Name: Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer drie beenmergtransplantatiemethoden bij muizen om clonale hematopoëse te bestuderen. Deze protocollen minimaliseren bijwerkingen van totale lichaamsbestraling en optimaliseren experimentele resultaten voor cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door amerikaanse national institutes of health subsidies aan K. Walsh (HL131006, HL138014 en HL132564), aan S. Sano (HL152174), American Heart Association grant aan M. A. Evans (20POST35210098), en een Japan Heart Foundation grant aan H. Ogawa.

Alle procedures met betrekking tot dieronderwerpen zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Virginia.
1. Voorafgaand aan de voorconditionering
<ol><li>Plaats de ontvangende muizen op met antibiotica aangevuld water (5 mM sulfamethoxazol, 0,86 mM trimethoprim) ~24 uur voorafgaand aan de bestraling. Dit is nodig om infectie te voorkomen, omdat het immuunsysteem na bestraling wordt onderdrukt en gedurende 2 weken na bestraling wordt gehandhaafd. Vul muizen op dit punt aan met een voedings-/hydratatiegel om voeding aan te moedigen en gewichtsverlies en uitdroging na bestraling te voorkomen.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61875/61875fig01.jpg"> Figuur 1: Afbeeldingen met verschillende randvoorwaarden. (A) Pie-cage total body radiation setup using gamma-ray (Cesium-137): De stralingsstraal komt van de achterkant van de bestralingsmachine in de y-as richting (horizontale straling). (B) Muiskooi totale lichaamsbestraling opstelling met behulp van röntgenfoto: De muizenkooi wordt in de reflecterende kamer geplaatst. De stralingsstraal komt van de bovenkant van de bestralingsmachine in de vorm van een kegel (verticale straling). De afstand van de stralingsbron tot de kooi is 530 mm. (C) Verstelbare lade in röntgenstraling: Deze opstelling wordt gebruikt voor gedeeltelijk afgeschermde bestraling met behulp van röntgenstraling. De stralingsstraal komt van de bovenkant van de bestralingsmachine in de vorm van een kegel (verticale straling). De afstand van de stralingsbron tot de lade is 373 mm en de straal is 250 mm. (D) Thorax-afscherming: Verdoofde muizen worden op een tray geplaatst. De muizen worden omgekeerd naar elkaar geplaatst in liggende posities met armen en benen volledig uitgestrekt. Het onderste uiteinde van het loodschild is uitgelijnd met het xiphisternum-bot en het bovenste uiteinde met de thymus. (E) Abdominale afscherming: Verdoofde muizen worden geplaatst zoals in de thorax-afschermingsopstelling met het onderste uiteinde van het loodschild uitgelijnd met de anus en het bovenste uiteinde onder het middenrif. (F) Hoofdafschermingsbestralingsopstelling met gammastraal (Cesium-137): De voorzagen van de verdoofde muis worden afgeplakt en de muis wordt in een conische spaninrichting geplaatst. Het zwarte loodschild (gemarkeerd) bedekt het hoofd en de oren van de muis. De stralingsstraal komt van de achterkant van de bestralingsmachine in de richting van de Y-as (horizontale straling). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61875/61875fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
2. Voorconditionering van ontvangende muizen (optioneel)
<ol><li>Totale lichaamsbestraling
	<ol>
<li>Plaats ontvangende muizen in een gelijkmatig gesneden taartkooi of een muizenkooi in de reflecterende kamer binnen de berekende straal om dezelfde bestralingsdosis te ontvangen; er wordt echter een maximum van 8 muizen per taartkooi en 5 muizen per muizenkooi aanbevolen om een uniforme bestraling te garanderen (figuur 1A,B).</li>
		<li>Om volledige myeloablatie te bereiken, moet u ervoor zorgen dat ontvangende muizen een totale stralingsdosis van 11 Gy krijgen in twee 5,5 Gy-fracties, gescheiden door een interval van 4-24 uur. OPMERKING: Hoewel optimale engraftment kan worden verkregen door een interval van 4 uur tussen breuken te implementeren, kan dit worden uitgebreid tot een interval van 24 uur, wat nuttig kan zijn wanneer arbeid en/of de bestralingsmachine niet beschikbaar is.</li>
	</ol></li>
	<li>Gedeeltelijk afgeschermde bestraling
	<ol>
<li>Verdoof de ontvangende muizen door intraperitoneale injectie van ketamine (80–100 mg/kg) en xylazine (5–10 mg/kg). De beperking van de beweging van de muis is van cruciaal belang om een uniforme bestraling en effectieve bescherming van de richtorganen tijdens het afschermingsproces te garanderen.</li>
		<li>Voor thorax- en buikafscherming moet de stralingsstraal van de röntgenstralingsstraling verticaal op de muis worden gericht (figuur 1C).<ol>
<li>Plaats de verdoofde muizen op een vlakke plaat en centreer de stralingsbron van bovenaf. Plaats de muizen omgekeerd naar elkaar in een liggende positie met armen en benen volledig uitgestrekt (figuur 1D,E). OPMERKING: Röntgenstralingsfaciliteit maakt het voor dit experiment mogelijk dat twee muizen tegelijk binnen de effectieve straal kunnen worden geplaatst die uniforme bestraling mogelijk maakt. Hoewel de effectieve straal wordt berekend op basis van de afstand tussen de stralingsbron en de lade, hangt het aantal dieren dat tegelijkertijd kan worden bestraald af van de specifieke bestralingsmachine.</li>
