Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Stimulated Raman scattering microscopie is een chemische beeldvormingstechnologie die de snelle en kwantitatieve detectie van lipiden mogelijk maakt en het mogelijk maakt lipiden bij levende dieren op een labelvrije manier te volgen. Het belangrijkste voordeel van SRS-microscopie ten opzichte van traditionele lipidendetectietechnieken is dat het labelvrij is en daarom niet zo duurzaam is voor het bleken van foto's als andere fluorescentie- en kleuringskwesties. Het gebruik van SRS-microscopie in combinatie met de genetische en biochemische hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor modelorganismen, met name Caenorhabditis elegans, biedt een krachtig kader voor het bestuderen van normale regulatoren van lipidebiologie en metabolisme.

Om laserstralen in de SRS-microscoop te voeren, stelt u eerst de periscoop in om de straal van een picoseconde lichtbronuitgang naar de infraroodlaserinvoerpoort op de scanner van de microscoop te tillen en opent u de laserbesturingssoftware om de lasers te starten. Verlaag het laservermogen van de pomp tot 50 milliwatt en stel het pompsignaal in op 750 nanometer. Gebruik een straalverzeter om de straaldiameter aan te passen aan de achtergrondopening van de microscoopdoelen.

Gebruik twee relaisspiegels, M1 en M2, om de laserstraal naar de periscoop te leiden en stel de knikken van de periscoop in het midden van het stembereik in. Selecteer de beginpositie en hoek van elke spiegel, zodat de laserstraal ongeveer het midden van de spiegel raakt om de straal in de microscoop te lanceren en een lege poort op de objectieve toren van de microscoop te gebruiken om de koersuitlijning uit te voeren. Plaats de vermogensmetersonde op de objectieve poort om het vermogen van het verzonden licht te meten en stel de scanner van de microscoop in op de hoogste zoom, 50X.

Meet het vermogen van het verzonden licht met de gerichte laserstraalspot en optimaliseer de knoppen van spiegels M1 en M2 iteratief om het hoogste overgedragen laservermogen te bereiken. Gebruik het uitlijngereedschap om de fijne uitlijning van het verzonden licht uit te voeren om ervoor te zorgen dat het licht door het midden van het objectief gaat en plaats de uitlijningsdop van het fluorescentiedoel op de lege objectieve stoel. Stel de knoppen van de eerste stuurspiegel, M1, in om de laserstraalspot te centreren en introduceer de verlengbuis met de uitlijningsdop aan de andere kant op een lege objectieve stoel voor het bewaken van de laserstraalspot.

Stem vervolgens de knoppen van de tweede stuurspiegel, M2, af om de laserstraalspot weer aan de andere kant van de verlengbuis te centreren. Om de SRS-detectiemodule in te stellen, plaatst u een bundelsplijterkubus achter de condensor om de verzonden laser naar de fotodiodemodule te leiden. Om de elektronicaverbinding in te stellen, gebruikt u een ingebouwde elektro-optische modulator van 20 megahertz in de picoseconde tune-able laser om de intensiteit van de Stokes-straal te moduleren en het uitgangssignaal van de fotodiode in de lock-in versterker te voeren voor demodulatie van het gestimuleerde Raman-verlies.

Voer vervolgens de lock-in versterkeruitgang in de analoge doos van de microscoop om het elektrische analoge signaal om te zetten in een digitaal signaal. Om de beeldvormingsomstandigheden te optimaliseren, voegt u vijf microliters oliezuur toe aan een minimicroscoopschuifkamer en bedekt u het monster met een afdekstrip. Plaats het monster op het microscoopstadium en gebruik de rand van de pad om de druppel te lokaliseren en erop te focussen.

Stel de condensor voor Kohler-verlichting in en gebruik een infraroodsensorkaart en infraroodviewer om te controleren of het pompstraalpad nog steeds correct is. Bevestig dat de vertragingsfase is ingesteld op nul femtoseconden en stel de golflengte van de pompstraal in op 795,8 nanometer. Stel het vermogen van de pompstraal in op 50 milliwatt en stel de Stoke-balk in op 100 milliwatt.

Open de sluiter voor zowel de stralen als het hoofdluik van de laser. Scan het voorbeeld en controleer de afbeelding op het computerscherm. Verander de weergavemodus naar hoog laag en pas het bereik aan om een verzadiging van ongeveer 50% te zien.

Controleer of de verzadiging gecentreerd is in het beeld en pas de stuurspiegels in het picoseconde tune-able lasersysteem zorgvuldig aan voor geoptimaliseerde overlapping van de pomp en de Stokes om de beeldintensiteit te maximaliseren en de piekintensiteit indien nodig te centreren. Voeg voor elke beeldvormingssessie 100 microliters warme 2% agarose toe aan een schone glazen dia die tussen steundia's met twee lagen laboratoriumtape wordt geplaatst en plaats snel een tweede dia bovenop de eerste dia. Voorzichtig ingedrukt om een dun, gelijkmatig, agarose pad te maken en de agarose te laten afkoelen.

