Een Antegrade Perfusie methode voor Cardiomyocyt isolatie van muizen
19 mei 2021
We ontwikkelden een simple-methode voor het isoleren van hoogwaardige individuele muishartcellen door de antegrade perfusietechniek. Deze methode is Langendorff-vrij en nuttig voor het isoleren van ventriculaire en atriale myocyten of interstitiële cellen, zoals hartfibroseblasten of voorlopers.
We ontwikkelden een eenvoudige Langendorff-vrije methode voor het isoleren van individuele muishartcellen door middel van een antegrade verpakkingstechniek. Deze methode maakt de isolatie van hartcellen van juveniele tot oudere muizen mogelijk. Op Langendorff gebaseerde retrograde perfusie wordt beschouwd als een gouden standaard voor het isoleren van cardiale myocyten bij verschillende proefdieren.
Cannulatie van de LTA is echter technisch moeilijk bij muizen vanwege hun kleine formaat. Voor de oogst van het muizenhart, na het bevestigen van euthanasie en het scheren van de buik, opent u de borstholte snel om het hart bloot te stellen en gebruikt u een plastic transferpipet met de punt gesneden tot ongeveer de grootte van het hart om het hart in de pipet te zuigen. Til de pipet op om voldoende ruimte te creëren om een gebogen schaar in te brengen en gebruik de schaar om het hart van de dorsale kant te verwijderen en zorg ervoor dat de atria niet wordt beschadigd.
Plaats het hart onmiddellijk in een glazen bekerglas van 30 milliliter met ijskoude CIB-EGTA gedurende ongeveer één minuut. Wanneer de weeën zijn gestopt, plaatst u het hart in een kweekschaal van 35 milliliter met ijskoude CIB-EGTA en verwijdert u de long en ander zichtbaar weefsel. Plaats het ruw gereinigde hart op een hartstandaard gevuld met gekoelde CIB-EGTA apexzijde naar beneden en plaats de standaard onder een stereoscopische microscoop.
Verwijder het vet en bindweefsel rond de aorta. Als de lengte van de gesneden aorta te lang is, trimt u de aorta net onder de brachiocephalische slagader en oriënteert u het hart zodat het voorste oppervlak naar voren is gericht. Gebruik een pincet om het uiteinde van de aorta op te tillen en gebruik een kleine vasculaire klem om de aorta in de buurt van de atria te klemmen terwijl u zachtjes op de atria drukt.
Plaats vervolgens het geklemde hart op een perfusieplaat met de voorste kant naar boven gericht en hydrateer het hart met een paar druppels CIB-EGTA. Voor antegradeperfusie moet u een spuit van 20 milliliter met voorverwarmde CIB-EGTA, aangesloten op een flexibele verlengbuis en een gemarkeerde injectienaald, op de infuuspomp plaatsen en de pomp starten met een debiet van 0,5 milliliter per minuut. Wanneer de naald en de pomp zijn gevuld, plaatst u de injectienaald op de perfusieplaat met de kortere kant van de diagonale vorm vooraan en schuift u de naald totdat deze net de top van het hart raakt.
Steek de naald voorzichtig in de buurt van de top van de linkerventrikel in de ventriculaire kamer zonder de naald van de plaat te draaien of los te maken, let op de markering om de diepte van het inbrengen van de naald te schatten. Wanneer het inbrengen van de naald is voltooid, moet het bloed uit de kransslagader beginnen te stromen. Gebruik tape om de injectienaald op de plaat te bevestigen en verhoog de pompsnelheid tot één milliliter per minuut.
Als het hart met succes wordt doordrenkt, moet de stroom van de buffer in het capillair zichtbaar zijn net onder het epicardium. Vervang na twee tot drie milliliter CIB-EGTA-perfusie de perfusiebuffer door enzymmix. Nadat één tot twee milliliter is doordrenkt, verhoogt u de pompsnelheid tot 1,5 milliliter per minuut.
