Name: Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Leer hoe axotomized retinale ganglionneuronen uit ratten worden gecocultiveerd met olfactorische omhullende glia om axonale regeneratie te bestuderen. Deze methode evalueert het neuroregeneratief vermogen van OEG voor toepassingen in celtherapie bij zenuwletsels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door project SAF2017-82736-C2-1-R van Ministerio de Ciencia e Innovación tot MTM-F en door Fundación Universidad Francisco de Vitoria aan JS.

OPMERKING: Dierproeven werden goedgekeurd door nationale en institutionele bio-ethiekcomités.
1. ihOEG (Ts12 en Ts14) cultuur
OPMERKING: Deze procedure wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast voor weefselkweek.
<ol><li>Bereid 50 ml ME10 OEG-kweekmedium voor zoals vermeld in tabel 1.</li>
	<li>Bereid 5 ml DMEM/F12-FBS, zoals vermeld in tabel 1,in een conische buis van 15 ml.</li>
	<li>Verwarm beide media op 37 °C in een schoon waterbad, gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Ontdooi Ts12- en Ts14-cellenflacons bij 37 °C in een schoonwaterbad.</li>
	<li>Resuspend en voeg cellen toe aan het DMEM/F12-FBS kweekmedium, bereid in stap 2.</li>
	<li>Centrifugeren gedurende 5 minuten bij 200 x g.</li>
	<li>Ambieer de supernatant.</li>
	<li>Voeg 500 μL ME10 medium toe en resuspend de pellet.</li>
	<li>Bereid een p60 celkweekschaal met 3 ml ME10 en voeg de cellulaire suspensie dropwise toe.</li>
	<li>Ga naar de gelijkmatige verdeling van de cellen over de plaat.</li>
	<li>Kweekcellen bij 37 °C in 5% CO2. OPMERKING: Na het bereiken van de samenvloeiing moet ten minste een andere passage worden gedaan om cellen voor cocultuur te optimaliseren. 90% samenvloeiing is nodig voordat ze op de coverslips voor cocultuur worden gezaaid. Een confluent p-60 heeft een gemiddeld celnummer van 7 x 105 voor Ts14 en 2,5 x 106 voor Ts12 cellijnen. Ts12- en Ts14-cellijnen moeten elke 2-3 dagen worden doorgesneden.</li>
</ol>2. Voorbereiding van ihOEG (Ts12 en Ts14) voor de test
OPMERKING: Deze stap moet 24 uur vóór RGN-dissectie en cocultuur worden uitgevoerd.
<ol><li>Behandel 12 mm Ø coverslips met 10 μg/ml poly-L-lysine (PLL) gedurende 1 uur. OPMERKING: De coverslips kunnen 's nachts worden achtergelaten in de PLL-oplossing.</li>
	<li>Was de coverslips drie keer met 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Maak Ts12- en Ts14 ihOEG-cellen los van de p60-celkweekschotel.<ol>
<li>Voeg 4 ml DMEM/F12-FBS kweekmedium (tabel 1) toe aan een conische buis van 15 ml. Warm op 37 °C in een schoon waterbad.</li>
		<li>Verwijder het medium van platen en was de cellen eenmaal met 1 ml 1x PBS-EDTA.</li>
		<li>Voeg 1 ml trypsine-EDTA toe aan de OEG-cellen en incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 °C, 5% CO2.
</li>
		<li>Verzamel cellen met een p1000 pipet en breng ze over naar medium bereid in stap 3.1.</li>
		<li>Centrifugeren gedurende 5 minuten bij 200 x g.</li>
		<li>Ambieer de supernatant.</li>
		<li>Voeg 1 ml ME10 medium toe en resuspend de pellet.</li>