			<li>Bevestig de poten van de muizen op de plaat met behulp van tape om ervoor te zorgen dat de muizen tijdens de bestralingsprocedure worden geïmmobiliseerd. Plaats loodafscherming zodat deze gebieden bedekt die bescherming nodig hebben.</li>
			<li>Voor thoraxafscherming bereidt u het loodschild voor door de lengte van het xiphisternumbot van de muis tot de thymus te meten en de dikte te berekenen die voldoende bescherming biedt tegen de bestralingsbron. Plaats de loodafscherming zo dat het onderste uiteinde uitlijnt met het xiphisternumbot. Het bovenste uiteinde van de loden barrière past in de buurt van de thymus (figuur 1D).</li>
			<li>Voor buikafscherming bereidt u het loodschild voor door de lengte van de anus van de muis tot het middenrif te meten en de dikte te berekenen die voldoende bescherming biedt tegen de bestralingsbron. Plaats de loodafscherming zo dat het onderste uiteinde uitlijnt met de anus. Het bovenste uiteinde van het loodschild past onder het membraan (figuur 1E). OPMERKING: Het lokaliseren van het loodschild om consistent te zijn tussen cohorten kan enige variatie verminderen met betrekking tot de grootte van de muizen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voor hoofdafscherming moet u de stralingsstraal van de Cesium-bestraling horizontaal op de muis richten.<ol>
<li>Plak de voorzagen van een verdoofde muis voorzichtig op de buik. Dit zorgt ervoor dat de armen een volledige dosis bestraling krijgen en niet door het schild worden bedekt.</li>
			<li>Voor hoofdafscherming plaatst u de muis in een conische restrainer, die in een loodschild past. Zodra de muis zich in de conische spaninrichting bevindt, schuift u de beperkende in de sleuf binnen het loodschild (afbeelding 1F). Het loodschild moet het hoofd en de oren van de muis (~ 3,2 cm) volledig bedekken, waardoor de rest van het lichaam van de muis wordt blootgesteld voor bestraling. De positie van de restrainer in het schild kan worden aangepast aan dieren van verschillende grootte door deze verder naar binnen of buiten het schild te schuiven.</li>
			<li>Plaats muizen in de bestralingsmachine, loodrecht op de bron voor bestraling.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Stel muizen bloot aan twee 5,5 Gy-fracties bestraling (totale dosis van 11 Gy) gescheiden door een interval van 4-24 uur.</li>
		<li>Plaats na elke bestralingsfractie de kooien met verdoofde muizen op verwarmde matten of onder rode warmtelampen om onderkoeling te voorkomen en te helpen bij het herstel van anesthesie. OPMERKING: Let op dat u de verdoofde muis niet oververhit raakt wanneer u een lamp gebruikt, omdat deze niet aan de hitte kan ontsnappen. Zoals hierboven beschreven, kunnen de positionering van dieren en de dikte van het loodschild verschillen tussen studies op basis van de specifieke kenmerken van de bestralingsmachine (stralingstype/-richting van de straal, enz.). Onderzoekers zullen hun experimenten dienovereenkomstig moeten aanpassen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Botisolatie
OPMERKING: Idealiter moeten donormuizen en ontvangende muizen qua leeftijd en binnen 8-12 weken oud vergelijkbaar zijn. Het gebruik van ten minste 3 muizen als donor (in plaats van één donor) heeft de voorkeur om te minimaliseren voor heterogeniteit (zelfs bij het gebruik van muizen met hetzelfde genotype). Ongeveer 40 miljoen ongefractioneerde beenmergcellen kunnen worden verkregen uit zes botten (twee dijbenen, twee scheenbenen en twee humeri) van een enkele muis. Transplantatie van 5 miljoen beenmergcellen aan elke ontvangende muis zorgt meestal voor engraftment.
<ol><li>Euthanaseer donormuizen door cervicale dislocatie zonder anesthesie (voorkeursmethode om chemische besmetting van cellen te voorkomen) en plaats elke muis op een absorberend kussen.</li>
	<li>Desinfecteer de huid met een 70% ethanolspray.</li>
	<li>Maak een kleine dwarssnede in de huid onder de ribbenkast en houd de huid stevig vast aan weerszijden van de incisie, scheur in tegengestelde richting naar het hoofd en de voeten. Pel de huid van alle ledematen af.</li>
	<li>Snijd over de schouders en de ellebooggewrichten en verwijder de aange gehechte spieren en bindweefsels met behulp van een Kimwipe om de humeri te verkrijgen.</li>
	<li>Ontwricht voorzichtig de heupgewrichten tussen het dijbeen en de heupbotten. Gebruik een stompe schaar om langs de dijbeenkop te snijden en de benen los te maken. Snijd over het kniegewricht om het dijbeen en het scheenbeen te scheiden en verwijder voorzichtig de aange gehechte spieren en bindweefsels met behulp van een Kimwipe om het dijbeen en het scheenbeen te oogsten. OPMERKING: Let er tijdens deze stap vooral op om de botepifyse intact te houden. Gooi gebroken botten weg als gevolg van verlies van steriliteit. Heupbotten en wervelkolombotten kunnen worden verzameld naast het dijbeen, scheenbeen en opperarmbeen. Om ruggengraatbotten te verzamelen, kunnen een mortier en een stamper worden gebruikt om de botten in stukken te verpletteren en de beenmergcellen te oogsten.</li>
