Labelvrije kwantitatieve proteomics workflow voor discovery-driven host-pathogen interacties
October 20th, 2020
Hier presenteren we een protocol om het samenspel tussen gastheer en ziekteverwekker te profileren tijdens infectie door op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Dit protocol maakt gebruik van labelvrije kwantificering om veranderingen in eiwitrijkdom van zowel gastheer (bijv. macrofagen) als ziekteverwekker (bijv. Cryptococcus neoformans)in één experiment te meten.
Ons protocol onderzoekt schimmelinfecties zowel vanuit het perspectief van de gastheer als van de ziekteverwekker om interacties tussen de biologische systemen te identificeren die cruciaal zijn voor een ziekte. We kunnen zowel schimmel- als gastheereiwitten in één experiment detecteren en schimmeleiwitten identificeren die alleen tijdens infectie worden geproduceerd, wat nieuwe infectie-geassocieerde eiwitten vertegenwoordigt. Hoewel we ons concentreren op de behandeling van schimmelinfecties door nieuwe anti-virulente behandelingsstrategieën te ontdekken, is onze proteomics- en bioinformaticapipeline universeel en kan deze worden toegepast op veel biologische systemen.
Onze aanpak legt de basis voor studies van verschillende ziekteverwekkers en talrijke immuunresponsen en kan worden gebruikt om nieuwe inzichten te verkrijgen in de relatie tussen cryptococcus en het aangeboren immuunsysteem. De macrofaagrespons op ziekteverwekkers en het detecteren van voldoende schimmeleiwitten zijn belangrijk. Daarom worden het testen en optimaliseren van MOI's en tijdstippen voor elke soort aanbevolen.
Omdat macrofaag- en schimmelcelcultuur uitdagend kan zijn, is het belangrijk te weten wat te verwachten is na cocultuur. Visualisatie geeft de onderzoeker vertrouwen bij het implementeren van de procedure. Om schimmelcellen voor te bereiden op een macrofaaginfectie, verzamel en centrifugeer C neoformans-cellen uit een midden-lange fasecultuur, gevolgd door drie zachte wasbeurten met één milliliter PBS op kamertemperatuur onder dezelfde centrifugecondities.
Na de laatste wassing, resuspendeer de schimmelcellen in een concentratie van 1,2 keer 10 tot de achtste cellen per milliliter van antibioticumvrij celkweekmedium en voeg één milliliter schimmelcelsuspensie toe aan elk van de vier putjes van een 70% tot 80% confluente zesputjes macrofaagcultuurplaat. Plaats vervolgens de plaat gedurende drie uur in de celkweekincubator. Kantel de plaat voorzichtig om elk putje drie keer voorzichtig te wassen met één milliliter PBS per putje per wasbeurt.
Om de infectieproficientie na de laatste wassing te meten, voeg één milliliter antibioticumvrij medium toe aan elk putje van de zesputjesplaat en plaats de plaat in de celkweekincubator. Op de juiste experimentele tijdstippen, verzamel het supernatant van elk putje en meet de hoeveelheid LDH in elk putje volgens standaardprotocollen. Op dezelfde tijdstippen, lyseer de niet-geïnfecteerde macrofaagcellen om de waarde voor maximale cytotoxiciteit te bepalen.
De cytotoxiciteit kan vervolgens worden berekend met behulp van de formule zoals aangegeven. Voor het verzamelen en co-cultiveren van niet-geïnfecteerde macrofagen, voeg één milliliter koud PBS toe aan elk putje van niet-geïnfecteerde macrofagen. Na één minuut, tik voorzichtig op de plaat om de cellen los te maken van de bodem van de putjes en verzamel de celsuspensies in één 15 milliliter buis.
Verzamel de cellen door centrifugatie en verwijder volledig het supernatant om direct flash-freezing van het pellet in vloeibare stikstof te kunnen uitvoeren voor opslag bij minuus 80 graden. Hoofdcomponentenanalyse van het proces op datasets onthult dat, zoals verwacht, de grootste component van scheiding tussen de gegevens geïnfecteerde versus niet-geïnfecteerde monsters is. Het tweede onderscheidende kenmerk van de monsters is hun biologische variabiliteit.
Het combineren van een Pearson-correlatie met hiërarchische clustering door middel van Euclidische afstand toont een duidelijke clustering van geïnfecteerde versus niet-geïnfecteerde monsters met een replicaatreproduceerbaarheid variërend van 95% tot 96%. Een Student's T-test gecorrigeerd voor meervoudige hypothesetesten met behulp van een Benjamini-Hochberg False Discovery Rate kan worden uitgevoerd om eiwitten met significante verschillen in abundantie tijdens infectie te identificeren in vergelijking met niet-geïnfecteerde controles. In deze analyse werden 117 gastheereiwitten geïdentificeerd die een significante verandering in expressie bij infectie vertoonden. Opmerkelijk is dat er ook significante toenames in de abundantie van schimmeleiwitten werden waargenomen, zoals verwacht tijdens infectie.
