Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten
22 september 2020
Dit protocol beschrijft een efficiënte celvrije methode voor de productie van hoogwaardig proteoliposoom door middel van een bilayer-dialysemethode met behulp van een tarwecelvrij systeem en liposomen. Deze methode biedt geschikte middelen voor functionele analyse van membraaneiwitten, screening van medicijndoelen en ontwikkeling van antilichamen.
Alle membraaneiwitten zijn belangrijke doelen bij het ontdekken van geneesmiddelen. De grootschalige productie van membraaneiwitten blijft een knelpunt voor het uitvoeren van biochemische, biofysische en structurele studies van membraaneiwitten. Deze methode kan worden gebruikt om efficiënt membraaneiwitten in-vitro te synthetiseren en om gezuiverde proteoliposomen snel met een hoge succesratio te bereiden.
Na het toevoegen van de juiste reagentia, inclusief het celvrije expressieplasmide om een transcriptiereactiemengsel te genereren, meng de inhoud van de buis door voorzichtig omkeren of tikken en voer een snelle spin uit in een microcentrifuge. Na het draaien, incubeer het transcriptiereactiemengsel gedurende zes uur bij 37 graden Celsius gevolgd door mengen en een spindown-stap. Om de translatiebuffer te bereiden, verdun de stockoplossing met vers ultrapuur water.
Voor kleine schaal translatie, gebruik 100 microliter dialysebekers gewassen met ultrapuur water om het glycerol uit de dialysemembraan te verwijderen. Voeg een milliliter ultrapuur water toe aan een nieuwe 1,5 milliliter buis en plaats een kleine schaal dialysebeker in de buis. Voeg vervolgens 500 microliter ultrapuur water toe aan de beker voor een 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur.
Om liposomen te bereiden, breng een lipideoplossing met 50 milligram lipiden over naar een verdampingsfles. Plaats de fles in een rotatievloeipapier om het oplosmiddel te verdampen. Wanneer een dunne, gelijkmatig verspreide laag lipide is gegenereerd op het oppervlak van de flesbodem, breng de fles over naar een vacuümdroger onder negatieve druk overnacht om het oplosmiddel volledig te verwijderen.
De volgende ochtend, verwijder de flessen uit de droogkast en controleer de dunne laag lipiden. Voeg een milliliter translatiebuffer toe aan de fles en draai de fles om de buffer over de dunne lipidelaag te verspreiden. Na vijf minuten, soniceer de fles waarbij u de hoek af en toe verandert om de oplossing het hele lipidefilmoppervlak te laten contacteren.
Stop met soniceren wanneer het lipide volledig is verwijderd uit de fles en de liposoomsuspensie uniform wordt. Breng vervolgens de liposoomsuspensie over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Voordat u een in-vitro eiwittranslatie uitvoert, laat een buis tarwekiemextract uit min 80 graden opslag op water bij kamertemperatuur enkele minuten snel ontdooien.
Na het ontdooien van het extract, meng onmiddellijk de inhoud van de buis door voorzichtig omkeren. Draai vervolgens naar beneden en plaats de buis op ijs. Voeg het tarwekiemextract mRNA en liposomen toe om een translatierecaktiemengsel te genereren.
Meng de inhoud van de buis door voorzichtig omkeren of tikken en voer een snelle spin uit in een microcentrifuge. Om een kleine schaal in-vitro eiwittranslatie uit te voeren, verwijder het water uit de kleine schaal dialysebeker en buis en voeg een milliliter translatiebuffer toe aan de buis en 300 microliter aan de beker. Neem 60 microliter van het translatierecaktiemengsel.
Plaats de pipettip in de translatiebuffer in de dialysebeker. Injecteer vervolgens het mengsel langzaam en voorzichtig. Het reactiemengsel met hogere dichtheid zinkt spontaan naar de bodem van de beker en vormt een laag.
Dek de beker af met een deksel om verdamping te voorkomen. Om een grootschalige translatie uit te voeren, voeg 22 milliliter translatiebuffer toe aan een 25 milliliter buis en plaats een twee milliliter dialysebeker in de buis. Voeg twee milliliter translatiebuffer toe aan de dialysebeker.