	<li>Plaats de geïsoleerde botten van muizen van hetzelfde genotype in een conische buis van 50 ml met 20 ml ijskoud steriel PBS en houd deze op ijs tot verder gebruik. Besteed speciale aandacht aan het correct plaatsen van de botten in buizen met bijpassende genotypen.</li>
	<li>Herhaal de bovenstaande stappen voor elk donordier dat handschoenen tussen elke muis verwisselt. Reinig ook een schaar en andere instrumenten met 70% ethanol tussen elke muis.</li>
</ol>4. Beenmergcelisolatie
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit in een kast van bioveiligheidsklasse II.
<ol><li>Bereiding van buissets: Maak een klein gaatje in de bodem van een steriele 0,5 ml microcentrifugebuis met behulp van een 18 G-naald en plaats deze in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis, die 100 μL ijskoud steriel PBS aan de onderkant bevat. OPMERKING: Aangezien er slechts zes botten in de 0,5 ml microcentrifugebuis passen, wordt aanbevolen om voldoende buissets voor te bereiden om alle botten tegelijkertijd te verwerken.</li>
	<li>Aspireer de PBS en breng de geïsoleerde botten over op een steriele celkweekschaal van 100 mm. Houd elk bot vast met een fijne tang en snijd de epifysen voorzichtig van elk uiteinde af met een kleine schaar die in een autoclaaf is gesteriliseerd. Plaats de gesneden botten in de voorbereide buissets.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 10.000 x g gedurende 35 s bij 4 °C.</li>
	<li>Bevestig na centrifugeren dat het beenmerg met succes uit de botten is verwijderd. Botten moeten wit en doorschijnend lijken met een relatief grote rode pellet aan de onderkant van de 1,5 ml microcentrifugebuis. Gooi de microcentrifugebuis van 0,5 ml weg. OPMERKING: Als de visuele inspectie het beenmerg aan de onderkant van de buis van 1,5 ml niet detecteert, snijdt u het bot opnieuw door en herhaalt u stap 4.3.</li>
	<li>Resuspendeer het beenmerg in 1 ml ijskoud PBS en breng vervolgens de celsuspensie over van hetzelfde genotype naar een overeenkomende conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Dissocieer de cellen door ze 10 keer door een 18 G-naald met een spuit van 10 ml te laten gaan.</li>
	<li>Filter eencellige suspensuspensingen door een 70 μm celzeef. Voeg extra ijskoud PBS toe aan een eindvolume van 10 ml en resuspendeer de cellen door het zachte gebruik van pipethulp.</li>
	<li>Centrifugeer bij 310 x g gedurende 10 min bij 4 °C.</li>
	<li>Aspireer het supernatant en resuspendeer de celkorrel met 10 ml serumvrije RPMI-media. Spaar 30 μL van dit materiaal voor het tellen van cellen.</li>
	<li>Bepaal de celconcentratie met een celteller en bereken het volume celsuspensie dat nodig is voor de transplantatie. Voor het voorbeeld van een 100% BMT zijn 5 x 106 beenmergcellen nodig voor elke ontvangende muis. OPMERKING: Bereid voor een competitieve BMT in totaal 5 x 106 beenmergcellen voor die bestaan uit een mengsel van donorcellen (bijv. CD45.2+) en concurrerende cellen (bijv. CD45.1+). Het bereiden van extra beenmergcellen wordt ten zeerste aanbevolen. Als er bijvoorbeeld 10 ontvangende muizen per experimentele groep zijn, bereiden we meestal voldoende cellen voor op 12 ontvangende muizen.</li>
	<li>Breng het berekende volume celsuspensie over in een nieuwe conische buis van 50 ml. Centrifugeer bij 310 x g gedurende 10 min bij 4 °C.</li>
	<li>Aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen met behulp van de berekende hoeveelheid serumvrij RPMI-medium om de juiste celdichtheid en -volume te bereiken. Meestal is 200 μL het optimale volume voor een retro-orbitale injectie.</li>
</ol>5. Transplantatie van beenmergcellen naar bestraalde muizen
<ol><li>Verdoof de ontvangende muizen met 5% isofluraan.</li>
	<li>Terwijl muizen worden verdoofd, injecteer langzaam 200 μL beenmergcellen in de retro-orbitale ader met behulp van een naald van 28-30 G met een insulinespuit.<ol>
<li>Als alternatief kunt u de toediening van de donorcellen uitvoeren via intraveneuze injectie met staartader en intramedullaire femurinjectie, met een maximaal volume van respectievelijk 0,2 ml en 25 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra de cellen zijn geïnjecteerd, plaatst u een druppel proparacaïne-bevattende oogdruppels op het oppervlak van het oog voor pijnverlichting. Het dier kan dan weer bij bewustzijn komen.</li>
</ol>6. Transplantatie van beenmergcellen aan niet-geconditioneerde muizen
<ol><li>Verdoof de ontvangende muizen door inademing van 5% isofluraan.</li>
	<li>Injecteer 5 x 106 ongefractioneerde beenmergcellen van beide genotype retro-orbitaal in niet-bestraalde ontvangende muizen met een insulinespuit van 28-30 G.</li>
	<li>Herhaal stap 6.1 en 6.2 gedurende 3 opeenvolgende dagen, zodat de ontvangende muizen worden getransplanteerd met in totaal 1,5 x 107 beenmergcellen. OPMERKING: Omdat de adoptie BMT zonder preconditioneringsprocedure een beenmergtransplantatie gedurende 3 opeenvolgende dagen vereist, moet men proberen de ogen voor elke injectie af te wisselen.</li>
	<li>Dien na de injectie een druppel proparacaïnehoudende oogdruppels toe aan het aangedane oog.</li>
</ol>

