Labelvrije kwantitatieve proteomics workflow voor discovery-driven host-pathogen interacties
20 oktober 2020
Hier presenteren we een protocol om het samenspel tussen gastheer en ziekteverwekker te profileren tijdens infectie door op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Dit protocol maakt gebruik van labelvrije kwantificering om veranderingen in eiwitrijkdom van zowel gastheer (bijv. macrofagen) als ziekteverwekker (bijv. Cryptococcus neoformans)in één experiment te meten.
Ons protocol onderzoekt schimmelinfecties zowel vanuit het perspectief van de gastheer als van de ziekteverwekker om interacties tussen de biologische systemen te identificeren die cruciaal zijn voor een ziekte. We kunnen zowel schimmel- als gastheereiwitten in één experiment detecteren en schimmeleiwitten identificeren die alleen tijdens infectie worden geproduceerd, wat nieuwe infectie-geassocieerde eiwitten vertegenwoordigt. Hoewel we ons concentreren op de behandeling van schimmelinfecties door nieuwe anti-virulente behandelingsstrategieën te ontdekken, is onze proteomics- en bioinformaticapipeline universeel en kan deze worden toegepast op veel biologische systemen.
Onze aanpak legt de basis voor studies van verschillende ziekteverwekkers en talrijke immuunresponsen en kan worden gebruikt om nieuwe inzichten te verkrijgen in de relatie tussen cryptococcus en het aangeboren immuunsysteem. De macrofaagrespons op ziekteverwekkers en het detecteren van voldoende schimmeleiwitten zijn belangrijk. Daarom worden het testen en optimaliseren van MOI's en tijdstippen voor elke soort aanbevolen.
Omdat macrofaag- en schimmelcelcultuur uitdagend kan zijn, is het belangrijk te weten wat te verwachten is na cocultuur. Visualisatie geeft de onderzoeker vertrouwen bij het implementeren van de procedure. Om schimmelcellen voor te bereiden op een macrofaaginfectie, verzamel en centrifugeer C neoformans-cellen uit een midden-lange fasecultuur, gevolgd door drie zachte wasbeurten met één milliliter PBS op kamertemperatuur onder dezelfde centrifugecondities.
Na de laatste wassing, resuspendeer de schimmelcellen in een concentratie van 1,2 keer 10 tot de achtste cellen per milliliter van antibioticumvrij celkweekmedium en voeg één milliliter schimmelcelsuspensie toe aan elk van de vier putjes van een 70% tot 80% confluente zesputjes macrofaagcultuurplaat. Plaats vervolgens de plaat gedurende drie uur in de celkweekincubator. Kantel de plaat voorzichtig om elk putje drie keer voorzichtig te wassen met één milliliter PBS per putje per wasbeurt.
Om de infectieproficientie na de laatste wassing te meten, voeg één milliliter antibioticumvrij medium toe aan elk putje van de zesputjesplaat en plaats de plaat in de celkweekincubator. Op de juiste experimentele tijdstippen, verzamel het supernatant van elk putje en meet de hoeveelheid LDH in elk putje volgens standaardprotocollen. Op dezelfde tijdstippen, lyseer de niet-geïnfecteerde macrofaagcellen om de waarde voor maximale cytotoxiciteit te bepalen.
De cytotoxiciteit kan vervolgens worden berekend met behulp van de formule zoals aangegeven. Voor het verzamelen en co-cultiveren van niet-geïnfecteerde macrofagen, voeg één milliliter koud PBS toe aan elk putje van niet-geïnfecteerde macrofagen. Na één minuut, tik voorzichtig op de plaat om de cellen los te maken van de bodem van de putjes en verzamel de celsuspensies in één 15 milliliter buis.
Verzamel de cellen door centrifugatie en verwijder volledig het supernatant om direct flash-freezing van het pellet in vloeibare stikstof te kunnen uitvoeren voor opslag bij minuus 80 graden. Hoofdcomponentenanalyse van het proces op datasets onthult dat, zoals verwacht, de grootste component van scheiding tussen de gegevens geïnfecteerde versus niet-geïnfecteerde monsters is. Het tweede onderscheidende kenmerk van de monsters is hun biologische variabiliteit.
