Karakterisering en functionele voorspelling van bacteriën in eierstokweefsels
23 oktober 2021
Immunohistochemische kleuring en 16S ribosomale RNA-gen (16S rRNA-gen) sequencing werden uitgevoerd om bacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels in situ te ontdekken en te onderscheiden. De samenstellings- en functionele verschillen van de bacteriën werden voorspeld met behulp van BugBase en Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).
Dit protocol is ontworpen om bacteriën in eierstokweefsels te ontdekken en hun functies te voorspellen. Immunohistochemische kleuring en 16S rRNA-sequencing werden gebruikt om bacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels in situ te ontdekken en te onderscheiden. De compenserende en functionele verschillen van de bacteriën worden voorspeld met behulp van BoPs en cellulair-genetisch onderzoek van gemeenschappen door reconstructie van niet-geobserveerde dagen.
Ons protocol is gericht op het extraheren van bacteriën uit eierstokweefsels in situ. Het kan ook worden gebruikt om bacteriën in tumoren van welke aard dan ook te ontdekken. De belangrijkste voordelen van ons protocol zijn dat het gemakkelijk en handig is, dat het in bijna elk lab kan worden gerealiseerd.
Het is ook snel om de resultaten te krijgen. Tijdens het oefenen in het protocol is het belangrijk om bacteriën off-site tumorweefsels uit te sluiten. Alle procedures in dit protocol moeten dus steriel zijn.
Tijdens de operatie worden de eierstokken gescheiden in ongeveer een centimeter dikke weefselmonsters met een nieuw steriel pincet. Vermijd het aanraken van iets anders tijdens de hele procedure. Verwijder na scheiding het monster in een steriele buis en doe het in vloeibare stikstof voor overdracht.
Bewaar monsters in min 80 graden Celsius. Fixeer weefsels door formaline en sluit ze vervolgens in door paraffine. Dit protocol kan hier worden gepauzeerd.
De weefsels kunnen op kamertemperatuur worden gehouden voor een langere conservering. Om verdere stappen uit te voeren, snijdt u de monsters in vijf micrometer seriële secties. Droog vervolgens de monsters.
Doe de-paraffine en rehydratatie naar de monsters. Om antigeen terug te halen, is een microgolfbehandeling van 10 minuten in EDTA-buffer nodig. Dompel de monsters in PBS dat 0,3% waterstof bevat.
Peroxideer gedurende 20 minuten om de endogene peroxidase-activiteit te stoppen. Voer het antilichaam EMA uit in de LPS-kern, in een concentratie van 1 boven de 300. En houd het een nacht vol bij vier graden Celsius.
Om de bacteriën te ontdekken, gebruikt u een DAP-substraatkit om het bestaan van HRP te detecteren. Gebruik op basis van de instructies van een fabrikant HRP-polymeer, anti-konijnantilichaam. Gebruik de tafelconcentrator om antilichamen volledig te laten combineren.
Gebruik PBS om ongecombineerde antilichamen te elimineren. Voer uw chemische kleuring uit volgens de instructies van de fabrikant en spoel de monsters vervolgens onder water. Doe uitdroging aan de monsters.
Pakmonsters door ondertekening. En voer in als een voorbeeld met behulp van imaging Pro Plus Prepare-bibliotheek op basis van het protocol van de fabrikant. Oefen het primerpatroon, dat bestaat uit de genspecifieke sequenties en de Illumina-adapter overhang nucleotidesequenties.
Om de geboortecijfers voor het V4-gebied van bacteriële 16's op rRNA-gensequenties te versterken, versterkt u de sjabloon van de DNA-monsterinvoer met behulp van amplicon PCR. Gebruik Mag-Bind RxNPure Plus magnetische kralen om de reactiemix uit het PCR-product te verwijderen. Voer geïndexeerde PCR-versterking voor een tweede keer uit.
Gebruik Agilent 2200 TapeStation om de bibliotheek te controleren. Gebruik QuantiFluor dsDNA System om de bibliotheek te kwantificeren. Met een 600-cyclus produceert de v3-standaardstroomcel ongeveer 100.000 gepaarde uiteinden.
2 keer 300 basis 3. Bibliotheken worden gedenormaliseerd, gepoold en gesequenced. De ruwe snelheden van elk monster worden gefiltreerd op basis van sequencingkwaliteit door Trimmomatic.