<ol><li>Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+disease%2C+aging%2C+and+clonal+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).</li>
<li>Welch, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+evolution+of+mutations+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.</a> Cell. 150 (2), 264-278 (2012).</li>
<li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+clonal+hematopoiesis+associated+with+adverse+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).</li>
<li>Dorsheimer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+mutations+contributing+to+conal+hematopoiesis+with+prognosis+in+chronic+ischemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure.</a> JAMA Cardiology. 4 (1), 25(2019).</li>
<li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+and+blood-cancer+risk+inferred+from+blood+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence.</a> New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).</li>
<li>Jaiswal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+and+risk+of+atherosclerotic+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).</li>
<li>Bick, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interleukin+6+signaling+deficiency+attenuates+cardiovascular+risk+in+clonal+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis.</a> Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).</li>
<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355 (6327), 842-847 (2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+in+nonconditioned+mice+accelerates+age-associated+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction.</a> JCI Insight. 5 (6), 135204(2020).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+heart+failure+through+a+mechanism+involving+the+IL-1%CE%B2%2FNLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2-mediated+clonal+hematopoiesis+accelerates+pathological+remodeling+in+murine+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).</li>
<li>Yu, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+aging+on+primate+hematopoiesis+as+interrogated+by+clonal+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking.</a> Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+gene+editing+to+assess+the+roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+clonal+hematopoiesis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).</li>
<li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).</li>
<li>Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+regimens+for+hematopoietic+cell+transplantation%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all.</a> Blood. 124 (3), 344-353 (2014).</li>
<li>Bacigalupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+intensity+of+conditioning+regimens%3A+working+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).</li>
<li>Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+engraftment+of+primary+bone+marrow+stromal+cells+repairs+niche+damage+and+improves+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).</li>
<li>Shao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+body+irradiation+causes+long-term+mouse+BM+injury+via+induction+of+HSC+premature+senescence+in+an+Ink4a-+and+Arf-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner.</a> Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+early+endpoints+in+mouse+total-body+irradiation+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model.</a> PLOS One. 11 (8), 0161079(2016).</li>
<li>Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+risk+in+fatty+liver+disease%3A+the+liver-heart+axis-literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review.</a> Frontiers in Medicine. 6, 202(2019).</li>
<li>Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+the+kidney+and+the+cardiovascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).</li>
<li>Liao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+resident+and+nonresident+macrophages+in+nonischemic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).</li>
<li>Honold, L., Nahrendorf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+monocyte-derived+macrophages+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+in+cardiac+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The macrophage in cardiac homeostasis and disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).</li>
<li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6C+hi+CCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li>
<li>Cronk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripherally+derived+macrophages+can+engraft+the+brain+independent+of+irradiation+and+maintain+an+identity+distinct+from+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).</li>
<li>Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal-level+lineage+commitment+pathways+of+hematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).</li>
<li>Gibson, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cesium-137+and+X-ray+irradiators+by+using+bone+marrow+transplant+reconstitution+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice.</a> Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+intestinal+stem+cells+in+epithelial+regeneration+following+radiation-induced+gut+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury.</a> Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Voor studies naar klonale hematopoiese hebben we drie methoden van BMT beschreven: BMT met totale lichaamsbestraling, BMT met bestraling met gedeeltelijke afscherming en een minder vaak gebruikte BMT-methode waarbij geen pre-conditionering (adoptie-BMT) nodig is. Deze methoden zijn gebruikt om de impact van klonale hematopoiese op hart- en vaatziekten te beoordelen. Onderzoekers kunnen deze methoden dienovereenkomstig aanpassen aan het specifieke doel van hun studie.
Clonal hematopoies...

