Karakterisering en functionele voorspelling van bacteriën in eierstokweefsels
23 oktober 2021
Immunohistochemische kleuring en 16S ribosomale RNA-gen (16S rRNA-gen) sequencing werden uitgevoerd om bacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels in situ te ontdekken en te onderscheiden. De samenstellings- en functionele verschillen van de bacteriën werden voorspeld met behulp van BugBase en Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).
Dit protocol is ontworpen om bacteriën in eierstokweefsels te ontdekken en hun functies te voorspellen. Immunohistochemische kleuring en 16S rRNA-sequencing werden gebruikt om bacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels in situ te ontdekken en te onderscheiden. De compenserende en functionele verschillen van de bacteriën worden voorspeld met behulp van BoPs en cellulair-genetisch onderzoek van gemeenschappen door reconstructie van niet-geobserveerde dagen.
Ons protocol is gericht op het extraheren van bacteriën uit eierstokweefsels in situ. Het kan ook worden gebruikt om bacteriën in tumoren van welke aard dan ook te ontdekken. De belangrijkste voordelen van ons protocol zijn dat het gemakkelijk en handig is, dat het in bijna elk lab kan worden gerealiseerd.
Het is ook snel om de resultaten te krijgen. Tijdens het oefenen in het protocol is het belangrijk om bacteriën off-site tumorweefsels uit te sluiten. Alle procedures in dit protocol moeten dus steriel zijn.
Tijdens de operatie worden de eierstokken gescheiden in ongeveer een centimeter dikke weefselmonsters met een nieuw steriel pincet. Vermijd het aanraken van iets anders tijdens de hele procedure. Verwijder na scheiding het monster in een steriele buis en doe het in vloeibare stikstof voor overdracht.
Bewaar monsters in min 80 graden Celsius. Fixeer weefsels door formaline en sluit ze vervolgens in door paraffine. Dit protocol kan hier worden gepauzeerd.
De weefsels kunnen op kamertemperatuur worden gehouden voor een langere conservering. Om verdere stappen uit te voeren, snijdt u de monsters in vijf micrometer seriële secties. Droog vervolgens de monsters.
Doe de-paraffine en rehydratatie naar de monsters. Om antigeen terug te halen, is een microgolfbehandeling van 10 minuten in EDTA-buffer nodig. Dompel de monsters in PBS dat 0,3% waterstof bevat.
Peroxideer gedurende 20 minuten om de endogene peroxidase-activiteit te stoppen. Voer het antilichaam EMA uit in de LPS-kern, in een concentratie van 1 boven de 300. En houd het een nacht vol bij vier graden Celsius.
Om de bacteriën te ontdekken, gebruikt u een DAP-substraatkit om het bestaan van HRP te detecteren. Gebruik op basis van de instructies van een fabrikant HRP-polymeer, anti-konijnantilichaam. Gebruik de tafelconcentrator om antilichamen volledig te laten combineren.
Gebruik PBS om ongecombineerde antilichamen te elimineren. Voer uw chemische kleuring uit volgens de instructies van de fabrikant en spoel de monsters vervolgens onder water. Doe uitdroging aan de monsters.
Pakmonsters door ondertekening. En voer in als een voorbeeld met behulp van imaging Pro Plus Prepare-bibliotheek op basis van het protocol van de fabrikant. Oefen het primerpatroon, dat bestaat uit de genspecifieke sequenties en de Illumina-adapter overhang nucleotidesequenties.
Om de geboortecijfers voor het V4-gebied van bacteriële 16's op rRNA-gensequenties te versterken, versterkt u de sjabloon van de DNA-monsterinvoer met behulp van amplicon PCR. Gebruik Mag-Bind RxNPure Plus magnetische kralen om de reactiemix uit het PCR-product te verwijderen. Voer geïndexeerde PCR-versterking voor een tweede keer uit.
Gebruik Agilent 2200 TapeStation om de bibliotheek te controleren. Gebruik QuantiFluor dsDNA System om de bibliotheek te kwantificeren. Met een 600-cyclus produceert de v3-standaardstroomcel ongeveer 100.000 gepaarde uiteinden.
2 keer 300 basis 3. Bibliotheken worden gedenormaliseerd, gepoold en gesequenced. De ruwe snelheden van elk monster worden gefiltreerd op basis van sequencingkwaliteit door Trimmomatic.
De primer- en adaptersequenties moeten beide worden verwijderd. Sequentiele afgelezen met zowel paar als kwaliteiten lager dan 25 moeten worden ingekort. Analyseer het 16s rRNA door het softwarepakket QIIME.
Verzamel sequenties om OTA's te vormen met een gelijkenis-cutoff bij 97% Voor OTA's moet de relatieve abundantie in elk monster worden berekend. Gebruik een Bayesiaanse classificator, die in de RDP-trainingsset zit om alle sequenties te sorteren. Met gegeven OTU wordt een classificatie die de belangrijkste samenhang van de sequenties heeft, toegewezen aan OTU's.