De primer- en adaptersequenties moeten beide worden verwijderd. Sequentiele afgelezen met zowel paar als kwaliteiten lager dan 25 moeten worden ingekort. Analyseer het 16s rRNA door het softwarepakket QIIME.
Verzamel sequenties om OTA's te vormen met een gelijkenis-cutoff bij 97% Voor OTA's moet de relatieve abundantie in elk monster worden berekend. Gebruik een Bayesiaanse classificator, die in de RDP-trainingsset zit om alle sequenties te sorteren. Met gegeven OTU wordt een classificatie die de belangrijkste samenhang van de sequenties heeft, toegewezen aan OTU's.
De OTA's zijn afgestemd op de Silva-database en zijn gebaseerd op een voorbeeldgroepinformatie. Voer alfadiversiteit en de uniFrac-gebaseerde hoofdcoördinatenanalyse uit. Om de presentatie van de kenmerken van de bacteriën te voorspellen, gebruikt u BugBase.
Voorspel de functionele samenstelling van een metagenoom bij PICRUSt. Met behulp van monitoringgegevens en een database met referentiegenomen, analyseert u de verschillende functies tussen elke groep met behulp van STAMP-software. Gebruik één statistische software om het resultaat te berekenen.
De indicatie van statistische significantie moet worden vastgesteld op p minder dan 0,05. Bereken verstorende factoren, waaronder leeftijd en pariteit, door de t-test van student. Bereken de menopauzale status, geschiedenis van hypertensie en diabetes door de Chi-kwadraattest.
Bereken het aantal taxa van eierstokbacteriën met de Mann-Whitney U-test. 16 patiënten werden opgenomen in deze studie. BugBase werd gebruikt om de analyse van voorspelde metagenomen te oefenen.
De potentieel pathogenetische en immunohistochemie van eierstokken met behulp van antibacterieel LPS-antilichaam. Deze figuur toont bacteriële rijkdom en diversiteit in de kanker- en controlegroepen. Onthuld door 16S rRNA sequencing.
De cijfers zijn geobserveerde soortenindex. Chao1 index, ACE index, Shannon index, Evenness index, Simpson index, respectievelijk. De relatieve abundantie van phyla en de 12 meest voorkomende bacteriesoorten in de ovariële monsters wordt weergegeven in deze figuur.
Figuur A, B, C en D.Betekent de relatieve abundantie van het panel in de eierstokken van de patiënten in de controlegroep en de eierstokkankergroep. De relatieve abundanties van de twaalf meest voorkomende bacteriesoorten in de eierstokken van de controlepatiënten en eierstokkankergroep. Dit komt vaak voor, geclusterd met behulp van PCoA en de relatieve abundantie van Anoxynatronum sibiricum en Methanosarcina vacuolata.
Figuur A toont de commonests, die werden geclusterd met behulp van PCoA. PC1 en PC2 zijn uitgezet op x en de y-as. Het rode blok is gelijk aan het monster in de groep eierstokkanker.
De blauwe cirkel is gelijk aan een steekproef in de controlegroep. De monsters van de eierstokkankergroep kunnen worden gescheiden van andere monsters in de controlegroep. Figuur B toont commonests die geclusterd waren met behulp van PCoA.
PC1 en PC2 zijn uitgezet op de x- en y-as. Het rode blok is gelijk aan een monster in de groep eierstokkanker. De blauwe ononderbroken cirkel is gelijk aan een monster van de patiënt met baarmoeder myoma.
En de blauwe holle cirkel is gelijk aan een monster van een patiënt met baarmoederade-adenomyose. Figuur C toont de relatieve abundantie van Anoxynatronum sibiricum. Figuur D is Methanosarcina vacuolata.
Dit cijfer is de BugBase-analyse van voorspelde metagenomica. Het potentieel pathogenetische en oxidatieve stresstolerantiefenotype van de eierstokken in de kankergroep was sterker dan dat van de controlegroep. Dit cijfer is significant verschillend KEGG pad ruimte tussen de kanker en controlegroepen door PICRUSt analyse.
Wanneer we onze monsters krijgen, is een nieuw steriel pincet nodig. Let op mogelijke besmetting van de monsters. Dat bacteriën off-site tumorweefsels de oplossing sterk kunnen beïnvloeden.
Het instellen van de controlegroep voor elke stap heeft de voorkeur. Om het effect van mogelijke besmetting te verminderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol is ontworpen om bacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokwefsels in situ te ontdekken en onderscheiden. Immunohistochemisch kleuring en 16S rRNA-sequencing worden gebruikt om de compositorische en functionele verschillen van de bacteriën te voorspellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Oncologie
- Immunologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de bacteriële samenstelling in eierstokwefsels kan inzicht geven in de kankerbiologie.