		<li>Tel het celnummer in een hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zaad 80.000 Ts14 cellen of 100.000 Ts12 cellen/put op de coverslips in 24-put platen in 500 μL ME10 medium.</li>
	<li>Kweekcellen bij 37 °C in 5% CO2, gedurende 24 uur.</li>
</ol>3. Netvliesweefseldissectie
OPMERKING: 2 maanden oude mannelijke Wistar ratten worden gebruikt als RGN bron. Twee netvliezen (één rat) voor 20 putten van een 24-put celschaal. Autoclaaf chirurgisch materiaal voor gebruik. Papain dissociatie kit wordt commercieel gekocht(Tafel van Materialen). Volg de instructies van de provider voor reconstitutie. Reconstitueer D,L-2-amino-5-fosfonovaleric zuur (APV) in 5 mM voorraad en bereid de aliquots voor.
<ol><li>Bereid op de dag van de test de volgende media voor.<ol>
<li>Bereid een p60 cel kweekschaal met 5 ml koude EBSS (flacon 1 van de papaïne dissociatie kit).</li>
		<li>Bereid een p60 celkweekschaal met gereconstitueerde flacon 2 (papaïne) van de papaïnedissociatiekit plus 50 μL APV.  Voeg vervolgens 250 μL geconstitueerde flaconstituted vial 3 (DNase plus 5 μL APV) toe.</li>
		<li>Meng in een steriele buis 2,7 ml flacon 1 met 300 μL flacon 4 (albumine-ovomucoïde proteaseremmer). Voeg 150 μL flacon 3 (DNase) plus 30 μL APV toe.</li>
		<li>Bereid 20 ml Neurobasal-B27 medium (NB-B27) zoals vermeld in tabel 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Offer een rat op door verstikking met CO2.</li>
	<li>Verwijder het hoofd door onthoofding met guillotine; plaats het in een Petri-schaal van 100 mm en spuit de kop met ethanol 70% voordat u het in een laminaire stroomkap plaatst.</li>
	<li>Snijd de snorharen van de rat met een schaar zodat ze de oogmanipulatie niet verstoren.</li>
	<li>Pak de oogzenuw vast met een tang om de oogbol voldoende uit te trekken om een incisie over het oog te kunnen maken met een scalpel.</li>
	<li>Verwijder de lens en glasachtige humor en trek het netvlies (oranjeachtig weefsel) eruit, terwijl de resterende lagen van het oog binnen blijven (inclusief de pigmenteperiële laag).</li>
	<li>Plaats het netvlies in de p60 celkweekschaal bereid in stap 3.1.1.</li>
	<li>Breng het netvlies over op de p60 celkweekschaal bereid in stap 3.1.2 en snijd het met de scalpel in kleine stukjes van ongeveer 1 mm.</li>
	<li>Breng over in een plastic buis van 15 ml.</li>
	<li>Incubeer het weefsel gedurende 30 minuten, in een bevochtigde incubator bij 37 °C onder 5% CO2,met agitatie om de 10 minuten.</li>
	<li>Dissocieer celklompen door op en neer te pipetten met een glazen Pasteur pipet.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten op 200 x g.</li>
	<li>Gooi supernatant weg en om papaïne te inactiveren, resuspend de celkorrel in de oplossing bereid in stap 3.1.3. (1,5 ml voor 2 ogen).</li>
	<li>Pipet deze celsuspensie voorzichtig in 5 ml gereconstitueerde flacon 4.</li>
	<li>Centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder tijdens het centrifugeren het ME-10 medium volledig van de OEG 24 putcelplaat (eerder voorbereid in stap 2) en vervang het door 500 μL NB-B27 medium per put.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en breng de cellen opnieuw in 2 ml NB-B27 medium.</li>
