+motion+II%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">On the theory of the Brownian motion II.</a> Reviews of Modern Physics. 17, 323(1945).</li>
<li>Callaway, D. J. E., Bu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+protein+domain+motion+and+long-range+allostery+in+signaling+proteins-a+view+from+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoscale protein domain motion and long-range allostery in signaling proteins-a view from neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Reviews. 7 (2), 165-174 (2015).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+scattering+function+for+macromolecules+in+solution+probed+by+neutron+spin+echo%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Intermediate scattering function for macromolecules in solution probed by neutron spin echo.</a> Physical Review E. 95, 020501(2017).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-time+dynamics+of+proteins+in+solutions+studied+by+neutron+spin+echo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Short-time dynamics of proteins in solutions studied by neutron spin echo.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 42, 147-156 (2019).</li>
</ol>

De auteur verklaart geen concurrerende financiële belangen en geen belangenconflicten. De inhoud van het manuscript is gebaseerd op de lezing die de auteur presenteerde in de HANDS-Neutron Scattering Applications in Structural Biology School tussen 2019-2021.

NSE-spectroscopie levert een uniek en gedetailleerd beeld van de dynamiek van eiwitten, die andere spectroscopische technieken niet kunnen produceren. Metingen over een uitgebreide tijdschaal bieden waarnemingen van zowel de translationele als de rotatiediffusie van de eiwitten, zoals hier gepresenteerd. De segmentale dynamica en andere interne oscillaties openbaren zich als een sterk verval van de coherente verstrooiingsfunctie S(Q, t) op een korte tijdschaal en zijn goed gescheiden van de algehele diffusionale...