Gebruik een pipet om het opgehoopte bloedhoudende perfusaat dat uit het hart stroomt zo nodig te verwijderen en de perfusie te stoppen wanneer het totale volume van het doordrenkte enzym 10 milliliter bereikt. Breng aan het einde van de perfusie 10 milliliter enzymmix over van de spuit naar een kweekschaal van 60 millimeter op een verwarmingsmat en voeg 20 milligram BSA toe aan de schaal. Draai de schaal voorzichtig om het poeder op te lossen en verwijder de injectienaald en klem uit het hart.
Verwijder de ventrikels en atria uit het hart en plaats de weefsels in de met BSA aangevulde enzymmix. Om de ventriculaire myocyten te isoleren, gebruikt u twee paar pincet om het epicardium vast te pakken en de ventrikels voorzichtig in kleine stukjes te trekken. Wanneer alle ventrikelfragmenten zijn gegenereerd, verspreidt u de cellen ongeveer 30 keer met zachte pipetten en filtert u het onverteerd vuil door een 100 micron mesh celzeef in een centrifugebuis van 15 milliliter.
Na centrifugeren, resuspend de cardiomyocyt pellet in voorverwarmde CIB aangevuld met calcium en BSA en incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de cellen opnieuw en resuspend de neergeslagen cardiomyocyten in een geschikt volume van cel resuspensie oplossing voor hun onderhoud bij 37 graden Celsius tot downstream analyse. Om de atriale myocyten te isoleren, breng je de atria over in een container met voorverwarmde CIB aangevuld met calcium en BSA en scheur je de atria in stukken zoals aangetoond.
Gebruik een pipet van 20 microliter die is ingesteld op 10 microliter om de weefsels te verstoren door de gedissocieerde cellen te pipetten en te verzamelen door centrifugeren. Resuspend de atriale cel in een geschikt volume van cel resuspensie oplossing. In deze afbeelding kunnen vers geïsoleerde ventriculaire myocyten worden waargenomen.
Deze isolatieprocedure resulteert in een 70 tot 80% opbrengst van staafvormige quiescente ventriculaire myocyten van acht tot tien weken oude muizen binnen ongeveer vijf uur na isolatie. De verhouding van vers geïsoleerde levensvatbare cellen is lager bij muizen ouder dan twee jaar. De actiepotentiaal die in de ventriculaire en atriale myocyten wordt geregistreerd, is vergelijkbaar met die gemeten in cellen die zijn verkregen met de op Langendorff gebaseerde methode.
Immunostaining-analyse kan worden gebruikt om de organisatie van de sarctische structuur van de ventriculaire myocyten en de transformatie van de hartfibroblasten in myofibroblasten na subcultuur te beoordelen. Westerse vlekanalyse wordt aanbevolen om de specifieke expressie van eiwitten van belang in de atria en ventrikels na verwerking te bepalen. Na perfusie met enzymen kunnen eiwitten uit de atria en ventrikels gemakkelijk worden gehomogeniseerd in de lysisbuffer met lichte kracht voor eiwitextractie.
Het is belangrijk om de richting en de diepte van het inbrengen van de naald te regelen. Let er bij het inbrengen van de naald in de linkerventrikel op dat u het ventriculaire septum niet doorboort of de klep penetreert. U kunt de samenstelling van het perfusaat wijzigen, afhankelijk van het doel van het experiment.
Een EGTA-supplementeerd reinigingsmiddel kan bijvoorbeeld worden gebruikt om een celvrije steiger van het hart te maken.
Overzicht
Deze studie richt zich op de uitdaging van het isoleren van individuele hartcellen van muizen, wat essentieel is voor cardiaal onderzoek. De auteurs hebben een methode ontwikkeld zonder gebruik van Langendorff, waarbij antegrade perfusie wordt ingezet om efficiënt cellen te isoleren van muizen van verschillende leeftijden, waardoor de toegang tot specifieke cardiale celtypen aanzienlijk is verbeterd.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Isolatie van hartcellen
- Biologie van het muizenhart
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Traditionele Langendorff-methoden kennen technische moeilijkheden bij muizen vanwege hun geringe omvang.
- Celisolatie is essentieel voor het begrijpen van de hartfunctie en pathologie.
