Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Het protocol combineert de kracht van het genereren van menselijke cardiovasculaire celtypen met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcellen en een veelzijdige techniek om kloppende cardiale sferoïden in minder dan 72 uur te genereren. Deze cardiale sferoïden kunnen worden gebruikt voor ziektemodellering en drugstests. Een van de belangrijkste voordelen van deze gemakkelijke techniek is dat men bijna 1000 kloppende cardiale sferoïden zou kunnen genereren in een standaard 12-well plaat.

En het belangrijkste is dat elke cardiale sferoïde kan worden getest op zijn contractiele functie met behulp van op beeldvorming gebaseerde techniek. Na het smelten van agarose in de magnetron, plaats het in de bioveiligheidskast en laat het drie minuten afkoelen. Pipetteer 700 microliter van de gesmolten agarose en voeg deze toe aan de siliconen micromold van een negen bij negen array, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bubbels ontstaan.

Plaats de mal voorzichtig op het pre-koude ijsblok om de agarose-duur te versnellen. Zodra de agarose doorschijnend wordt, buigt u voorzichtig de randen van de micromold om de agarose-replica te verliezen en pelt u de replica voorzichtig van alle kanten om deze los te maken van de siliconenmicromold. Breng de agarose microtissue tray met 81 cirkelvormige uitsparingen over in een steriele 12-well plaat, voeg vervolgens twee milliliter PBS toe aan de agarose microtissue tray en inspecteer deze onder de microscoop op opgesloten bubbels of onregelmatig gevormde putten.

Dompel de agarose-tray een nacht onder in twee milliliter 70% ethanol, gevolgd door een UV-behandeling in de bioveiligheidskast gedurende een uur. Verwijder de 70% ethanol en was tweemaal met gedestilleerd water en eenmaal met twee milliliter PBS. Zodra de geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen zijn geteld na trypsinisatie en neutralisatie, plaatst u de celsuspensies op het ijs.

Meng in een nieuwe buis de geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Verwijder vervolgens de PBS uit de put en de celzaaikamer zonder de uitsparingen aan te raken en voeg druppelsgewijs 200 microliter van de celsuspensie toe. Laat de cellen twee uur lang bij 37 graden Celsius bezinken in een kooldioxide-incubator.

Voeg microweefselfabricagemiddel toe rond de agarose-mal om het oppervlak van de binnenkamer te bedekken. Let na 24 uur op zelfgeassembleerde en compacte sferoïden in de cirkelvormige uitsparingen. Vervang het medium om de twee dagen om de sferoïden te behouden.

Meestal kan na 48 uur spontaan kloppen van de sferoïden worden waargenomen. Kweek de afzonderlijke celtypen afzonderlijk op het medium van de keldermembraanmatrix of met gelatine beklede kamerglaasjes. Spoel de cardiale microtissues voorzichtig uit de cirkelvormige uitsparingen en verzamel ze in een kroniekbuis van 15 milliliter.

Zuig het medium op en spoel de cellen of de microtissues met één milliliter PBS. Fixeer vervolgens de cellen of de microtissues met een fixatiebuffer met 4,2% PFA en incubeer bij kamertemperatuur. Zuig de PFA op en incubeer de cellen of de microtissues met één milliliter permeabiliserende oplossing.

Zuig vervolgens de oplossing aan en spoel af met twee tot drie milliliter PBS. Voeg 500 tot 1000 microliter blokkerende oplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende ten minste één uur voor de kamerglaasjes en gedurende drie tot vier uur voor de microtissues. Incubeer de monsters met geconjugeerde antilichamen in de blokkerende oplossing gedurende één uur voor de kamerglijbanen en 's nachts bij vier graden Celsius voor de cardiale microtissues.

Was de kamerglijden drie keer met 500 microliter van 0,1% Tween 20, met vijf minuten tussen elke wasbeurt, en voer vervolgens een laatste wasbeurt uit met PBS. Was de cardiale microweefsels vijf keer met twee milliliter van 0,1% Tween 20, met een duur van 20 minuten tussen elke wasbeurt. Voer vervolgens nog eens 20 minuten een laatste wasbeurt uit.