	<li>Plaat 100 μL netvliescelsuspensie, per put van de m24-plaat, op met PLL behandelde of OEG monolagen-coverslips.</li>
	<li>Houd culturen aan op 37 °C met 5% CO2 gedurende 96 uur in NB-B27 medium.</li>
</ol>4. Immunostaining
<ol><li>Bevestig de cellen na 96 uur gedurende 10 minuten door hetzelfde volume van 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS toe te voegen aan het kweekmedium (600 μL) (PFA-eindconcentratie 2%).</li>
	<li>Verwijder de media en PFA van de 24-multiwell plaat en voeg opnieuw 500 μL paraformaldehyde (PFA) toe in 1x PBS. Incubeer gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Gooi de fixer weg en was 3 keer met 1x PBS gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Blok met 0,1% Triton X-100/1% FBS in PBS (PBS-TS) gedurende 30–40 min.</li>
	<li>Bereid de primaire antilichamen in PBS-TS buffer als volgt voor: SMI31 (tegen MAP1B en NF-H eiwitten) monoklonaal antilichaam (1:500). 514 (herkent MAP2A en B eiwitten) konijn polyklonaal antiserum (1:400).</li>
	<li>Voeg primaire antilichamen tegen coculturen toe en broed 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Gooi de volgende dag de antilichamen weg en was de coverslips 3 keer gedurende 5 minuten met 1x PBS.</li>
	<li>Bereid de secundaire antilichamen in PBS-TS buffer als volgt voor: Voor SMI-31, anti-muis Alexa Fluor 488 (1:500). Voor 514, anti-konijn Alexa-594 (1:500).</li>
	<li>Incubeer cellen met de bijbehorende fluorescerende secundaire antilichamen gedurende 1 uur, bij RT, in het donker.</li>
	<li>Was de coverslips met 1x PBS, 3 keer, gedurende 5 minuten, in het donker.</li>
	<li>Monteer tot slot coverslips met montagemedium(Materialentabel)en houd ze op 4 °C. OPMERKING: Indien nodig kunnen fluorescerende kernvlekken met DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindool) worden uitgevoerd. Voordat u de cellen monteert, moet u de cellen gedurende 10 minuten in het donker incuberen met DAPI (10 μg/ml in 1x PBS). Was de afdeklips 3 keer met 1x PBS en monteer ten slotte de afdeklips met het montagemedium.</li>
</ol>5. Axonale regeneratie kwantificering
OPMERKING: Monsters worden gekwantificeerd onder de doelstelling 40x van een epifluorescentiemicroscoop. Er moeten ten minste 30 foto's worden gemaakt op willekeurige velden, met ten minste 200 neuronen, die voor elke behandeling moeten worden gekwantificeerd. Elk experiment moet minimaal drie keer worden herhaald.
<ol><li>Kwantificeer het percentage neuronen met axon (SMI31 positief neuriet) ten opzichte van de totale populatie RGN's (geïdentificeerd met MAP2A/B 514 positieve immunostaining van neuronaal lichaam en dendrieten).</li>
	<li>Kwantificeer de axonale regeneratie-index of gemiddelde axonale lengte (μm/neuron). Deze parameter wordt gedefinieerd als de som van de lengtes (in μm) van alle geïdentificeerde axonen, gedeeld door het totale aantal getelde neuronen, ongeacht of ze een axon presenteerden of niet. Axonale lengte wordt bepaald met behulp van de plugin NeuronJ van de beeldsoftware ImageJ (NIH-USA).</li>
	<li>Bereken de gemiddelde, standaarddeviatie en statistische significantie met behulp van de juiste software.</li>
</ol>