De OTA's zijn afgestemd op de Silva-database en zijn gebaseerd op een voorbeeldgroepinformatie. Voer alfadiversiteit en de uniFrac-gebaseerde hoofdcoördinatenanalyse uit. Om de presentatie van de kenmerken van de bacteriën te voorspellen, gebruikt u BugBase.
Voorspel de functionele samenstelling van een metagenoom bij PICRUSt. Met behulp van monitoringgegevens en een database met referentiegenomen, analyseert u de verschillende functies tussen elke groep met behulp van STAMP-software. Gebruik één statistische software om het resultaat te berekenen.
De indicatie van statistische significantie moet worden vastgesteld op p minder dan 0,05. Bereken verstorende factoren, waaronder leeftijd en pariteit, door de t-test van student. Bereken de menopauzale status, geschiedenis van hypertensie en diabetes door de Chi-kwadraattest.
Bereken het aantal taxa van eierstokbacteriën met de Mann-Whitney U-test. 16 patiënten werden opgenomen in deze studie. BugBase werd gebruikt om de analyse van voorspelde metagenomen te oefenen.
De potentieel pathogenetische en immunohistochemie van eierstokken met behulp van antibacterieel LPS-antilichaam. Deze figuur toont bacteriële rijkdom en diversiteit in de kanker- en controlegroepen. Onthuld door 16S rRNA sequencing.
De cijfers zijn geobserveerde soortenindex. Chao1 index, ACE index, Shannon index, Evenness index, Simpson index, respectievelijk. De relatieve abundantie van phyla en de 12 meest voorkomende bacteriesoorten in de ovariële monsters wordt weergegeven in deze figuur.
Figuur A, B, C en D.Betekent de relatieve abundantie van het panel in de eierstokken van de patiënten in de controlegroep en de eierstokkankergroep. De relatieve abundanties van de twaalf meest voorkomende bacteriesoorten in de eierstokken van de controlepatiënten en eierstokkankergroep. Dit komt vaak voor, geclusterd met behulp van PCoA en de relatieve abundantie van Anoxynatronum sibiricum en Methanosarcina vacuolata.
Figuur A toont de commonests, die werden geclusterd met behulp van PCoA. PC1 en PC2 zijn uitgezet op x en de y-as. Het rode blok is gelijk aan het monster in de groep eierstokkanker.
De blauwe cirkel is gelijk aan een steekproef in de controlegroep. De monsters van de eierstokkankergroep kunnen worden gescheiden van andere monsters in de controlegroep. Figuur B toont commonests die geclusterd waren met behulp van PCoA.
PC1 en PC2 zijn uitgezet op de x- en y-as. Het rode blok is gelijk aan een monster in de groep eierstokkanker. De blauwe ononderbroken cirkel is gelijk aan een monster van de patiënt met baarmoeder myoma.
En de blauwe holle cirkel is gelijk aan een monster van een patiënt met baarmoederade-adenomyose. Figuur C toont de relatieve abundantie van Anoxynatronum sibiricum. Figuur D is Methanosarcina vacuolata.
Dit cijfer is de BugBase-analyse van voorspelde metagenomica. Het potentieel pathogenetische en oxidatieve stresstolerantiefenotype van de eierstokken in de kankergroep was sterker dan dat van de controlegroep. Dit cijfer is significant verschillend KEGG pad ruimte tussen de kanker en controlegroepen door PICRUSt analyse.
Wanneer we onze monsters krijgen, is een nieuw steriel pincet nodig. Let op mogelijke besmetting van de monsters. Dat bacteriën off-site tumorweefsels de oplossing sterk kunnen beïnvloeden.
Het instellen van de controlegroep voor elke stap heeft de voorkeur. Om het effect van mogelijke besmetting te verminderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol is ontworpen om bacteriën in situ te ontdekken en te onderscheiden in kankereuze en niet-kankereuze eierstokweefsels. Immunohistochemische kleuring en 16S rRNA-sequencing worden gebruikt om de compositionele en functionele verschillen van de bacteriën te voorspellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Oncologie
- Immunologie
Achtergrond
- Inzicht in de bacteriële samenstelling in eierstokweefsel kan bruikbare informatie bieden over de biologie van kanker.
- Immunohistochemische kleuring maakt het mogelijk om bacteriën in weefselmonsters te visualiseren.
- 16S rRNA-sequencing is een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van bacteriële soorten.
- Predictieve tools zoals BugBase en PICRUSt kunnen bacteriële functies afleiden op basis van hun genetische informatie.
Doel van de studie
- Om bacteriën uit eierstokweefsels te extraheren en te identificeren.
- Om bacteriële populaties in kankereuze versus niet-kankereuze weefsels te vergelijken.
- Om de functionele rollen van geïdentificeerde bacteriën te voorspellen.
Gebruikte methoden
- Immunohistochemische kleuring voor weefselvisualisatie.
- 16S rRNA-gensequencing voor bacteriële identificatie.
- BugBase voor het voorspellen van de bacteriële samenstelling.