Om de wormen voor beeldvorming te monteren, plaatst u een druppel verdovingsmiddel van vier tot vijf microliter per 10 tot 20 wormen op een afdekslip en gebruikt u een dissectiemicroscoop om de te zien wormen te plukken, waarbij de wormen op de druppel anesthesie worden geplaatst terwijl ze worden verzameld. Wanneer alle wormen zijn verzameld, bedek je de wormen met de glazen glijbaan met de agarose pad. Voor beeldvorming monteert u het wormmonster met de afdekslip naar de objectieve lens gericht en richt u de heldere veldlichtbron naar het oculair om de wormen te lokaliseren.

Breng de wormen scherp en pas de condensorpositie dienovereenkomstig aan. Stel de laservermogens in door het laservermogen van de pomp in te stellen op 200 milliwatt en het IR-vermogen op 400 milliwatt. Stel de lock-in versterker in voor demodulatie van het worm SRS signaal.

Begin met het scannen van de eerste worm met een snelle scansnelheid, waarbij de fijne focus wordt aangepast om het interessegebied te vinden. Wanneer het signaal is geoptimaliseerd, schakelt u over naar een langzamere scansnelheid en een hogere pixelresolutie om de SRS-afbeelding te verkrijgen en de afbeelding op te slaan in een indeling die een hoge resolutie mogelijk maakt. Wanneer alle monsters in beeld zijn gebracht, plaatst u de laserbron op stand-by en schakelt u alle bijbehorende apparatuur uit.

Als u de afbeeldingen wilt analyseren, opent u de bestanden in ImageJ en selecteert u analyseren en metingen instellen om de te analyseren eigenschappen te selecteren. Gebruik het gereedschap Polygoonselectie om het te kwantificeren gebied van de wormdarm te schetsen en klik nogmaals op analyseren en meten. De metingen verschijnen in het resultatenvenster.

Wanneer alle wormen zijn geschetst, kopieert en plakt u de metingen voor elk van de wormen in een bepaald genotype in een spreadsheet. Selecteer voor de achtergrondmetingswaarde een gebied in de buurt van de worm dat geen SRS-signaal heeft en trek de grijswaarde van het achtergrondgemiddelde af van de meting voor elke afzonderlijke worm om de gemiddelde en standaardafwijking van de achtergrond afgetrokken gemiddelde grijswaarden van alle wormen in een bepaald genotype of testgroep te berekenen. Deze waarden kunnen vervolgens worden genormaliseerd tot het gemiddelde van de besturingsgroep.

In deze representatieve analyse werden de intestinale lipidenniveaus in leeftijdssynchroniseerde wilde typewormen en daf-2 mutanten zonder de insulinereceptor gekwantificeerd tijdens de volwassenheid. Zoals verwacht, wordt een daling van lipidenniveaus waargenomen bij wormen van het wilde type, beginnend op dag één en doorgaand tot dag negen van volwassenheid. De lipidenspiegels bij daf-2 mutanten nemen echter toe tot ze vijf dagen oud zijn, waarna ze constant blijven op ongeveer 2,5 tot drie keer hoger dan het wilde type.

Daf-16 inactivatie onderdrukt de toename van lipidenniveaus van daf-2 mutanten. Expressie van de daf-16a a of daf-16b isoform in de daf-2, daf-16 dubbele mutanten herstelt de lipideniveaus niet. De expressie van de daf-16d/f/h isoform is echter voldoende om de lipidenspiegels in daf-2, daf-16 double mutants te herstellen tot de niveaus waargenomen bij daf-2 single mutanten.

Deze resultaten geven aan dat de daf-16d/f/h isoform specifiek het lipidenmetabolisme moduleert bij daf-2 mutante wormen. Het is belangrijk om tijdens de beeldvormingssessie dezelfde laserkracht te gebruiken voor pomp- en Stokes-stralen en om elke zes en vier consistente kwantificering een controlegroep op te nemen. Naast het kwantificeren van lipidenopslag, kan SRS-microscopie worden gekoppeld aan bioorthogonale tags, zoals het deuterium, en worden geïmplementeerd om de dynamiek van lipidenintegratie, -synthese en -afbraak te visualiseren.

SRS-microscopie maakt multiplexing mogelijk en kan worden geïmplementeerd om meerdere biomoleculen in verschillende subcellulaire compartimenten in beeld te plaatsen. Zogenaamde hyperspectrale SRS-microscopie heeft een grote toekomst in het verkennen van de metabolische dynamiek.