<ol><li>Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair%3A+Its+significant+therapeutic+potential+and+prospectus%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus.</a> Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).</li>
<li>Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+therapy+for+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation therapy for spinal cord injury.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).</li>
<li>Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+olfactory+mesenchymal+stromal+cell+transplants+promote+remyelination+and+earlier+improvement+in+gait+coordination+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury.</a> Glia. 65 (4), 639-656 (2017).</li>
<li>Moreno-Flores, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+cell+line+from+immortalized+olfactory+ensheathing+glia+promotes+functional+recovery+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord.</a> Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).</li>
<li>Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair.</a> Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).</li>
<li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).</li>
<li>Su, Z., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells%3A+biology+in+neural+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration.</a> Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+for+spinal+cord+injury%3A+sniffing+out+the+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues.</a> Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).</li>
<li>Gómez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+spinal+cord+injury+with+olfactory+ensheathing+glia+cells+%28OECs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs).</a> Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).</li>
<li>Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+glia%3A+repairing+injury+to+the+mammalian+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system.</a> Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).</li>
<li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+olfactory+ensheathing+cells+restore+retinal+function+in+a+rat+model+of+light-induced+retinal+damage+by+inhibiting+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress.</a> Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).</li>
<li>Pastrana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+associated+with+adult+axon+regeneration+promoted+by+olfactory+ensheathing+cells%3A+a+new+role+for+matrix+metalloproteinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2.</a> The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).</li>
<li>Pastrana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+production+by+olfactory+ensheathing+cells+contributes+to+axonal+regeneration+of+cultured+adult+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons.</a> Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).</li>
<li>Simón, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+by+olfactory+ensheathing+glia+promotes+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration.</a> Glia. 59, 1458-1471 (2011).</li>
<li>Lim, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibly+immortalized+human+olfactory+ensheathing+glia+from+an+elderly+donor+maintain+neuroregenerative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity.</a> Glia. 58, 546-558 (2010).</li>
<li>García-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+senescence+progression+in+reversibly+immortalized+human+ensheathing+glia+permits+their+survival+after+deimmortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization.</a> Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).</li>
<li>García-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuroregenerative+human+ensheathing+glia+cell+line+with+conditional+rapid+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth.</a> Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).</li>
<li>Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+an+immortalized+olfactory+ensheathing+glia+cell+line+with+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29+gene%3A+Evaluation+of+its+neuroregenerative+capacity+as+a+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept.</a> Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).</li>
<li>Deumens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+of+glial+cells+stimulates+directional+neurite+growth+of+CNS+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro.</a> Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).</li>
<li>Chung, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+promote+neurite+sprouting+of+injured+axons+in+vitro+by+direct+cellular+contact+and+secretion+of+soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).</li>
<li>Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+olfactory+ensheathing+glia+promote+the+long-distance+growth+of+adult+retinal+ganglion+cell+neurites+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro.</a> Glia. 53 (5), 467-476 (2006).</li>
<li>Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+exert+a+trophic+effect+on+the+hypothalamic+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro.</a> Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).</li>
<li>Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+represent+an+optimal+substrate+for+hippocampal+neurons%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).</li>
<li>Runyan, S. A., Phelps, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+olfactory+ensheathing+glia+enhance+axon+outgrowth+on+a+myelin+substrate+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro.</a> Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).</li>
<li>Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+promote+corticospinal+axonal+outgrowth+by+a+L1+CAM-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism.</a> Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).</li>
<li>Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell-free+adult+canine+olfactory+ensheathing+cell+preparations+from+olfactory+bulb+and+mucosa+display+differential+migratory+and+neurite+growth-promoting+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro.</a> BMC Neuroscience. 14, 141(2013).</li>
<li>Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cell-neurite+alignment+enhances+neurite+outgrowth+in+scar-like+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures.</a> Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).</li>
<li>Wigley, C. B., Berry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+adult+rat+retinal+ganglion+cell+processes+in+monolayer+culture%3A+comparisons+between+cultures+of+adult+and+neonatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons.</a> Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).</li>
<li>Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+olfactory+nerve+ensheathing+cells+are+effective+promoters+of+adult+central+nervous+system+neurite+outgrowth+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture.</a> Glia. 25 (3), 256-269 (1999).</li>
<li>Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+olfactory+ensheathing+cell+signaling+mechanisms%3A+effects+on+their+support+for+neurite+regrowth+from+adult+CNS+neurons+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture.</a> Glia. 44 (3), 232-241 (2003).</li>
<li>Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+and+interactions+between+phenotypic+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+in+promoting+CNS+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration.</a> Glia. 50 (1), 12-20 (2005).</li>
<li>Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+olfactory+ensheathing+glia+promote+axonal+regeneration+of+rat+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).</li>
<li>García-Escudero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+olfactory+mucosa+cells+but+not+lung+or+skin+fibroblasts+mediate+axonal+regeneration+of+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons.</a> Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li>
<li>Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+a+site-specific+phosphorylation+of+the+microtubule-associated+protein+2+during+the+development+of+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons.</a> Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).</li>
<li>Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+cell+purification+and+determination+of+cell+purity%3A+crucial+aspects+of+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+for+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair.</a> Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