Indringende dynamiek van zachte materie met neutronen Het onderzoeken van de dynamische eigenschappen van eiwitten en peptiden is een belangrijk onderdeel van biofysisch onderzoek, en er bestaan tegenwoordig veel goed ontwikkelde methoden om toegang te krijgen tot een breed scala aan energielandschappen1. Het relateren van de experimenteel onthulde dynamiek van de eiwitten aan hun biologische functie is een veel moeilijkere taak, waarvoor complexe wiskundige modellen en computerondersteunde dynamicasimulaties nodig zijn. Het belang van neutronenspectroscopie voor de analyse van eiwitbewegingen is benadrukt in verschillende goed ontvangen en algemeen erkende studies 1,2,3,4,5. Alvorens het diverse energielandschap van interne eiwitdynamica te verkennen, is een kort overzicht nodig van de dynamische processen in zachte materie en hoe neutronen er toegang toe kunnen krijgen.
De gevoeligheid van neutronen voor isotopische configuratie en het type interacties dat ze vertonen met zachte materie maakt neutronenverstrooiing een van de meest veelzijdige onderzoekstechnieken6. Er is een breed spectrum van correlatielengteschalen en correlatietijden waartoe neutronen toegang hebben, van nucleaire excitaties en atomaire trillingen tot collectieve bewegingen en langzame ontspanningsprocessen zoals isotrope rotaties en diffusieve bewegingen. Bij het onderzoeken van de verstrooide neutronen op hun energieoverdracht kunnen drie hoofdinteracties worden onderscheiden: de elastische verstrooiing, waarbij er geen energie-uitwisseling plaatsvindt tussen inkomend neutron en deeltje in het monster; de inelastische verstrooiing, met een grote, kwantificeerbare energie-uitwisseling tussen neutron en deeltje; en het eigenaardige geval van quasi-elastische verstrooiing dat een zeer kleine energieoverdracht aanduidt in vergelijking met de invallende neutronenenergie 1,7. Deze interacties geven nauwkeurige informatie over het onderzochte materiaal en vormen de theoretische basis van een breed scala aan neutronenverstrooiingstechnieken.
Bij elastische verstrooiing registreert de detector de richtingen van de neutronen als een diffractiepatroon, dat de positie van de monsteratomen ten opzichte van elkaar weergeeft. Informatie over de correlaties van atomaire posities wordt verkregen (d.w.z. geïntegreerde intensiteit S(Q) met betrekking tot de impulsoverdracht Q, die alleen betrekking heeft op structurele informatie). Dit principe vormt de basis van neutronendiffractie8.
Complexiteit ontstaat wanneer de energieoverdracht niet langer nul is als gevolg van excitaties en interne fluctuaties in het monstermateriaal. Dit vormt de basis van neutronenspectroscopie, waarbij de verstrooide neutronen worden onderzocht als functie van zowel de energieoverdracht E als de impulsoverdracht Q. Dynamische en structurele informatie wordt verkregen. Neutronenspectroscopie meet dezelfde geïntegreerde intensiteit S(Q) voor energieoverdracht (d.w.z. snelheidsverandering van de neutronen als gevolg van monsterverstrooiing, S(Q,ω) = S(Q, E), die ook wel de dynamische structuurfactor wordt genoemd)9.
Voor het berekenen van de verstrooiing van een materiaal is het adequater om de paarcorrelatiefunctie 7,10 te gebruiken. In het geval van diffractie geeft de statische paarcorrelatiefunctie G(r) de kans om het centrum van een deeltje op een bepaalde afstand r van het centrum van een ander deeltje te vinden. De spectroscopie generaliseert de statische paarcorrelatiefunctie en neemt energie/ frequentie / tijd op in de verstrooiingsvergelijking. De paarcorrelatiefunctie G(r) wordt een functie van tijd G(r, t), die kan worden ontleed in een afzonderlijke atoompaarcorrelatiefunctie GD(r, t) en een zelfcorrelatiefunctie GS(r, t). Deze beschrijven twee soorten correlaties: paar-gecorreleerde bewegingen van atomen die de coherente verstrooiing regelen, en zelfcorrelatie die de onsamenhangende verstrooiing regelt10.
Coherente verstrooiing is de verstrooiing van "het gemiddelde" en is afhankelijk van de relatieve fase van de verstrooide golven. In het verstrooiingsregime met een kleine hoek interfereren de verstrooide neutronengolven uit verschillende verstrooiingscentra (verschillende atomen) constructief (hebben vergelijkbare fasen) en de collectieve beweging van de atomen wordt waargenomen met een sterke intensiteitsverbetering. Coherente verstrooiing beschrijft in wezen de verstrooiing van een enkel neutron uit alle kernen in het monster10.