Het is belangrijk om voorzichtig om te gaan met de macrofagen tijdens cocultiveren, wassen en monsterverzameling. Door te definiëren hoe de ziekteverwekker zich aanpast aan de gastheer en hoe de gastheer zich verdedigt tegen infectie, worden nieuwe inzichten verkregen in de velden van microbiologie en immunologie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol onderzoekt het samenspel tussen gastheer en pathogeen tijdens een schimmelinfectie met behulp van massaspectrometrie-gebaseerde proteomics. Het maakt de detectie van zowel gastheer- als pathogeen-eiwitten in één experiment mogelijk en biedt inzichten in infectie-geassocieerde eiwitten.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Besmettelijke ziektes
- Proteomics
Achtergrond
- Het begrijpen van gastheer-pathogeen interacties is cruciaal voor ziekteonderzoek.
- Schimmelinfecties vormen aanzienlijke gezondheidsrisico's, waardoor nieuwe behandelingsstrategieën noodzakelijk zijn.
- Proteomics kan veranderingen in eiwitovervloed tijdens infectie onthullen.
- Macrofagen spelen een sleutelrol in de immuunrespons op pathogenen.
Doel van het onderzoek
- Om de interacties tussen gastheer-macrofagen en het pathogeen Cryptococcus neoformans te profileren.
- Om nieuwe infectie-geassocieerde eiwitten die tijdens schimmelinfectie worden geproduceerd te identificeren.
- Om een universele proteomics- en bioinformatica-pipeline op te zetten die op verschillende biologische systemen toepasbaar is.
Gebruikte methoden
- Massaspectrometrie-gebaseerde proteomics voor eiwitdetectie.
- Label-vrije kwantificering om veranderingen in eiwitovervloed te meten.
- Optimalisatie van multiplicity of infection (MOI) en tijdstippen voor nauwkeurige resultaten.
- Bioinformatica-analyse om proteomische gegevens te interpreteren.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van schimmeleiwitten die specifiek tijdens infectie worden geproduceerd.
- Inzichten in de macrofaagrespons op Cryptococcus neoformans.
- Een raamwerk voor het onderzoeken van verschillende pathogenen en immuunresponsen.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van het protocol op verschillende biologische systemen.
Conclusies
- Het protocol biedt een uitgebreide aanpak voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties.
- Het legt de basis voor toekomstig onderzoek naar schimmelinfecties en immuunresponsen.
- Verdere optimalisatie van experimentele omstandigheden wordt aanbevolen voor verschillende soorten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This label-free quantitative proteomics workflow enables simultaneous profiling of host and pathogen proteomes during infection, providing unbiased protein abundance data critical for target validation in infectious disease research. By identifying infection-associated fungal proteins and host response signatures, the method supports mechanistic de-risking of anti-virulence strategies and informs preclinical target selection. Its transferability across host-pathogen systems enhances portfolio-wide applicability for antifungal and immunomodulatory discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying pathogen proteins exclusively produced during infection, representing novel virulence-associated targets.
- Scientific Value: Clarifies host-pathogen interaction pathways through correlated abundance changes in both proteomes, supporting functional target validation.
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing quantitative, reproducible infection-state proteomic profiles for de-risking target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (infected macrophages) for downstream assay development with standardized infection conditions and MOI optimization.
- Operational Value: Generates quantitative, label-free proteomic outputs suitable for assay standardization and reproducibility assessment in screening campaigns.
- Operational Value: Supports scalable platform reuse across diverse pathogens due to the universal proteomics and bioinformatics pipeline design.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Identifies disease-relevant host proteins responding to microbial invasion, enabling biomarker alignment for preclinical validation.
- Translational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by linking infection-state proteomic shifts to pathogenic mechanisms.
- Translational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by highlighting proteins essential for virulence and host defense mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow integrates into early discovery biology through host-pathogen interaction profiling, supports screening readiness via standardized infection models, and enables translational research by connecting proteomic changes to virulence and immune response mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying infection-induced changes in both pathogen and host proteomes.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with optimized MOI and time points, ensuring reproducible infection models for compound evaluation.
- Analytics: Provides label-free quantitative measurements and statistical outputs (e.g., Benjamini-Hochberg corrected t-tests) to compare conditions and identify significantly altered proteins.
- Translational Research: Links proteomic signatures to pathogenic mechanisms and host defense responses, supporting biomarker discovery and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics and bioinformatics pipeline applicable to multiple pathogens and immune systems, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through unbiased, quantitative infection-state proteomic profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via optimized coculture, washing, and lysis protocols with validated QC metrics (PCA, clustering, 95-96% replicate reproducibility).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing critical virulence factors and host response networks, reducing late-stage biological risk in antifungal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on infection-specific protein expression and pathway involvement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian and fungal cell culture, proteomics sample preparation, and mass spectrometry data analysis.
- Dependent on access to LC-MS/MS instrumentation, label-free quantification software, and bioinformatics tools for PCA, clustering, and differential expression analysis.
- Necessitates cross-team standardization of infection parameters (MOI, time points) and sample handling to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations for different pathogen-host systems, including optimization of fungal cell preparation and macrophage confluency.
- Practical limitations include the technical challenge of detecting low-abundance fungal proteins amid high background host signals, requiring sufficient infection depth and sensitivity.