OEG-transplantatie op CZS-letselplaatsen wordt beschouwd als een veelbelovende therapie voor CZS-letsel vanwege de constitutieve pro-neuroregeneratieve eigenschappen7,8,9. Afhankelijk van de weefselbron — reukslijmvlies (OM-OEG) versus reukbol (OB-OEG)— of de leeftijd van de donor bestaat er echter aanzienlijke variatie in dergelijke capaciteit26,31,<sup class...

Volwassen centrale zenuwstelsel (CZS) neuronen hebben beperkte regeneratieve capaciteit na letsel of ziekte. Een gemeenschappelijke strategie ter bevordering van CZS-regeneratie is transplantatie, op de plaats van verwonding, van celtypen die axonale groei induceren, zoals stamcellen, Schwann-cellen, astrocyten of reukverwarmende gliacellen (OEG)1,2,3,4,5.
OEG is afgeleid van de neurale top6 en bevindt zich in het reukslijmvlies en in de reukbol. Bij volwassenen sterven reuksensorische neuronen regelmatig als gevolg van blootstelling aan het milieu en worden ze vervangen door nieuw gedifferentieerde neuronen. OEG omringt en begeleidt deze nieuwe reuk-axonen om de reukbol in te voeren en nieuwe synapsen met hun doelen in de CNS7vast te stellen. Vanwege deze fysiologische eigenschappen is OEG gebruikt in modellen van CZS-letsel zoals ruggenmerg- of oogzenuwletsel en zijn neuroregeneratieve en neuroprotectieve eigenschappen worden bewezen8,9,10,11. Verschillende factoren zijn geïdentificeerd als verantwoordelijk voor de pro-regeneratieve kenmerken van deze cellen, waaronder extracellulaire matrix proteasenproductie of afscheiding van neurotrofe en axonale groeifactoren12,13,14.
Gezien de technische beperkingen om primaire OEG-cellen uit te breiden, hebben we eerder omkeerbare vereeuwigde menselijke OEG (ihOEG) clonale lijnen opgericht en gekenmerkt, die een onbeperkte toevoer van homogene OEG bieden. Deze ihOEG-cellen zijn afkomstig van primaire culturen, bereid uit reukbollen verkregen in autopsies. Ze werden vereeuwigd door transductie van de telomerase katalytische subeenheid (TERT) en de oncogene Bmi-1 en gewijzigd met het SV40-virus groot T-antigeen15,16,17,18. Twee van deze ihOEG-cellijnen zijn Ts14, die de regeneratieve capaciteit van de oorspronkelijke culturen behoudt en Ts12, een lage regeneratieve lijn die wordt gebruikt als een lage regeneratiecontrole in deze experimenten18.
Om het OEG-vermogen te beoordelen om axonale regeneratie na neurale verwonding te bevorderen, zijn verschillende in vitro modellen geïmplementeerd. In deze modellen wordt OEG toegepast op culturen van verschillende neuronale oorsprong en worden neurietvorming en rek - als reactie op glia-cocultuur - getest. Voorbeelden van dergelijke neuronale bronnen zijn neonatale rat corticale neuronen19, kraswonden uitgevoerd op rat embryonale neuronen uit corticale weefsel20, rat retinale explants21, rat hypothalamus of hippocampale postnatale neuronen22,23, postnatale rat dorsale wortel ganglion neuronen24,postnatale muis corticospinale tractus neuronen25, menselijke NT2 neuronen26, of postnatale cerebrale corticale neuronen op reactieve astrocyte litteken-achtige culturen27.
In deze modellen is de regeneratietest echter gebaseerd op embryonale of postnatale neuronen, die een intrinsieke plasticiteit hebben die afwezig is bij gewonde volwassen neuronen. Om dit nadeel te overwinnen, presenteren we een model van volwassen axonale regeneratie in coculturen van OEG-lijnen met volwassen retinale ganglionneuronen (RGNs), gebaseerd op het model oorspronkelijk ontwikkeld door Wigley et al.28,29,30,31 en gewijzigd en gebruikt door onze groep12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kortom, netvliesweefsel wordt geëxtraheerd uit volwassen ratten en verteerd met papaïne. Retinale celsuspensie wordt vervolgens geplateerd op met polylysine behandelde coverslips of op Ts14- en Ts12-monolagen. Culturen worden gedurende 96 uur bewaard voordat ze worden gefixeerd en vervolgens wordt immunofluorescentie uitgevoerd voor axonale (MAP1B- en NF-H-eiwitten)34 en somatodendritische (MAP2A en B)35 markers. Axonale regeneratie wordt gekwantificeerd als een percentage neuronen met axon, met betrekking tot de totale populatie RGN's en de axonale regeneratie-index wordt berekend als de gemiddelde axonale lengte per neuron. Dit protocol is niet alleen nuttig voor het beoordelen van het neuroregeneratieve potentieel van ihOEG, maar kan worden uitgebreid naar verschillende bronnen van OEG of andere gliacellen.