Wanneer er geen constructieve interferentie optreedt tussen de verstrooide neutronengolven uit verschillende centra, wordt een enkel atoom in de tijd gevolgd en wordt de zelfcorrelatie tussen de positie van het atoom op tijdstip t = 0 en hetzelfde atoom op tijdstip t waargenomen. Zo gaat de informatie over de relatieve posities van atomen verloren en ligt de focus alleen op lokale fluctuaties. Verstrooiing door lokale fluctuaties regeert onsamenhangende verstrooiing. Onsamenhangende verstrooiing is isotroop, draagt bij aan het achtergrondsignaal en degradeert de signaal-naar-ruis 10,11.
Door al het bovenstaande te combineren, onderscheiden we vier belangrijke neutronenverstrooiingsprocessen10: (1) elastisch coherent (meet de correlaties van atomaire posities), (2) inelastisch coherent (meet collectieve bewegingen van atomen), (3) elastische onsamenhangende (draagt bij aan de achtergrond, vermindert de verstrooiingsintensiteit door Debye-Waller-factor (DWF) en meet elastische onsamenhangende structuurfactor (EISF), waarbij de geometrie van diffusieve bewegingen in beperkte geometrie wordt beschreven, en (4) inelastisch onsamenhangend (meet de dynamiek van één atoom en zelfcorrelatie).
Dynamische processen waartoe neutronen in de biologie toegang hebben, variëren van de demping van laagfrequente atomaire en moleculaire trillingen, de interactie van oplosmiddelmoleculen met biooppervlakken en diffusieprocessen in de hydratatielaag van macromoleculen en beperkte geometrie, tot translatie-, rotatie- en tuimelende diffusieve bewegingen op korte afstand, en eiwitdomeinen en allosterische bewegingen1 . De grote diversiteit aan neutronenmethoden en -instrumenten voor het meten van eiwitdynamica is gebaseerd op hoe de achromatisatie van de invallende of uitgaande neutronenbundel wordt bereikt en hoe de energieanalyse van de verstrooide neutronen wordt uitgevoerd. Van drie-as tot time-of-flight, backscattering en spin-echo spectrometers, men kan dynamische processen verkennen met karakteristieke tijden tussen 1 x 10-14 s en 1 x 10-6 s (femtoseconden tot microseconden)12.
Oak Ridge National Laboratory, met zijn twee gerenommeerde neutronenbronnen, de Spallation Neutron Source - SNS13 en de High Isotope Flux Reactor - HFIR14, heeft een van de beste suites van spectrometers voor het onderzoeken van dynamica in biomaterialen. Enkele van de meest sprekende voorbeelden zijn het gebruik van de koude neutronenhakspectrometer (CNCS) bij SNS15 om de dynamische verstoring van hydratatiewater rond groen fluorescerend eiwit in oplossing16 of de sub-picoseconde collectieve trillingen van verschillende eiwittente onderzoeken 17. Een terugkerend probleem van inelastisch neutronenverstrooiingsonderzoek is dat sommige biologische processen te traag zijn om te worden waargenomen. Zonder extreme opstellingen die leiden tot een enorm verlies van neutronenintensiteit, zijn time-of-flight spectrometers beperkt tot een energieresolutie van 10 μeV, wat overeenkomt met een maximale tijdschaal van ~ 200 ps10,11. Dit is niet voldoende om grootschalige bewegingen in eiwitten waar te nemen. Daarom zijn instrumenten met een hogere energieresolutie zoals de backscattering spectrometers vaak nodig. Het combineren van de time-of-flight en backscattering-technieken is krachtig gebleken voor het onderzoeken van de verandering in interne dynamiek van Cytochrome P450cam (CYP101), een enzym dat de hydroxylering kamfer18 katalyseert.
Microscopische diffusiviteit gemeten door de backscattering spectrometer op SNS-BASIS19 was verrassend goed gedefinieerd en kon worden gescheiden in de diffusiviteit van water (hydratatie, cytoplasmatisch en bulkachtig water) en de diffusiviteit van celbestanddelen in planaire platwormen, het eerste levende dier dat werd bestudeerd door neutronenverstrooiing20 . Backscattering is een spectroscopische techniek met hoge resolutie, maar het is ook beperkt tot meerdere μeV = enkele nanoseconden, terwijl de langzame dynamiek in biomaterialen zich ook manifesteert als de overlevingstijd van correlatie tussen atomaire positie of spinoriëntaties (bijvoorbeeld ontspanningsprocessen, die regelmatig plaatsvinden in het tijdsbereik van tien tot honderden nanoseconden).