Neem 500 microliter van het translatierecaktiemengsel, injecteer het mengsel langzaam en voorzichtig in de translatiebuffer in de beker. Incubeer de reacties gedurende 24 uur bij 15 graden Celsius. De volgende dag meng de reactie in de dialysebeker grondig door pipettering en breng de ruwe proteoliposoomsuspensies over naar nieuwe buizen.
Om de proteoliposomen te zuiveren, sedimenteer de proteoliposomen in de ruwe suspensies door centrifugatie. Was vervolgens de proteoliposomen door hersuspendering in het juiste volume ijskoud PBS-buffer drie keer. Na het wassen, hersuspendeer de proteoliposomen pellets grondig in een klein volume PBS en meet het suspensievolume met behulp van een micropipet.
Voeg vervolgens PBS toe om het volume van de suspensie aan te passen. Breng elke suspensie over naar een nieuwe microbuis. Om een SDS-pagina-analyse op te zetten, voeg 70 microliter water en 40 microliter drie keer geconcentreerde SDS-pagina-steekbuffer toe aan 10 microliter van elke proteoliposomensuspensie.
Stel een vijf tot 20% gradiënt SDS-pagina-gel op in een elektroforesekamer. Laad de gel met twee microliter van de eiwitmaatstafmarkering drie, zes en 12 microliter van elk proteoliposomenstelsel en 10 microliter bovien serumalbuminestandaarden. Na het laden van monsters, voer de elektroforese uit gevolgd door het kleuren van de gel met Coomassie Briljante Blauwe kleurstof.
Ten slotte ontkleuren de gel in heet water met zacht schudden en scan het gelbeeld. Met behulp van dit protocol zoals gedemonstreerd, kan een verscheidenheid aan membraaneiwitten met drie of meer transmembraanhelices gemakkelijk als proteoliposomen in een korte tijd worden geproduceerd. In deze dubbellaag dialysemethode kan een continue toevoer van substraten en de verwijdering van het bijproduct efficiënt worden uitgevoerd aan zowel de boven- als onderkant van de reactiemengsel gedurende een lange periode, wat leidt tot een uitstekende translatie-efficiëntie.
De dubbellaag dialysemethode resulteert in een vier tot 10 keer verhoging van de productiviteit in vergelijking met het gebruik van alleen de dubbellaag of dialysemethoden. Het verzamelen van de gesynthetiseerde proteoliposomen door centrifugatie en hun gedeeltelijke zuivering met een wasbuffer verkort het zuiveringsproces van de membraaneiwitten aanzienlijk. Dit celvrije systeem is gemakkelijk te manipuleren en zeer schaalbaar.
Het kan ook worden gebruikt om geheugeneiwitten te produceren die moeilijk te exprimeren zijn met behulp van andere methoden. Deze methode is uiterst nuttig voor onderzoek en experimenten die
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een efficiënte celvrije methode voor de productie van hoogwaardige proteoliposomen met behulp van een celvrij tarwesysteem en liposomen. Deze methode vergemakkelijkt de functionele analyse van membraanproteïnen en ondersteunt het screenen van drugstargets en de ontwikkeling van antilichamen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Medicijnontwikkeling
Achtergrond
- Membraaneiwitten zijn cruciale doelwitten bij het ontdekken van geneesmiddelen.
- Grootschalige productie van membraaneiwitten vormt een significante bottleneck.
- Deze methode maakt in-vitro synthese van membraaneiwitten mogelijk.
- Het maakt de efficiënte preparatie van gezuiverde proteoliposomen mogelijk.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor de synthese van membraaneiwitten.
- Om de analyse van membraaneiwitfuncties te faciliteren.
- Om de ontwikkeling van nieuwe drugtargets en antilichamen te ondersteunen.
Gebruikte methoden
- Het celvrije expressieplasmid wordt toegevoegd om een transcriptiereactiemengsel te genereren.
- Het mengsel wordt voorzichtig omgekeerd of getikt en gecentrifugeerd in een microcentrifuge.