Incubeer de cellen of de microtissues met DAPI voorafgaand aan confocale microscopie, breng vervolgens de cardiale microtissues voorzichtig over naar een 35 millimeter glazen bodemschaal en voeg PBS toe om de microtissue onder te dompelen. Spoel de microtissues uit de ronde uitsparingen met medium één met behulp van een brede of één milliliter pipetpunt in een 15 milliliter chronical tube en laat ze bezinken. Aspiraleer vervolgens het medium en spoel af met één milliliter PBS.

Voeg 200 tot 300 microliter van de enzymverteringsbuffer toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Meng vervolgens de microtissues zachtjes gedurende één minuut en herhaal de incubatie. Meng na de incubatie de microtissues krachtig met een gewone pipetpunt van één milliliter om het in afzonderlijke cellen te verteren.

Verkrijg een troebele celsuspensie en neutraliseer de celsuspensie onmiddellijk met vijf milliliter medium dat 5% FBS bevat. Zeef de celsuspensie door een celzeef van 40 micrometer en tel het totale aantal cellen. Centrifugeer de eencellige suspensie gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op 300 maal G.

Zuig het supernatant op en resuspend de cellen in annexinebindende buffer met FITC Annexin V en propidiumjodide, of TO-PRO-3 dode cel uitsluitingskleurstof, en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Voeg na de incubatie 300 microliter van de annexinebindingsbuffer toe aan de celsuspensie en breng deze over naar een FACS-buis met ronde bodem voor flowcytometrie-analyse. Gezuiverde geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, endotheelcellen en cardiale fibroblasten werden gevisualiseerd met behulp van fasecontrastmicroscopie.

De zuiverheid van verschillende celtypen werd bepaald met behulp van immunokleuring en flowcytometrie. Troponine T werd gebruikt als marker voor cardiomyocyten en meer dan 90% zuiverheid werd bereikt. Het bloedplaatjes-endotheelceladhesiemolecuul CD31 en vimentine werden gebruikt als markers voor endotheelcellen en cardiale fibroblasten en gaven een zuiverheid aan van respectievelijk 98 en 96%.

Immunofluorescentiekleuring onthulde dat de cardiomyocyten het zwaarst waren en het centrum van de microtissues bezetten, terwijl de endotheelcellen werden afgewisseld door de microtissues en de cardiale fibroblasten voornamelijk de periferie bezetten. De vertering van de microtissues met behulp van dit tempo één en Liberase TL resulteerde in zeer levensvatbare celverhoudingen met minder apoptotische cellen na twee weken in cultuur. De één uur blootstelling van de cardiale microtissues aan een hoge concentratie doxorubicine geïnduceerde dosisafhankelijke cardiotoxiciteit.

De contractiliteit van de microweefsels en de beweging van de vectoren genereerden een pseudo-heatmap die het gemiddelde contractieprofiel over de microtissue illustreerde. De contractiele beweging van de cardiale microtissues genereerde positieve pieken die werden gemeten als de contractiesnelheid, de relaxatiesnelheid en de slagsnelheid, die werd berekend als tijd de tussen twee contractiecycli. De contractiliteit van de cardiale microtissues was consistent gedurende vier weken in cultuur.

Celverwarming is een van de belangrijkste stappen in dit specifieke protocol, waarbij men ervoor moet zorgen dat de celsuspensie druppelsgewijs in de agarose-array wordt gedoseerd voor een gelijkmatige verdeling binnen de microwells en om overloop te voorkomen. Met behulp van het geoptimaliseerde stralingsprotocol van deze microtissues, zou men deze kunnen onderwerpen aan high throughput sequencing-technologieën, zoals single cell RNA-seq of single cell ATAC-seq om celspecifieke genexpressiepatronen te begrijpen die het gevolg zijn van verschillende behandelingsomstandigheden.