Neutronenspinechospectroscopie (NSE) is de enige neutronenverstrooiingstechniek die zo'n hoge resolutie bereikt. In tegenstelling tot andere neutronentechnieken vereist NSE geen achromatisatie van de bundel, omdat het de kwantummechanische fase van de neutronen gebruikt, wat hun magnetische momenten zijn. De manipulatie van magnetische momenten maakt het gebruik van een brede neutronenbundelgolflengteverdeling mogelijk, terwijl de techniek gevoelig is voor zeer kleine neutronensnelheidsveranderingen in de orde van 1 x 10-4. NSE is met succes gebruikt om de langzame dynamiek van eiwitten in oplossing voor veel eiwitten te onderzoeken. Onder deze vele pioniersstudies erkennen we de studie van de segmentale flexibiliteit van varkensimmunoglobuline21; de gekoppelde domeinbewegingen in Taq polymerase22; de domeinbewegingen in het tetrameer van gistalcoholdehydrogenase23; de verandering van conformatie in fosfoglyceraatkinase op substraatbinding3; de activering van domeinbewegingen en de dynamische voortplanting van allosterische signalen in de Na+/H+ exchange regulatory cofactor 1 (NHERF1) eiwit 4,24,25; de dynamiek van een compacte toestand van mercurische ionenreductase26; en de diffusie van hemoglobine in rode bloedcellen27. Twee meer recente studies in eiwitdynamica hebben de flexibiliteit van humaan antilichaam Immunoglobuline G (IgG) als een entropische lenteblootgelegd 28 en de kenmerken van oplosmiddelbijdrage aan de dynamiek van intrinsiek ongeordend myeline-basiseiwit (MBP)5.
In dit artikel worden de basisprincipes van NSE uitgelegd, de meerdere voorbereidende methoden die worden aanbevolen voor een grondig eiwitdynamica-onderzoek, evenals de methodologie en het experimentele protocol voor NSE-gegevensverzameling bij de NSE-spectrometer bij SNS, SNS-NSE. Het protocol karakteriseert twee eiwitten: IgG, een regulier menselijk antilichaameiwit, en het intrinsiek ongeordende eiwit MBP. De biofysische implicaties, de onderzoeksrelevantie van de voorbeelden en de beperkingen van de techniek worden kort besproken.
NSE-spectroscopie, de methode voor langzame dynamicametingen NSE is een gepolariseerde techniek die de neutronentijd van de vlucht gebruikt om de uitwisseling van energie (verlies van polarisatie) te meten als gevolg van de quasi-elastische interactie tussen neutronen en atomen in een monster. In de kern van NSE-spectroscopie liggen twee basisprincipes: (1) het vermogen van de neutronenspin om in het magnetisch veld te precesseren met een frequentie die evenredig is met de magnetische sterkte <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61862/61862eq01.jpg" style="margin: auto;">, namelijk de Larmor-frequentie29, en (b) de spin-echo of Hann-echo, die de manipulatie en heroriëntatie van het polarisatiesignaal vertegenwoordigt bij het toepassen van een reeks radiofrequente pulsen30.
De basisprincipes van het NSE-proces kunnen worden samengevat in een paar eenvoudige stappen 6,11 met behulp van figuur 1. (1) De neutronenbundel geproduceerd door de bron (positie 1) is gepolariseerd (positie 2), geleid en getransporteerd (positie 3) en komt aan bij de ingang van de NSE-spectrometer, waar deze 90° wordt gedraaid door de eerste pi-halve flipper (positie 4). (2) De gepolariseerde bundel (bijv. magnetische neutronenmomenten) wordt loodrecht op de magnetische veldlijnen van de eerste magneet (eerste precessiezone, positie 5) en begint te precesseren. (3) Aan het einde van de magneet accumuleren neutronenspins een bepaalde precessiehoek die evenredig is met de magnetische veldsterkte en de tijd van de vlucht die erin wordt doorgebracht (in principe omgekeerd evenredig met de neutronensnelheid). De individuele neutronensnelheden worden gecodeerd binnen hun precessiehoek aan het einde van de eerste precessiezone. (4) Dicht bij de monsterpositie keert de pi-flipper (positie 6) de oriëntatie van de spin met 180° om, waardoor het teken van de precessiehoek verandert. (5) De neutronen interageren met de moleculen van het monster (positie 7) en raken verstrooid. (6) De verstrooide neutronen komen binnen en precesseren in de tweede precessiezone (positie 8), maar worden omgekeerd georiënteerd. (7) Een andere pi-halve flipper (positie 9) wordt gebruikt om de oriëntatie van de spin loodrecht op de horizontale richting te draaien. Dit zal de precessie stoppen, waardoor de precessiehoek φ wordt vertaald in polarisatie evenredig met cos(φ). (8) De analysator (positie 10) selecteert de neutronen op basis van één oriëntatie. Als de interactie met het monster elastisch is, zal de snelheid van het neutron niet veranderen. De neutronen zullen een identieke hoeveelheid tijd doorbrengen met vliegen in de eerste en tweede precessiezones en de geaccumuleerde precessiehoeken zijn volledig hersteld. De volledige polarisatie wordt hersteld op de detector (positie 11) als een echo van de oorspronkelijke polarisatie (d.w.z. spin-echo). (9) In NSE is de verstrooiing echter quasi-elastisch, zodat een kleine energie-uitwisseling tussen neutronen en monstermoleculen leidt tot verschillende neutronensnelheden na verstrooiing door het monster. Door de verschillende snelheden zullen de neutronen een extra tijd door de tweede precessiezone vliegen en hun