Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen

Ons protocol zal onderzoekers helpen de fysiologische effecten van drie verschillende beenmergtransplantatiemethoden te begrijpen en hoe ze experimentele resultaten in clonal hematopoiese-setting beïnvloeden. Totale lichaamsstraling beenmergtransplantatie kan een negatieve invloed hebben op cardiovasculaire organen en ziektepathogenese veranderen. Zo heeft ons lab twee alternatieve methoden ontwikkeld om mogelijke bijwerkingen te minimaliseren of te voorkomen.

Het demonstreren van de procedures zal Eunbee Park een afgestudeerde student zijn, en Megan Evans een postdoctorale kerel, zowel van mijn laboratorium voor thorax- als buikafscherming, plaats de verstelbare lade en de röntgenstralingsbestraling op de juiste afstand om uniforme bestraling te bereiken. En plaats de verdoofde muizen op een vlakke ledplaat die naar elkaar is omgekeerd in de liggende positie. Bevestig de poten met tape aan de plaat en plaats de led-afscherming zo dat het onderste uiteinde uitlijnt met het xiphisternum-bot en het bovenste uiteinde van het loodschild in de buurt van de thymus zit.

Plaats na het afschermen de muizen in de bestralingsmachine en stel de dieren bloot aan twee, 5,5 grijze fracties van bestraling gescheiden door een interval van vier tot 24 uur. Voor hoofdafscherming plakt u de vier poten van de muis voorzichtig op de buik. Plaats de muis in een conische restrainer en schuif de restrainer in de sleuf binnen het loodschild, zodat het hoofd en de oren van de muis volledig bedekt zijn, waardoor de rest van het lichaam van de muis wordt blootgesteld aan een straling.

Plaats na het afschermen de muizen in de bestralingsmachine en stel de dieren bloot aan 5,5 grijze fracties van een straling gescheiden door een interval van vier tot 24 uur. Plaats na elke bestralingsbehandeling de verdoofde muizen in een kooi op een verwarmde mat met monitoring totdat ze volledig zijn hersteld. Om de botten te isoleren, desinfecteer je de huid van de donormuis met 70% ethanol en maak je een kleine dwarshuidincisie onder de ribbenkast.

Houd de huid stevig vast aan weerszijden van de incisie, scheur in tegengestelde richting naar het hoofd en de voeten en pel de huid van alle ledematen. Snijd over de schouders en ellebooggewrichten en gebruik een laboratoriumdoekje om de aangekoppelde spieren en bindweefsels uit de humeri te verwijderen. Ontwricht voorzichtig de gewrichten tussen het dijbeen en de heupbotten.

En gebruik een stompe schaar om langs de femurkoppen te snijden om de benen los te maken. Snijd over het kniegewricht, om het dijbeen en het scheenbeen te scheiden. En gebruik labdoekjes om de aangekoppelde spieren en bindweefsels voorzichtig uit de botten te verwijderen.

Trek vervolgens de botten van muizen van hetzelfde genotype in individuele 50 milliliter conische buizen met 20 milliliter ijskoud steriel PBS op ijs. Om de beenmergcellen in een bioveiligheidsklasse twee kast te isoleren, gebruikt u een naald van 18 gauge om een klein gaatje te maken in de bodem van een steriele microbuis van 500 microliter. En plaats de buis in een individuele steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis met 100 microliter ijskoud steriel PBS.

Wanneer alle buizen zijn voorbereid, verwijdert u de PBS uit de buis met de geïsoleerde botten en brengt u de botten over op een steriele celkweekschaal van 100 millimeter. Gebruik fijne tangen en kleine scharen om de epifyse voorzichtig van de uiteinden van elk bot te verwijderen en plaats maximaal zes botten in elke buis van 500 microliter. Wanneer alle botten zijn doorgesneden, extraheert u de beenmergcellen door centrifugeren.

Als alle merginhoud is verwijderd, moeten de botten wit en doorschijnend lijken met een relatief grote rode pellet aan de onderkant van de 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Verdun voor beenmergceltransplantatie de geïsoleerde beenmergcellen in serumvrije RPMI-media en laad 200 microliters van de celsuspensie in één insulinespuit van 0,5 milliliter per muis die moet worden geïnjecteerd. Na het bevestigen van een gebrek aan reactie op pedaalreflex, injecteer langzaam het volledige volume cellen in de retro orbitale ader van elk verdoofd ontvangende dier.

Plaats vervolgens een druppel proparacaïne op het oog voor pijnverlichting. En laat de muis weer bij bewustzijn komen terwijl hij wordt gecontroleerd. Het effect van drie BMT-voorconditioneringsmethoden op donorcelengraftment vergelijken.

De fracties van donorcellen in perifeer bloed en hartweefsel werden geanalyseerd door flowcytometrie na één maand na BMT. In deze representatieve analyse werden monocyten, neutrofielen en B-cellen in het perifere bloed van ontvangende muizen die totale lichaamsbestraling kregen, grotendeels verbitten en vervangen door het nageslacht van donorbotmerg afgeleide cellen. Bovendien werden de ingezetene ontvanger cardiale monocyt en neutrofiele populaties bijna volledig vervangen door donor afgeleide cellen.

In de gedeeltelijk afgeschermde bestralingsgroep was de donor afgeleid van cardiale immuuncelvervanging bescheiden. De ontvangende beenmergcellen van de ontvangende muis in de afgeschermde gebieden droegen waarschijnlijk bij aan het lagere niveau van perifere bloedreconstructie in vergelijking met muizen die totale lichaamsbestraling kregen. In de groep zonder BMT-conditionering waren donorcellen detecteerbaar in het perifere bloed en de harten van ontvangende muizen na vier weken na BMT.

Bovendien breidden Tet2-deficiënte donorcellen zich geleidelijk uit in de loop van de tijd. Ter vergelijking, ontvangende muizen die met donorcellen van het wilde type werden gegrafeerd, vertoonden minimale klonale expansie van donorcellen. Ze optimalisatie van deze experimentele modellen zal meer rigoureuze studies van de clonal hematopoiese driver genen die bijdragen aan alle oorzaak mortaliteit zoals cardio-metabole ziekte en kanker mogelijk maken.

We hopen dat onze protocollen onderzoekers in staat zullen stellen om klonale hematopoiese te bestuderen om te onderzoeken hoe het bijdraagt aan hart- en vaatziekten en andere ziektetoestanden.