- Immunohistochemisch kleuring maakt het mogelijk om bacteriën in weefselmonsters te visualiseren.
- 16S rRNA-sequencing is een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van bacteriesoorten.
- Predictieve tools zoals BugBase en PICRUSt kunnen bacteriële functies afleiden op basis van hun genetische informatie.
Doel van het onderzoek
- Om bacteriën uit eierstokwefsels te extraheren en te identificeren.
- Om bacteriële populaties in kankerachtige versus niet-kankerachtige weefsels te vergelijken.
- Om de functionele rollen van geïdentificeerde bacteriën te voorspellen.
Gebruikte methoden
- Immunohistochemisch kleuring voor weefselvisualisatie.
- 16S rRNA-gen sequencing voor bacteriële identificatie.
- BugBase voor het voorspellen van bacteriële samenstelling.
- PICRUSt voor het voorspellen van functionele verschillen tussen bacteriën.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van verschillende bacteriële populaties in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokwefsels.
- Functionele voorspellingen wijzen op verschillen in metabole capaciteiten tussen de twee weefseltypen.
- Het protocol is aanpasbaar voor gebruik met verschillende tumortypen.
Conclusies
- Deze studie biedt een raamwerk voor het begrijpen van de rol van bacteriën bij eierstokkanker.
- De methoden zijn toegankelijk en kunnen in de meeste laboratoria worden geïmplementeerd.
- Verder onderzoek kan de implicaties van deze bacteriegemeenschappen bij kankerprogressie onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding microbial presence in ovarian tissues addresses a growing need to de-risk cancer target hypotheses by revealing microenvironmental factors that may influence tumor biology. This protocol enables biopharma R&D to assess bacterial contributions to oncogenic pathways, supporting mechanistic insight in early discovery. By providing a standardized method to detect and functionally predict tissue-associated microbes, it aids in prioritizing targets with stronger translational confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates tumor microenvironment hypotheses by identifying bacteria differentially abundant in cancerous versus non-cancerous ovarian tissues.
- Operational Value: Uses immunohistochemistry and 16S rRNA sequencing to spatially resolve and quantify bacterial presence in situ.
- Predictive Value: Employs BugBase and PICRUSt to infer functional phenotypes, such as pathogenicity and oxidative stress tolerance, linked to cancer phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable 16S rRNA sequencing outputs suitable for comparative microbial profiling across sample groups.
- Reproducibility: Incorporates contamination controls and sterile tissue handling to ensure reliable detection of true tissue-associated signals.
- Scalability: Compatible with high-throughput sequencing and bioinformatics pipelines for broader application across tumor types.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Detects microbial signatures in human ovarian cancer tissues, supporting relevance to human pathophysiology.
- Translational Continuity: Enables longitudinal tracking of microbial shifts from normal to malignant states, informing biomarker discovery.
- Mechanistic De-risking: Predicts functional microbial contributions (e.g., metabolic pathways) that may modulate tumor progression or therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation to preclinical validation, particularly in immuno-oncology and microenvironment-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing whether specific bacteria are enriched in tumor tissues and associated with cancer phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microbial profiling data that can be integrated with multi-omics datasets for target prioritization.
- Analytics: Provides functional predictions via BugBase and PICRUSt, enabling comparison of metabolic and phenotypic potentials between groups.
- Translational Research: Connects microbial detection to cancer biology through differential abundance and functional inference in patient-derived tissues.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other solid tumors, allowing cross-cancer microbiome studies using a standardized workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking microbial presence to functional phenotypes in cancer-relevant pathways.
- Operational Value: Employs accessible techniques (IHC, 16S sequencing, bioinformatics) feasible in most research laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying microbial confounders or modulators of tumor biology early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target selection by accounting for microenvironmental variables that may affect drug efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, molecular biology, and bioinformatics for sequencing and functional prediction.
- Necessitates sterile tissue handling, PCR equipment, sequencing platforms, and tools like QIIME, Trimmomatic, and STAMP.
- Demands standardized protocols across sites to minimize contamination and ensure comparability of microbial data.
- Must account for host tissue variability and low biomass challenges when applying to other organ systems.
- Limited by detection sensitivity in low-abundance communities and dependence on reference databases for functional inference.