precessiehoek niet goed hebben hersteld. Een gedeeltelijke polarisatie wordt op de detector opgehaald en het verlies van polarisatie als gevolg van spinrelaxatie is evenredig met de cos-Fourier-transformatie van de spectrale functie S(Q, ω), de tussenliggende verstrooiingsfunctie F(Q, t). (10) De tijdparameter van de functie F(Q, t) is evenredig met de magnetische veldsterkte van de precessie. Het scannen van het verlies van polarisatie als functie van de magnetische veldsterkte levert daarom een ontspanningsfunctie op die afhankelijk is van de dynamische processen in het monster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig01.jpg"> Figuur 1: Foto van de NSE spectrometer bij SNS (SNS-NSE) en neutronenvliegpad schematisch met de belangrijkste functionele componenten. Van rechts naar links: 1 = neutronenbron; 2 = choppers-bender-polarisator-secundair sluitersysteem; 3 = balktransportgeleiders; 4 = pi/2 flipper voor de eerste 90° spin-turn; 5 = eerste precessiezone; 6 = pi flipper voor 180° spin-turn; 7 = monstergebied en monsteromgeving (hier wordt de cryo-oven getoond); 8 = tweede precessiezone; 9 = pi/2 flipper voor tweede 90° spin-turn; 10 = analyser; 11 = detector. (Merk op dat delen van 3, evenals 2 en 1, zich achter de blauwe muur binnen de afscherming bevinden; de choppers worden vervangen door een snelheidskeuzeschakelaar voor reactorgebaseerde NSE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Bovine MBP protein solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1891</td><td>lyofilisaat opgelost in&nbsp; D2O</td></tr><tr><td>D2O - heavy water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Productnr. 151882</td><td>vloeistof</td></tr><tr><td>De-ionized water</td><td>in house</td><td>-</td><td>voor het wassen / schoonmaken van cellen</td></tr><tr><td>DLS instrument</td><td>Zetasizer Nano ZS, FZ-J&uuml;lich</td><td>-</td><td>dynamisch lichtverstrooiingsinstrument</td></tr><tr><td>Elastic scattering standards</td><td>SNS-NSE, ORNL</td><td>-</td><td>Al2O3&nbsp; en Grafiet poeders</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>65350-M</td><td>70% ethanol voor het reinigen van cellen</td></tr><tr><td>IgG protein solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4506</td><td>lyofilisaat opgelost in&nbsp; D2O</td></tr><tr><td>KWS-2 instrument</td><td>JCNS uitstation bij de MLZ,&nbsp; Garching, Duitsland</td><td>-</td><td>kleinhoek neutron instrument</td></tr><tr><td>Liquinox vaatwasmiddel</td><td>Alconox</td><td>-</td><td>Fosfaatvrij vloeibaar labglaswerkreiniger</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Productnr.S9390</td><td>dinatriumfosfaat heptahydraat zout</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Productnr.S9888</td><td>natriumchloride zout</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Productnr. S9638</td><td>mononatriumfosfaat monohydraat zout</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Catalogusnummer:&nbsp;ND-2000</td><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrofotometer</td></tr><tr><td>Neutron alignment camera</td><td>NeutronOptics, Grenoble</td><td>NOG210222</td><td>100 x 100 mm camera met Sony IMX249 CMOS sensor</td></tr><tr><td>Parafilm M - wax parafilm</td><td>Bemis</td><td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td><td>veelzijdige laboratoriumfolie in kartonnen dispenser</td></tr><tr><td>Phoenix-J-NSE Spectrometer</td><td>JCNS uitstation bij de MLZ,&nbsp; Garching, Duitsland</td><td>-</td><td>neutronspectrometer</td></tr><tr><td>SasView</td><td>https://www.sasview.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAXSpace, Anton Paar instrument</td><td>FZ-J&uuml;lich</td><td>-</td><td>kleinhoek röntgen instrument</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer dialysemembranen</td><td>Thermo Scientific</td><td>88400-88405</td><td>Slide-A-Lyzer mini dialyseapparaten buizen van 3,5 K MWCO</td></tr><tr><td>SNS Remote Analysis Cluster</td><td>Neutron Science Remote Analysis (sns.gov)</td><td>https://analysis.sns.gov</td><td></td></tr><tr><td>SNS-NSE spectrometer</td><td>ORNL, Oak Ridge, TN, VS</td><td>-</td><td>neutronspectrometer</td></tr><tr><td>Steriele spuitfilters</td><td>VWR</td><td>N.A. PN:28145-501</td><td>filters met 0,2 &micro;m poriëngrootte</td></tr><tr><td>Temperature Forcing System (TFS)</td><td>SP Scientific</td><td>Onderdeelnummer 100004055</td><td>monsteromgevingsapparatuur</td></tr><tr><td>Urea -d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Productnr. 176087</td><td>gedeutereerd ureumzout</td></tr><tr><td>Viscometer</td><td>FZ-J&uuml;lich</td><td>-</td><td>vallen bol viscometer</td></tr></tbody></table>