- Incubatie van het transcriptiereactiemengsel vindt plaats bij 37 °C gedurende zes uur.
- Een translatiebuffer wordt bereid door de voorraadoplossing te verdunnen met ultrapuur water.
Belangrijkste resultaten
- De methode levert proteoliposomen van hoge kwaliteit op.
- Het demonstreert een hoog succespercentage bij de synthese van membraaneiwitten.
- Functionele analyse van membraaneiwitten wordt hiermee mogelijk gemaakt.
- Screening van drug targets en de ontwikkeling van antilichamen worden ondersteund.
Conclusies
- Deze celvrije methode is efficiënt voor de productie van membraaneiwitten.
- Het pakt de knelpunt in membraaneiwitstudies aan.
- Het protocol kan worden aangepast voor diverse toepassingen van membraaneiwitten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De efficiënte productie van functionele membraaneiwitten blijft een kritieke flessenhals in vroege pijplijnen voor geneesmiddelenonderzoek en antilichaamontwikkeling. Het celvrije systeem voor dubbellaag-dialyse maakt snelle, schaalbare synthese van hoogwaardige proteoliposomen mogelijk, wat workflows voor targetvalidatie en screening direct ondersteunt. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen en versnelt de voortgang van het portfolio voor membraaneiwitten als drug targets.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt robuuste functionele analyse van membraaneiwitten als drugtargets mogelijk.
- Faciliteert biologische risicoreductie door eiwitten te produceren met de juiste conformatie en activiteit.
- Ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij de selectie van targets en triagebeslissingen.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gevalideerde proteoliposomen voor downstream functionele assays en screeningsplatforms.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays voor membraaneiwit-targets.
- Maakt schaalbare productie mogelijk voor high-throughput screening en antilichaamgeneratie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie voor therapeutica op basis van membraaneiwitten.
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door functionele analyse van klinisch relevante targets mogelijk te maken.
- Vermindert het risico op uitval in een laat stadium als gevolg van onvoldoende eiwitkwaliteit of opbrengst.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze celvrije productiemethode voor proteoliposomen bevindt zich op het snijvlak van targetvalidatie, assayontwikkeling en leadidentificatie voor geneesmiddelenonderzoek naar membraaneiwitten.
- Discovery Biology: Versnelt het testen van hypothesen en de verduidelijking van signaalpaden voor membraaneiwitfuncties.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve proteoliposoom-outputs voor betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt kwantitatieve SDS-PAGE en functionele assays mogelijk om eiwitopbrengst en activiteit te vergelijken.
- Translationaal Onderzoek: Vormt een brug van in vitro validatie naar preklinische modelontwikkeling voor membraantargets.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een schaalbaar, aanpasbaar platform voor diverse membraaneiwit-targets over verschillende programma's heen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar membraaneiwitten.
- Operationele waarde: Standaardiseert en stroomlijnt de productie van membraaneiwitten met een hoge reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk en verbetert de kapitaalefficiëntie in portefeuilles in een vroeg stadium.
- Impact op de portefeuille: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en het verder ontwikkelen van membraaneiwitten als drug targets.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in celvrije expressie en de verwerking van membraaneiwitten.
- Vereist toegang tot tarwekiemsap-systemen, hulpmiddelen voor de bereiding van liposomen en een analytische infrastructuur.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor een reproduceerbare kwaliteit en opbrengst van proteoliposomen.
- Aanpasbaar aan een reeks klassen membraaneiwitten, waaronder GPCR's en ionkanalen.
- De schaalbaarheid en doorvoer kunnen worden beperkt door de beschikbaarheid van reagentia en de zuiveringscapaciteit.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:38
In Vitro Transcription
1:12
Translation Material Preparation
1:54
Liposome Preparation
3:07
In Vitro Translation
5:14
Proteoliposome Purification
5:56
Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and Coomassie Brilliant Blue (CBB) Staining
6:57
Results: Representative Proteoliposome Production by Bilayer-Dialysis
8:01
Conclusion