<table><tbody><tr><td>antibody 514</td><td>Reference 34</td><td></td><td>Konijn polyklonaal antiserum, dat MAP2A en B herkent.</td></tr><tr><td>antibody SMI-31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Monoklonaal antilichaam tegen MAP1B en NF-H eiwitten</td></tr><tr><td>anti-muis Alexa Fluor 488 antilichaam</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>anti-konijn Alexa Fluor 594 antilichaam</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-2-amino-5-fosfonovalerinezuur</td><td>Sigma</td><td>283967</td><td>NMDA-receptorremmer</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Fluorescente kleuring van kernen</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>Celkweekmedium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>11573397</td><td>Foetaal runderserum</td></tr><tr><td>FBS-Hyclone</td><td>Fisher Scientific</td><td>16291082</td><td>Foetaal runderserum</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Montagemedium</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH-USA)</td><td></td><td>Afbeeldingssoftware</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE17-605F</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Neuronale celkweekmedium</td></tr><tr><td>Papaïne dissociatiesysteem</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Voor gebruik bij neurale celisolatie</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Huisgemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-EDTA</td><td>Lonza</td><td>H3BE02-017F</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine/Amphotericin B</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>Bacteriostatisch en bactericide</td></tr><tr><td>Hypofyse-extract</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>Rund hypofyse-extract</td></tr><tr><td>Poly -L- lysine (PLL)</td><td>Sigma</td><td>A-003-M</td><td></td></tr></tbody></table>

cocultuur van axotomized rat retinal ganglion neurons met olfactory ensheathing glia, als een in vitro model van volwassen axonale regeneratie

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactorische ensheathing glia (OEG) cellen zijn gelokaliseerd helemaal van het reukslijmvlies tot en in de reukzenuwlaag (ONL) van de reukbol. Gedurende het hele volwassen leven zijn ze de sleutel tot de axonale groei van nieuw gegenereerde reukneuronen, van de lamina propria tot het ONL. Vanwege hun pro-regeneratieve eigenschappen zijn deze cellen gebruikt om axonale regeneratie in ruggenmerg- of oogzenuwletselmodellen te bevorderen.
We presenteren een in vitro model om OEG neuroregeneratieve capaciteit na neurale verwonding te testen en te meten. In dit model wordt reversibel vereeuwigd menselijk OEG (ihOEG) gekweekt als een monolaag, netvliezen worden geëxtraheerd uit volwassen ratten en retinale ganglionneuronen (RGN) worden samengecultiveerd op de OEG-monolaag. Na 96 uur worden axonale en somatodendritische markers in RGN's geanalyseerd door immunofluorescentie en wordt het aantal RGN's met axon en de gemiddelde axonlengte/neuron gekwantificeerd.
Dit protocol heeft het voordeel ten opzichte van andere in vitro tests die afhankelijk zijn van embryonale of postnatale neuronen, dat het OEG neuroregeneratieve eigenschappen in volwassen weefsel evalueert. Het is ook niet alleen nuttig voor het beoordelen van het neuroregeneratieve potentieel van ihOEG, maar kan worden uitgebreid naar verschillende bronnen van OEG of andere gliacellen.

In dit protocol presenteren we een in vitro model om het neuroregeneratieve vermogen van OEG na neuronaal letsel te testen. Zoals getoond in figuur 1, is de OEG-bron een omkeerbare vereeuwigde menselijke OEG clonale cellijn -Ts14 en Ts12-, die afkomstig is uit primaire culturen, bereid uit reukbollen verkregen in autopsies15,17,18. Retinale weefsel wordt geëxtraheerd uit volwassen ratten, verteerd, ...

We presenteren een in vitro model om olfactorisch verwarmend glia (OEG) neuroregeneratief vermogen te beoordelen, na neuraal letsel. Het is gebaseerd op een cocultuur van axotomized volwassen retinale ganglion neuronen (RGN) op OEG monolagen en daaropvolgende studie van axonale regeneratie, door het analyseren van RGN axonale en somatodendritische markers.

Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Ons protocol is een eenvoudig en reproduceerbaar model om de capaciteit van olfactorische omhulselcellen te beoordelen om axonale regeneratie bij volwassenen te bevorderen. Dit is een kwantitatieve techniek die de evaluatie van de regeneratieve capaciteit van olfactorische omhulselcellen mogelijk maakt en die ook kan worden uitgebreid naar andere typen gliacellen. Deze techniek is de eerste stap om olfactorische omhulselcellen te bestuderen als kandidaat voor celtherapie bij zenuwbeschadigingen, vóór translatie naar in vivo- of klinische studies. Het demonstreren van de procedure zal Maria Portela zijn, een promovendus uit ons laboratorium.Begin door alle benodigde media voor te bereiden zoals beschreven in het tekstdocument. Na het doden van de rat, plaats het hoofd in een 100 milliliter Petri-schaal en spuit het met 70% ethanol voordat het in een laminaire werkbank wordt geplaatst. Snijd de snorharen van de rat met een schaar zodat ze niet interfereren met de manipulatie van het oog.Pak de oogzenuw met een pincet om het oog er genoeg uit te trekken om een incisie door het oog te maken met een scalpel. Verwijder de lens en het glasvocht en trek de netvlies uit, waarbij de resteren