Clonal hematopoiesis (CH) is een aandoening die vaak wordt waargenomen bij oudere personen en optreedt als gevolg van een uitgebreide hematopoëtische stam en voorlopercel (HSPC) kloon met een genetischemutatie 1. Er is gesuggereerd dat tegen de leeftijd van 50, de meeste individuen gemiddeld vijf exonische mutaties in elke HSPC2zullen hebben verworven, maar de meeste van deze mutaties zullen resulteren in weinig of geen fenotypische gevolgen voor het individu. Als een van deze mutaties echter bij toeval een concurrentievoordeel oplevert voor de HSPC , bijvoorbeeld door de proliferatie, zelfvernieuwing, overleving of een combinatie hiervan te bevorderen, kan dit leiden tot de preferentiële uitbreiding van de mutante kloon ten opzichte van de andere HSPCs. Als gevolg hiervan zal de mutatie zich steeds meer verspreiden door het hematopoëtische systeem, omdat de gemuteerde HSPC aanleiding geeft tot volwassen bloedcellen, wat leidt tot een duidelijke populatie gemuteerde cellen in het perifere bloed. Hoewel mutaties in tientallen verschillende kandidaat-drivergenen zijn geassocieerd met klonale gebeurtenissen binnen het hematopoëtische systeem, zijn mutaties in DNA-methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) en tien elf translocatie 2 (TET2) de meest voorkomende3. Verschillende epidemiologische studies hebben aangetoond dat personen die deze genetische mutaties dragen een significant hoger risico hebben op hart - en vaatziekten (CVD), beroerte en all-causalemortaliteit 3,4,5,6,7. Hoewel deze studies hebben vastgesteld dat er een verband bestaat tussen CH en verhoogde incidentie van CVD en beroerte, weten we niet of deze relatie oorzakelijk is of een gedeeld epifenomenon met het verouderingsproces. Om een beter begrip van deze associatie te krijgen, zijn goede diermodellen nodig die de menselijke conditie van CH correct samenvatten.
Verschillende CH-diermodellen zijn door onze groep en anderen vastgesteld met zebravissen, muizen en niet-menselijke primaten8,9,10,11,12,13,14. Deze modellen gebruiken vaak hematopoëtische reconstitutiemethoden door transplantatie van genetisch gemodificeerde cellen, soms met behulp van Cre-lox recombinatie of het CRISPR-systeem. Deze aanpak maakt het mogelijk om een specifieke genmutatie in hematopoëtische cellen te analyseren om te beoordelen hoe deze bijdraagt aan de ontwikkeling van ziekten. Bovendien gebruiken deze modellen vaak congene of reportercellen om de effecten van mutante cellen te onderscheiden van normale of wilde cellen. In veel gevallen is een preconditioneringsregime vereist om donor hematopoëtische stamcellen met succes te engraferen.
Momenteel kan de transplantatie van beenmerg naar ontvangende muizen worden onderverdeeld in twee hoofdcategorieën: 1) myeloablatieve conditionering en 2) niet-geconditioneerde transplantatie. Myeloablatieve conditionering kan worden bereikt door een van de twee methoden, namelijk totale lichaamsbestraling (TBI) of chemotherapie15. TBI wordt uitgevoerd door de ontvanger te onderwerpen aan een dodelijke dosis gamma- of röntgenstraling, dna-breuken of dwarsverbindingen te genereren binnen snel delende cellen, waardoor ze onherstelbaar worden16. Busulfan en cyclofosfamide zijn twee veelgebruikte chemotherapiegeneesmiddelen die de hematopoëtische niche verstoren en op dezelfde manier DNA-schade veroorzaken aan snel delende cellen. Het netto resultaat van myeloablatieve conditionering is apoptose van hematopoëtische cellen, die het hematopoëtische systeem van de ontvanger vernietigt. Deze strategie maakt niet alleen de succesvolle engraftment van de donor-HSPCs mogelijk, maar kan ook entafstoting voorkomen door het immuunsysteem van de ontvanger te onderdrukken. Myeloablatieve conditionering heeft echter ernstige bijwerkingen zoals schade aan weefsels en organen en hun ingezeten immuuncellen, evenals vernietiging van de inheemse beenmergniche17. Daarom zijn alternatieve methoden voorgesteld om deze ongewenste bijwerkingen te overwinnen, met name met betrekking tot schade aan de organen van belang. Deze methoden omvatten afgeschermde bestraling van ontvangende muizen en de adoptie-BMT aan niet-geconditioneerde muizen9,17. Door de thorax, buikholte, het hoofd of andere gebieden te beschermen tegen bestraling door het plaatsen van loodbarrières, worden weefsels van belang beschermd tegen de schadelijke effecten van bestraling en blijft hun ingezeten immuuncelpopulatie behouden. Aan de andere kant heeft de adoptie BMT van HSPCs voor niet-geconditioneerde muizen een bijkomend voordeel omdat het de inheemse hematopoëtische niche behoudt. In dit manuscript beschrijven we de protocollen en resultaten van HSPC-engraftment na verschillende transplantatieregimes bij muizen, met name de levering van HSPC aan TBI-muizen, aan muizen die gedeeltelijk zijn afgeschermd van bestraling en aan niet-geconditioneerde muizen. Het algemene doel is om onderzoekers te helpen de verschillende fysiologische effecten van elke methode te begrijpen, evenals hoe ze experimentele resultaten beïnvloeden in de setting van CH en hart- en vaatziekten.