- De ontwikkeling van toegankelijke methoden is gunstig voor een breed scala aan cardiologische studies.
Gebruikte methoden
- Antegrade perfusietechniek
- Muismodel-systeem
- Gebruik van specifieke buffers en enzymen voor celdissociatie
Belangrijkste resultaten
- Efficiënte isolatie van ventriculaire en atriale myocardcellen met een hoge celviabiliteit (opbrengst van 70-80%).
- Celactiepotentialen die vergelijkbaar zijn met die verkregen via Langendorff-methoden.
- Gedetailleerde procedurele stappen voor een optimale celextractie.
Conclusies
- Deze studie presenteert een vereenvoudigde, effectieve methode voor het isoleren van hartcellen uit muizenharten.
- De aanpak is van belang voor het verder ontwikkelen van methodologieën voor hartonderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Efficiënte isolatie van levensvatbare cardiomyocyten uit muizenharten is een cruciale voorwaarde voor vroege ontdekking en mechanistische studies in cardiovasculair geneesmiddelenonderzoek. De antegrade perfusiemethode elimineert de technische barrières van Langendorff-gebaseerde retrograde perfusie, waardoor de toegang tot kwalitatief hoogwaardige hartcellen over een breder scala aan muizenleeftijden wordt vergroot. Deze mogelijkheid ondersteunt robuuste targetvalidatie en functionele assays, wat een direct effect heeft op het voorspellende vertrouwen in cardiovasculaire R&D-pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om hartspecifieke hypothesen te onderzoeken met behulp van vers geïsoleerde ventriculaire en atriale myocardcellen.
- Ondersteunt biologische risicovermindering door cellen met een hoge levensvatbaarheid te leveren voor functionele en moleculaire assays.
- Faciliteert mechanistische studies naar hartafgelijke celtypen, waardoor het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets wordt verbeterd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare isolatie van cardiomyocyten en fibroblasten voor de ontwikkeling van downstream-assays.
- Levert kwantitatieve celopbrengsten die geschikt zijn voor elektrofysiologische analyses en analyses van eiwitexpressie.
- Maakt de preparatie van gevalideerde hartcelsystemen mogelijk voor compoundscreening en functionele read-outs.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde cardiale modellen door isolatie uit muizen van alle leeftijden te ondersteunen, van juveniel tot oud.
- Handhaaft continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie met een consistente celkwaliteit en levensvatbaarheid.
- Ondersteunt translationele biomarkerstudies door compatibiliteit met immunokleuringen en Western blot-analyses.
Integratie van pipeline en workflow
Deze antegrade perfusiemethode integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door een betrouwbare bron van primaire hartcellen te bieden voor hypothesetoetsing, assayontwikkeling en mechanistische risicovermindering.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt robuuste toetsing van de nulhypothese en pathway-verduidelijking mogelijk met behulp van vers geïsoleerde cardiomyocyten.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve celpreparaten voor assay-standaardisatie en evaluatie van verbindingen.
- Analytica: Ondersteunt kwantitatieve read-outs zoals actiepotentiaalmetingen en eiwitexpressieprofilering.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert afstemming met ziektemodellen en biomarker-validatie via hoogwaardige celisolatie.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een schaalbaar, gestandaardiseerd protocol dat aanpasbaar is voor verschillende onderzoeksteams en modelsystemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van cardiale targets.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor de isolatie van cardiale cellen.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen cardiovasculaire portfolio's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering en de verdere ontwikkeling van cardiale ontdekkingsprogramma's.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist technische expertise in microsurgische dissectie en perfusie onder een stereomicroscoop.
- Toegang tot infusiepompen, verwarmingsmatten en analytische infrastructuur voor downstream-assays is noodzakelijk.
- Standaardisatie van perfusieparameters en celbehandelingsprotocollen tussen teams is vereist.
- Aanpasbaar aan verschillende muizenleeftijden, maar de celopbrengst en levensvatbaarheid kunnen afnemen bij oudere dieren.
- Zorgvuldige controle van de inbrengdiepte van de naald en de samenstelling van het perfusaat is essentieel voor de reproduceerbaarheid.