coculture-axotomized-rat-retinal-ganglion-neurons-with-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit protocol beschrijven we een nieuwe methode om de invloed van de gliale cel heterogeniteit op axongroei studie met...

Studie gliale cel Heterogeniteit Invloed op Axon groei met een nieuwe methode Coculture

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

This video demonstrates the procedure to isolate retinal ganglion neurons (RGNs) from a rat's retina and coculture them with olfactory ensheathing glia (OEG) cells. This method allows for studying the neuro-regenerative potential of OEGs after neural injury.

Coculturing of Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia

This video demonstrates the coculturing model of a dorsal root ganglion explant and Schwann cells. In coculture conditions, ascorbic acid promotes the differentiation of Schwann cells into myelinating forms. Myelinating Schwann cells wrap the axons multiple times to create a myelin sheath, which is essential for nerve function.

Co-culturing of a Dorsal Root Ganglion Explant with Schwann Cells for Neuron Myelination

Source: Cheah, M., et al. Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a step-by-step procedure for injecting a viral suspension into the dorsal root ganglia (DRGs) and inducing a controlled axonal injury via a dorsal root crush in an anesthetized rat. The protocol involves exposing the DRGs, delivering a growth-promoting viral vector to facilitate axonal regeneration, and severing axonal...

Modeling Sensory Axon Regeneration in a Rat Using Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury

Source: Portela-Lomba, M., et. al. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates imaging and quantification of axonal regeneration in axotomized rat retinal ganglion neurons (RGNs) co-cultured with immortalized human olfactory ensheathing glia cells. RGNs are immunolabeled, with red somas and green axons. Images were captured using an epifluorescence microscope,...

Imaging and Quantification of Axonal Regeneration in Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons

Olfactorische ensheathing cellen (OECS) zijn neurale lijst cellen die de groei van de primaire olfactorische neuronen mogelijk te maken. Deze specifieke eigenschap kan worden gebruikt voor cellulaire transplantatie. We presenteren hier een model van cellulaire transplantatie gebaseerd op het gebruik van OECS in een laryngeal zenuwletsel model.

Transplantatie van olfactorische Ensheathing Cellen tot functioneel herstel Evalueer na perifere zenuwschade

Celkweekmodellen gedetailleerde controle milieuomstandigheden en dus een krachtig platform om verschillende aspecten van neuronale cel biologie. We beschrijven een snelle, goedkope en betrouwbare wijze te isoleren, dissociëren en cultuur sensorische neuronen van kippenembryo's. Details van de ondergrond voorbereiding en immuuncytochemie zijn ook aanwezig.

Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo

Dit protocol presenteert het gebruik van een dorsale wortelganglion (DRG) injectie met een virale vector en een gelijktijdige dorsale wortelbeschadiging bij een volwassen rat als een model om sensorische axonregeneratie te bestuderen. Dit model is geschikt voor het onderzoeken van het gebruik van gentherapie om sensorische axonregeneratie te bevorderen.

Ganglion Injection en dorsale Root crush als een model voor Sensory Axon Regeneration

In het cocultuursysteem van dorsale wortelganglia en Schwann-cellen kan myelinisatie van het perifere zenuwstelsel worden bestudeerd. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om perifere myelinisatie te observeren en te kwantificeren en om de effecten van interessante verbindingen op de myelineschede te bestuderen.

In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen

Leer hoe axotomized retinale ganglionneuronen uit ratten worden gecocultiveerd met olfactorische omhullende glia om axonale regeneratie te bestuderen. Deze methode evalueert het neuroregeneratief vermogen van OEG voor toepassingen in celtherapie bij zenuwletsels.

Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie (Video) | JoVE Journal

Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie

Meer video's verkennen