studie van eiwitdynamica via neutronenspinechospectroscopie

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

De activiteit en functionaliteit van de meeste menselijke lichaamseiwitten zijn gerelateerd aan configuratieveranderingen van hele subdomeinen binnen de eiwitkristalstructuur. De kristalstructuren vormen de basis voor elke berekening die de structuur of dynamiek van een eiwit beschrijft, meestal met sterke geometrische beperkingen. Deze beperkingen van de kristalstructuur zijn echter niet aanwezig in de oplossing. De structuur van de eiwitten in de oplossing kan verschillen van het kristal als gevolg van herschikkingen van lussen of subdomeinen op de pico- naar nanosecondetijdschaal (d.w.z. het interne tijdsregime van de eiwitdynamica). Het huidige werk beschrijft hoe slow motions op tijdschalen van enkele tientallen nanoseconden toegankelijk zijn met behulp van neutronenverstrooiing. In het bijzonder wordt de dynamische karakterisering van twee belangrijke menselijke eiwitten, een intrinsiek ongeordend eiwit dat een goed gedefinieerde secundaire structuur en een klassiek antilichaameiwit mist, aangepakt door neutronenspinechospectroscopie (NSE) in combinatie met een breed scala aan laboratoriumkarakteriseringsmethoden. Verdere inzichten in eiwitdomeindynamica werden verkregen met behulp van wiskundige modellering om de experimentele neutronengegevens te beschrijven en de cross-over tussen gecombineerde diffusieve en interne eiwitbewegingen te bepalen. De extractie van de interne dynamische bijdrage aan de intermediaire verstrooiingsfunctie verkregen van NSE, inclusief de tijdschaal van de verschillende bewegingen, maakt verder zicht mogelijk op de mechanische eigenschappen van afzonderlijke eiwitten en de zachtheid van eiwitten in hun bijna natuurlijke omgeving in de overvolle eiwitoplossing.

IgG-eiwit uit humaan serum en runder-MBP-eiwitten werden gereconstitueerd in hoge concentraties (~ 50 mg / ml) in D2O-base buffers. Omdat de eiwitten in hoge concentraties werden opgelost, waren de verkregen oplossingen overvolle eiwitoplossingen. De met NSE onderzochte dynamiek lijdt onder de drukke omgeving waarin de eiwitten zich bevinden (structuurfactorinteracties en hydrodynamische effecten)5,28,39. DLS werd uit...

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van de structuur en dynamiek van twee modeleiwitten die een belangrijke rol spelen in de menselijke gezondheid. De techniek combineert bench-top biofysische karakterisering met neutronenspinechospectroscopie om toegang te krijgen tot de dynamiek op tijd- en lengteschalen die relevant zijn voor eiwitinterdomeinbewegingen.

Studie van eiwitdynamica via neutronenspinechospectroscopie

Most human body proteins' activity and functionality are related to configurational changes of entire subdomains within the protein crystal structure. The ...