<table><tbody><tr><td>0.5ml microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-121</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>1.5ml microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 prfof)</td><td>Fisher chemical</td><td>200559</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>BD 1mL Tuberculin Syringes 25G 5/8 Inch Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)</td><td>Becton Dickinson</td><td>395195</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>Cesium-137 Irradiator</td><td>J. L. Shepherd&nbsp;</td><td>Mark IV</td><td>apparatuur</td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Life Sciences</td><td>353003</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>Fisherbrand sterile cell strainers, 70 &mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>Hardened Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>Isothesia (Isoflurane) solution</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td>oplossing</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Zoetis</td><td>043-304</td><td>injectie</td></tr><tr><td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td><td>Kimtech Science</td><td>KCC34155</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>PBS pH7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>oplossing</td></tr><tr><td>RadDisk &ndash; Rodent Irradiator Disk</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td>algemeen materiaal</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Sulfamethoxazole and Trimethoprim</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td>injectie</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td>injectie</td></tr><tr><td>X-ray irradiator</td><td>Rad source</td><td>RS-2000</td><td>apparatuur</td></tr></tbody></table>

beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is een veel voorkomende leeftijdsgebonden aandoening die het gevolg is van de accumulatie van somatische mutaties in hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Mutaties in drivergenen, die cellulaire fitheid verlenen, kunnen leiden tot de ontwikkeling van uitdijende HSPC-klonen die in toenemende mate aanleiding geven tot nakomelingen leukocyten die de somatische mutatie herbergen. Omdat klaonale hematopoiese is geassocieerd met hartaandoeningen, beroertes en mortaliteit, is de ontwikkeling van experimentele systemen die deze processen modelleren de sleutel tot het begrijpen van de mechanismen die deze nieuwe risicofactor onderbouwen. Beenmergtransplantatieprocedures waarbij myeloablatieve conditionering bij muizen betrokken is, zoals total-body bestraling (TBI), worden vaak gebruikt om de rol van immuuncellen bij hart- en vaatziekten te bestuderen. Gelijktijdige schade aan de beenmergniche en andere bezienswaardigheden, zoals het hart en de hersenen, is echter onvermijdelijk met deze procedures. Zo heeft ons lab twee alternatieve methoden ontwikkeld om mogelijke bijwerkingen veroorzaakt door TBI te minimaliseren of te voorkomen: 1) beenmergtransplantatie met bestralingsafscherming en 2) adoptieve BMT voor niet-geconditioneerde muizen. In afgeschermde organen wordt de lokale omgeving bewaard, waardoor de analyse van klonale hematopoiese mogelijk is, terwijl de functie van ingezeten immuuncellen niet wordt verstoord. De adoptieve BMT voor niet-geconditioneerde muizen heeft daarentegen het extra voordeel dat zowel de lokale omgevingen van de organen als de hematopoëtische niche behouden blijven. Hier vergelijken we drie verschillende hematopoëtische celreconstructiebenaderingen en bespreken we hun sterke punten en beperkingen voor studies naar klonale hematopoiese bij hart- en vaatziekten.

Om het effect van drie BMT/pre-conditioneringsmethoden op donorcelengraftment te vergelijken, werden de fracties van donorcellen in perifeer bloed en hartweefsel geanalyseerd door flowcytometrie na 1 maand post-BMT. Geïsoleerde cellen werden gekleurd voor specifieke leukocytenmarkers om de verschillende subsets van leukocyten te identificeren. In deze experimenten werden wild-type(WT) C57BL/6 (CD45.2) donor beenmergcellen geleverd aan WT B6. SJL-PtprcaPrpcb...

We beschrijven drie methoden van beenmergtransplantatie (BMT): BMT met total-body bestraling, BMT met afgeschermde bestraling en BMT-methode zonder pre-conditionering (adoptieve BMT) voor de studie van klonale hematopoiese in muismodellen.

Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Ons protocol zal onderzoekers helpen de fysiologische effecten van drie verschillende beenmergtransplantatiemethoden te begrijpen en hoe ze experimentele resultaten in clonal hematopoiese-setting beïnvloeden. Totale lichaamsstraling beenmergtransplantatie kan een negatieve invloed hebben op cardiovasculaire organen en ziektepathogenese veranderen. Zo heeft ons lab twee alternatieve methoden ontwikkeld om mogelijke bijwerkingen te minimaliseren of te voorkomen.Het demonstreren van de procedures zal Eunbee Park een afgestudeerde student zijn, en Megan Evans een postdoctorale kerel, zowel van mijn laboratorium voor thorax- als buikafscherming, plaats de verstelbare lade en de röntgenstralingsbestraling op de juiste afstand om uniforme bestraling te bereiken. En plaats de verdoofde muizen op een vlakke ledplaat die naar elkaar is omgekeerd in de liggende positie. Bevestig de poten met tape aan de plaat en plaats de led-afscherming zo dat het onderste uiteinde uitlijnt met het xiphisternum-bot en het bovenste uiteinde van het loodschild in de buurt van de thymus zit.Plaats na het afschermen de muizen in de bestralingsmachine en stel de dieren bloot aan twee, 5,5 grijze fracties van bestraling gescheiden door een interval van vier tot 24 uur. Voor hoofdafscherming plakt u de vier poten van de muis voorzichtig op de buik. Plaats de muis in een conische restrainer en schuif de restrainer in de sleuf binnen het loodschild, zodat het hoofd en de oren van de muis volledig bedekt zijn, waardoor de rest van het lichaam van de muis wordt blootgesteld aan een straling.Plaats na het afschermen de muizen in de bestralingsmachine en stel de dieren bloot aan 5,5 grijze fracties van een straling gescheiden door een interval van vier tot 24 uur. Plaats na elke bestralingsbehandeling de verdoofde muizen in een kooi op een verwarmde mat met monitoring totdat ze volledig zijn hersteld. Om de botten te isoleren, desinfecteer je de huid van de donormuis met 70% ethanol en maak je een kleine dwarshuidincisie onder de ribbenkast.Houd de huid stevig vast aan weerszijden van de incisie, scheur in tegengestelde richting naar het hoofd en de voeten en pel de huid van alle ledematen. Snijd over de schouders en ellebooggewrichten en gebruik een laboratoriumdoekje om de aangekoppelde spieren en bindweefsels uit de humeri te verwijderen. Ontwricht voorzichtig de gewrichten tussen het dijbeen en de heupbotten.En gebruik een stompe schaar om langs de femurkoppen te snijden om de benen los te maken. Snijd over het kniegewricht, om het dijbeen en het scheenbeen te scheiden. En gebruik labdoekjes om de aangekoppelde spieren en bindweefsels voorzichtig uit de botten te verwijderen.Trek vervolgens de botten van muizen van hetzelfde genotype in individuele 50 milliliter conische buizen met 20 milliliter ijskoud steriel PBS op ijs. Om de beenmergcellen in een bioveiligheidsklasse twee kast te isoleren, gebruikt u een naald van 18 gauge om een klein gaatje te maken in de bodem van een steriele microbuis van 500 microliter. En plaats de buis in een individuele steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis met 100 microliter ijskoud steriel PBS.Wanneer alle buizen zijn voorbereid, verwijdert u de PBS uit de buis met de geïsoleerde botten en brengt u de botten over op een steriele celkweekschaal van 100 millimeter. Gebruik fijne tangen en kleine scharen om de epifyse voorzichtig van de uiteinden van elk bot te verwijderen en plaats maximaal zes botten in elke buis van 500 microliter. Wanneer alle botten zijn doorgesneden, extraheert u de beenmergcellen door centrifugeren.Als alle merginhoud is verwijderd, moeten de botten wit en doorschijnend lijken met een relatief grote rode pellet aan de onderkant van de 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Verdun voor beenmergceltransplantatie de geïsoleerde beenmergcellen in serumvrije RPMI-media en laad 200 microliters van de celsuspensie in één insulinespuit van 0,5 milliliter per muis die moet worden geïnjecteerd. Na het bevestigen van een gebrek aan reactie op pedaalreflex, injecteer langzaam het volledige volume cellen in de retro orbitale ader van elk verdoofd ontvangende dier.Plaats vervolgens een druppel proparacaïne op het oog voor pijnverlichting. En laat de muis weer bij bewustzijn komen terwijl hij wordt gecontroleerd. Het effect van drie BMT-voorconditioneringsmethoden op donorcelengraftment vergelijken.De fracties van donorcellen in perifeer bloed en hartweefsel werden geanalyseerd door flowcytometrie na één maand na BMT. In deze representatieve analyse werden monocyten, neutrofielen en B-cellen in het perifere bloed van ontvangende muizen die totale lichaamsbestraling kregen, grotendeels verbitten en vervangen door het nageslacht van donorbotmerg afgeleide cellen. Bovendien werden de ingezetene ontvanger cardiale monocyt en neutrofiele populaties bijna volledig vervangen door donor afgeleide cellen.In de gedeeltelijk afgeschermde bestralingsgroep was de donor afgeleid van cardiale immuuncelvervanging bescheiden. De ontvangende beenmergcellen van de ontvangende muis in de afgeschermde gebieden droegen waarschijnlijk bij aan het lagere niveau van perifere bloedreconstructie in vergelijking met muizen die totale lichaamsbestraling kregen. In de groep zonder BMT-conditionering waren donorcellen detecteerbaar in het perifere bloed en de harten van ontvangende muizen na vier weken na BMT.Bovendien breidden Tet2-deficiënte donorcellen zich geleidelijk uit in de loop van de tijd. Ter vergelijking, ontvangende muizen die met donorcellen van het wilde type werden gegrafeerd, vertoonden minimale klonale expansie van donorcellen. Ze optimalisatie van deze experimentele modellen zal meer rigoureuze studies van de clonal hematopoiese driver genen die bijdragen aan alle oorzaak mortaliteit zoals cardio-metabole ziekte en kanker mogelijk maken.We hopen dat onze protocollen onderzoekers in staat zullen stellen om klonale hematopoiese te bestuderen om te onderzoeken hoe het bijdraagt aan hart- en vaatziekten en andere ziektetoestanden.