- PICRUSt voor het voorspellen van functionele verschillen tussen bacteriën.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van verschillende bacteriële populaties in kankereuze en niet-kankereuze eiersteweefsels.
- Functionele voorspellingen wijzen op verschillen in metabole vermogens tussen de twee weefseltypen.
- Het protocol is aanpasbaar voor gebruik bij diverse tumortypen.
Conclusies
- Deze studie biedt een kader voor het begrijpen van de rol van bacteriën bij eierstokkanker.
- De methoden zijn toegankelijk en kunnen in de meeste laboratoria worden geïmplementeerd.
- Verder onderzoek kan de implicaties van deze bacteriële gemeenschappen voor de progressie van kanker verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Het begrijpen van de microbiële aanwezigheid in eierstokweefsels beantwoordt een groeiende behoefte om hypothesen over kankerdoelwitten te stroomlijnen door micro-omgevingsfactoren te onthullen die de tumobiologie kunnen beïnvloeden. Dit protocol stelt biopharma R&D in staat om de bijdrage van bacteriën aan oncogene pathways te beoordelen, wat mechanistische inzichten in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Door een gestandaardiseerde methode te bieden om weefselgeassocieerde microben te detecteren en functioneel te voorspellen, helpt het bij het prioriteren van doelwitten met een sterker translationeel vertrouwen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt hypothesen over de tumoromgeving door bacteriën te identificeren die verschillend overvloedig aanwezig zijn in kankerstweefsel versus niet-kankereus eierstokweefsel.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van immunohistochemie en 16S rRNA-sequencing om de bacteriële aanwezigheid in situ ruimtelijk op te lossen en te kwantificeren.
- Predictieve waarde: Maakt gebruik van BugBase en PICRUSt om functionele fenotypes af te leiden, zoals pathogeniteit en tolerantie voor oxidatieve stress, die gekoppeld zijn aan kankerfenotypes.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaar voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, kwantificeerbare 16S rRNA sequencing-outputs die geschikt zijn voor vergelijkende microbiële profilering over verschillende monstergroepen heen.
- Reproduceerbaarheid: Bevat controles voor contaminatie en steriele weefselverwerking om een betrouwbare detectie van werkelijke weefselgeassocieerde signalen te garanderen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met high-throughput sequencing en bioinformatica-pipelines voor bredere toepassing over diverse tumortypes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Detecteert microbiële signaturen in menselijke eierstokkankerweefsels, wat de relevantie voor de menselijke pathofysiologie ondersteunt.
- Translationele continuïteit: Maakt longitudinale tracking van microbiële verschuivingen van normale naar maligne toestanden mogelijk, wat bijdraagt aan de ontdekking van biomarkers.
- Mechanische risicoreductie: Voorspelt functionele microbiële bijdragen (bijv. metabole routes) die de tumorprogressie of therapeutische respons kunnen moduleren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-hypothesegeneratie tot preklinische validatie, in het bijzonder bij immuno-oncologie en programma's die gericht zijn op de micro-omgeving.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van hypothesen door onthulling van vraagstukken of specifieke bacteriën verrijkt zijn in tumorweefsels en geassocieerd zijn met kankerfenotypen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve microbiële profileringsgegevens die kunnen worden geïntegreerd met multi-omics-datasets voor targetprioritering.
- Analytica: Biedt functionele voorspellingen via BugBase en PICRUSt, waardoor vergelijking van metabolische en fenotypische potentialen tussen groepen mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt microbiële detectie met kankerbiologie via differentiële abundantie en functionele inferentie in weefsels afkomstig van patiënten.
- Bedrijfsmatig hergebruik: Aanpasbaar aan andere solide tumoren, wat cross-cancer microbioomstudies mogelijk maakt met behulp van een gestandaardiseerde workflow.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door microbiële aanwezigheid te koppelen aan functionele fenotypes in kanker-relevante pathways.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van toegankelijke technieken (IHC, 16S-sequencing, bio-informatica) die in de meeste onderzoekslaboratoria uitvoerbaar zijn.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig in het ontdekkingsproces microbiële confounders of modulatoren van de tumobiologie te identificeren.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde targetselectie mogelijk door rekening te houden met micro-omgevingsvariabelen die de effectiviteit van geneesmiddelen kunnen beïnvloeden.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in histologie, moleculaire biologie en bio-informatica voor sequencing en functionele voorspelling.
- Vraagt om steriele weefselverwerking, PCR-apparatuur, sequencing-platforms en tools zoals QIIME, Trimmomatic en STAMP.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen over verschillende locaties om contaminatie te minimaliseren en de vergelijkbaarheid van microbiële data te garanderen.
- Moet rekening houden met variabiliteit in gastheerweefsel en uitdagingen bij een lage biomassa bij toepassing op andere orgaansystemen.
- Beperkt door de detectiegevoeligheid in gemeenschappen met een lage abundantie en de afhankelijkheid van referentiedatabanken voor functionele inferentie.