Het volgende protocol presenteert hoe een Neutron Spin Echo-experiment kan worden opgezet om de intermediaire verstrooiingsfunctie te meten en de dynamiek van eiwitten in oplossing te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van Neutron Spin Echo Spectroscopie is het vermogen om te kijken naar herschikking van eiwitdomeinen en subdomeinen op de pico naar nanoseconde tijdschaal; dat is het bereik van slow motions in eiwitten in hun bijna natuurlijke omgeving en in de drukke eiwitoplossing. Neutron Spin Echo is ook gevoelig voor isotopische configuratie, wat zeer specifieke en gerichte studies mogelijk maakt met behulp van contrastmatching.Inzicht in eiwitdomeindynamiek is een belangrijk onderdeel van biofysisch onderzoek in de voortdurende moeilijke taak om de domeinbewegingen van de eiwitten door te geven met hun biologische functionaliteit. Het hier gepresenteerde protocol kan over het algemeen worden toegepast op elke neutronenspinechometing die wordt uitgevoerd op de SNS-NSE-spectrometer, ongeacht uw keuze van monsters, als men binnen het rijk van zachte materiematerialen blijft. Om het experiment op te zetten, begint u met het selecteren van de dikte van de celmonsterbelasting, op basis van de concentratie van het eiwitmonster, de temperatuur die nodig is voor de meting en de beschikbare hoeveelheid oplossing.Reinig de cel met fosfaatvrij afwasmiddel, gedeïoniseerd water en 70% diethanol. Droog de cel in de heteluchtoven. Laad vier milliliter eiwitoplossing in de cel en sluit af met doppen.Gebruik wasfolie of een andere kit om de monstercellen af te dichten. Laad vier milliliter dialysebuffer in een identieke container als het eiwitmonster en sluit af. Transporteer monsters naar de balklijn.Sluit de sluiter en betreed de grot van de spectrometer. Monteer de monstercel op de aluminium monsterhouder door de schroeven en de vasthoudplaten aan te draaien. Monteer het grafietmonster en het aluminiumoxidepoedermonster in een identieke container als het eiwitmonster.Plaats dezelfde houder door deze voorzichtig in het blik van het temperatuurforceringssysteem te schuiven. Sluit het deksel van het temperatuurforceringssysteem en stel de temperatuur in op de gewenste waarde door naar het interactieve scherm van het temperatuurforceringssysteem te gaan. Monteer de neutronencamera voor de uitlijning van de monsters op de bundel.Om de neutronenspine-echospectroscopiegegevens te verzamelen, lijnt u het monster uit in de neutronenbundel met behulp van de neutronencamera en de vier onafhankelijke monsteropeningen. Open de Spallation Neutron Source, Neutron Spin Echo Spectroscopy data collection software, en verzamel monsterstatistieken door defraction scans uit te voeren voor de gewenste verstrooiingshoeken en golflengte. Stel de meetparameters in op basis van de statistieken die voor elk monster zijn verzameld door de meetmacro's van de Assisting Instrument Scientist te bewerken.Begin met scannen door de protocolnaam bij de opdrachtprompt te typen en echo's voor het voorbeeld te verkrijgen. Log in op neutron sciences remote analysis cluster met de ORNL gebruikersreferenties en druk op de startsessie knop. Open in de gebruikersmap een terminalvenster en typ de opdracht software-instelling.Typ vervolgens de opdracht omgeving. Maak een map voor de gegevensreductie in de basismap en kopieer de meegeleverde scripts en macro's uit de gedeelde map. Bewerk, hernoem en sla de opgegeven reductiemacro dienovereenkomstig op.Typ drspine" bij de opdrachtprompt en druk op Enter om de softwarereductieomgeving te starten. Typ de naam van de reductiemacro in de opdrachtprompt in de softwareomgeving en druk op Enter. Bewerk het Python-script van de Assisting Instrument Scientist met de namen van de gereduceerde bestandsgegevens.Bewerk de functie die past in de meegeleverde bibliotheek. Typ de naam van het bewerkte script bij de opdrachtprompt en druk op Enter om gereduceerde NSE-gegevens te lezen, te passen en te plotten. De intermediaire verstrooiingsfunctie gemeten door NSE voor IgG- en MBP-eiwitten toont een duidelijke afwijking van een eenvoudig diffusie-achtig ontspanningsproces op de korte tijdschaal van vier jaar, wat de toegankelijkheid van eiwitinwendige dynamica door NSE aangeeft, en de behoefte aan een complexer model om de waargenomen dynamische processen te beschrijven.De resultaten van tussentijdse verstrooiingsfunctieberekeningen met atomaire modellering van beide eiwitten met behulp van modellen ontwikkeld door waren in uitstekende overeenstemming met de experimentele NSE-gegevens. De resultaten toonden aan dat langzamere dynamiek waargenomen bij langere furriertijden kan worden toegeschreven aan de algemene translationele en rotatiediffusieprocessen, terwijl de dynamiek waargenomen op de korte tijdschalen kan worden toegeschreven aan de dynamiek van eiwitdomeinen. Een belangrijk ding om te onthouden is de noodzaak van goed voorbereide en schone monsters voor NSE-metingen.Een goed monster voor een Spin Echo heeft een flip ratio hoger dan drie, wat de verhouding is tussen coherente en onsamenhangende verstrooiing van het monster. Ook tijdens de monstervoorbereiding en het laden van monsters in de NSE-cellen moet de monsteroplossing veilig en vrij van chemische of biologische kruisbesmetting worden bewaard. Om veiligheidsredenen mag de ingang in de spectrometerbehuizing alleen worden geprobeerd nadat de sluiter is gesloten en is een extra half uur tijd toegestaan voor stralingskoeling van de behuizing.Small-Angle Neutron Scattering wordt aanbevolen om de vorm en de structuur van eiwitten in een geconcentreerde oplossing te beoordelen. Het kan voor of parallel met het NSE-experiment. Aanvullende methoden zoals dynamische lichtverstrooiing en viscositeitsmetingen geven informatie over de translatiediffusie en de hydrodynamische interactie binnen de geconcentreerde eiwitoplossing, en worden ook aanbevolen.

study-of-protein-dynamics-via-neutron-spin-echo-spectroscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

Techniek

Eiwitconformatie en dynamiek zijn de sleutel tot het begrijpen van de relatie tussen eiwit structuur en functie. Waterstofwisselproces combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie is een veelzijdige methode om de conformationele dynamica van proteïnen en karakteriseren eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties, zoals contact interfaces en allosterische effecten.