bone-marrow-transplantation-procedures-mice-to-study-clonal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the induction of intestinal graft-versus-host disease, GvHD, in a lethally-irradiated recipient mouse using allogeneic hematopoietic stem cells and GvHD-inducing splenic alloreactive T lymphocytes. This protocol helps establish a severe acute intestinal GvHD model to understand the mechanism of the disease and develop innovative therapeutic options.

Induction of Graft Versus Host Disease in Mouse Models via Allogeneic Bone Marrow and Splenic Cell Transplantation

Dit protocol beschrijft een procedure voor seriële bemonstering van femur beenmerg (BM) zonder dat muizen hiervoor worden geofferd. Deze procedure vergemakkelijkt longitudinale studies van de samenstelling van beenmerg van muizen in de loop van de tijd en biedt seriële toegang tot cellen binnen het beenmerg voor ex vivo en transplantatiestudies.

Femorale beenmergaspiratie in levende muizen

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

We beschrijven een protocol waarbij busulfan-conditionering het mogelijk maakt om het beenmerg van een ontvangende muis te vervangen door beenmergcellen van donormuizen die alomtegenwoordig groen fluorescent eiwit vertonen, zonder bestraling. Deze techniek is nuttig om de ophoping van beenmergcellen in het centrale zenuwstelsel te bestuderen.

Busulfan als myelosuppressieve Agent voor het genereren van een stabiel hoog niveau beenmergchimerisme in Muizen

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Dit protocol biedt stapsgewijze richtlijnen voor het opzetten van competitieve muisbeenmergtransplantatie-experimenten om hematopoëtische stam-/voorlopercellenfunctie te bestuderen zonder voorafgaande zuivering van stamcellen door celsortering.

Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer

Dit manuscript geeft een beschrijving van de methodologie die wordt gebruikt om muizenmodellen voor transductie-transplantatie te vestigen. Er wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van technische fouten die moeten worden vermeden bij het uitvoeren van beenmergtransplantaties. Er moet een duidelijk begrip worden verkregen van het belang van hoog viraal titer, transfectie/transductie en bestraling.

Transductie-Transplantatie Mouse Model van myeloproliferatieve aandoening

Hier presenteren we methodologie voor de klonale analyse van hematopoietische stamcellen precursoren tijdens lymfkliertest embryonale ontwikkeling. Wij combineren index sortering van afzonderlijke cellen uit de embryonale aorta-gonaden-mesonephros regio met endothelial co celkweek en transplantatie te karakteriseren de fenotypische eigenschappen en het engraftment potentieel van één hematopoietische precursoren.

Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

We beschrijven het gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) te beoordelen van de kwaadaardige potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoietische cellen. HSCT is handig voor de evaluatie van verschillende kwaadaardige hematopoietische cellen in vivo , alsmede het genereren van een grote cohort van muizen met myelodysplastic syndromes (MDS) of leukemie ter evaluatie van nieuwe therapieën.

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

Graft-versus-host ziekte is een belangrijke complicatie na allogene beenmergtransplantatie. Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van graft-versus-host ziekte. Het huidige artikel beschrijft een nieuw beenmergtransplantatieplatform om de rol van dendritische cellen te onderzoeken bij de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect.

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

Dit protocol beschrijft de intrafemorale injectie van enkele hematopoëtische of leukemische stamcellen, waaronder gen-bewerkte cellen, in muizenxenotransplantaatmodellen, die niet alleen de snelle en veilige transplantatie van cellen mogelijk maken, maar ook seriële analyses van het beenmerg.

Vereenvoudigde intrafemorale injecties met levende muizen maken continue beenmerganalyse mogelijk

Leer drie beenmergtransplantatiemethoden bij muizen om clonale hematopoëse te bestuderen. Deze protocollen minimaliseren bijwerkingen van totale lichaamsbestraling en optimaliseren experimentele resultaten voor cardiovasculair onderzoek.

Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen

Meer video's verkennen