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

Hier wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van het protocol dat in het laboratorium is geïmplementeerd voor de verwerving en analyse van 15N-ontspanningsdispersieprofielen door oplossing NMR-spectroscopie.

15 N CPMG Ontspanningsdispersie voor het onderzoek van eiwitconformatiedynamiek op de μs-ms tijdschaal

Dit artikel beschrijft de protocollen voor monstervoorbereiding, gegevensreductie en gegevensanalyse in neutronenspinecho (NSE) studies van lipidemembranen. Verstandige deuteriumetikettering van lipiden maakt toegang tot verschillende membraandynamiek op mesoscopische lengte- en tijdschalen mogelijk, waarover vitale biologische processen plaatsvinden.

Neutron Spin Echo Spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties

Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie kan de structurele eiwitdynamica op een residuspecifieke manier karakteriseren. We bieden een hands-on protocol voor het opnemen van NMR 15N, R1 en R2 relaxatie en {1H}-15N heteronucleair Overhauser effect (hetNOE) experimenten, gevoelig voor de picoseconden tot nanoseconden tijdschaal.

NMR 15N relaxatie-experimenten voor het onderzoek van de picoseconde tot nanoseconde structurele dynamica van eiwitten

Een echo particle image velocimetry (EPIV) systeem dat in staat de overname van twee-dimensionale velden van snelheid in optisch ondoorzichtige vloeistoffen of via optisch ondoorzichtige geometrieën wordt beschreven, en validatie metingen in pijpstroming worden gerapporteerd.

Echo Particle Image Velocimetry

Het algemene doel van deze methode is het bepalen van de lage-energie elektronische structuur van vaste stoffen bij ultralage temperaturen met behulp van hoekopgeloste foto-emissie spectroscopie met synchrotron straling.

Hoekopgeloste foto-emissie spectroscopie bij ultralage temperaturen

De gradiënt echo geheugen is een protocol voor het opslaan van optische quantum toestanden van licht in atomaire ensembles. Quantum geheugen is een belangrijk element van een quantum repeater, die het bereik van de quantum key distribution kan uitbreiden. Schetsen we de werking van de regeling wanneer geïmplementeerd in een 3-niveau atomaire ensemble.

Gradient Echo Quantum Memory in Warm Atomic Vapor

Een shearcel ontwikkeld voor kleine-hoek neutronenverstrooiing metingen in de snelheid-snelheidsgradiënt vlak van afschuiving en wordt gebruikt om complexe fluïda te karakteriseren. Ruimtelijk opgeloste metingen in de snelheidsgradiënt richting mogelijk zijn voor het bestuderen van shear-banding materialen. Toepassingen zijn onder andere onderzoeken van colloïdale dispersies, polymeeroplossingen, en zelf-geassembleerde structuren.

Meten Materiaal microstructuur Onder Flow Met behulp van 1-2 Plane Flow-Lage hoek neutronenverstrooiing

Er is vooruitgang geboekt bij het gebruik van spin-echo resolved grazing incidence scattering (SERGIS) als neutronenverstrooiingstechniek om de lengteschalen in onregelmatige monsters te onderzoeken. Kristallieten van [6,6]-fenyl-C61-boterzuurmethylester zijn onderzocht met behulp van de SERGIS-techniek en de resultaten bevestigd door optische en atoomkrachtmicroscopie.

Neutron Spin Echo Resolved Grazing Incidence Scattering gebruiken om organische zonnecelmaterialen te onderzoeken

Leer hoe u een Neutron Spin Echo-experiment opzet om eiwitdynamica in oplossing te bestuderen. Deze methode maakt observatie van domeinherordening op pico- tot nanosecondeschaal mogelijk.

Studie van eiwitdynamica via neutronenspinechospectroscopie

Meer video's verkennen