Het combineren van een Pearson-correlatie met hiërarchische clustering door middel van Euclidische afstand toont een duidelijke clustering van geïnfecteerde versus niet-geïnfecteerde monsters met een replicaatreproduceerbaarheid variërend van 95% tot 96%. Een Student's T-test gecorrigeerd voor meervoudige hypothesetesten met behulp van een Benjamini-Hochberg False Discovery Rate kan worden uitgevoerd om eiwitten met significante verschillen in abundantie tijdens infectie te identificeren in vergelijking met niet-geïnfecteerde controles. In deze analyse werden 117 gastheereiwitten geïdentificeerd die een significante verandering in expressie bij infectie vertoonden. Opmerkelijk is dat er ook significante toenames in de abundantie van schimmeleiwitten werden waargenomen, zoals verwacht tijdens infectie.
Het is belangrijk om voorzichtig om te gaan met de macrofagen tijdens cocultiveren, wassen en monsterverzameling. Door te definiëren hoe de ziekteverwekker zich aanpast aan de gastheer en hoe de gastheer zich verdedigt tegen infectie, worden nieuwe inzichten verkregen in de velden van microbiologie en immunologie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol onderzoekt de interactie tussen gastheer en pathogeen tijdens een schimmelinfectie met behulp van proteomics op basis van massaspectrometrie. Het maakt de detectie van zowel gastheer- als pathogeeneiwitten in één enkel experiment mogelijk, wat inzicht geeft in infectie-geassocieerde eiwitten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Infectieziekten
- Proteomics
Achtergrond
- Het begrijpen van interacties tussen gastheer en pathogeen is essentieel voor ziekteonderzoek.
- Schimmelinfecties vormen aanzienlijke gezondheidsrisico's, waardoor nieuwe behandelstrategieën noodzakelijk zijn.
- Proteomics kan veranderingen in eiwitvloeibaarheid tijdens een infectie onthullen.
- Macrofagen spelen een sleutelrol in de immuunrespons op pathogenen.
Doel van de studie
- Om de interacties tussen gastheer-macrofagen en het pathogeen Cryptococcus neoformans te profileren.
- Om nieuwe infectie-geassocieerde eiwitten te identificeren die tijdens een schimmelinfectie worden geproduceerd.
- Om een universele proteomics- en bio-informatica-pijplijn op te stellen die toepasbaar is op diverse biologische systemen.
Gebruikte methoden
- Op massaspectrometrie gebaseerde proteomics voor eiwitdetectie.
- Labelvrije kwantificatie om veranderingen in eiwitovervloed te meten.
- Optimalisatie van de multipliciteit van infectie (MOI) en tijdspunten voor accurate resultaten.
- Bio-informatica-analyse voor de interpretatie van proteomische gegevens.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van schimmelproteïnen die specifiek tijdens infectie worden geproduceerd.
- Inzichten in de respons van macrofagen op Cryptococcus neoformans.
- Vestiging van een kader voor het bestuderen van diverse pathogenen en immuunresponsen.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van het protocol op verschillende biologische systemen.
Conclusies
- Het protocol biedt een uitgebreide aanpak voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties.
- Het legt de basis voor toekomstig onderzoek naar schimmelinfecties en immuunresponsen.
- Verdere optimalisatie van de experimentele condities wordt aanbevolen voor verschillende soorten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze labelvrije kwantitatieve proteomics-workflow maakt gelijktijdige profilering van de proteomen van gastheer en pathogeen tijdens infectie mogelijk, wat onbevooroordeelde gegevens over eiwitovervloed oplevert die cruciaal zijn voor doelwitvalidatie in onderzoek naar infectieziekten. Door infectie-geassocieerde schimmelproteïnen en gastheerrespons-signaturen te identificeren, ondersteunt de methode het mechanistische risicobeheer van anti-virulentiestrategieën en informeert het de preklinische selectie van doelwitten. De overdraagbaarheid naar verschillende gastheer-pathogeensystemen vergroot de toepasbaarheid binnen de gehele portfolio voor antifungalia- en immunomodulerende ontdekkingsprogramma's.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door pathogeeneiwitten te identificeren die uitsluitend tijdens de infectie worden geproduceerd, wat nieuwe virulentie-geassocieerde targets oplevert.
- Wetenschappelijke waarde: Verduidelijkt interactiepaden tussen gastheer en pathogeen via gecorreleerde abundantieveranderingen in beide proteomen, wat de functionele validatie van targets ondersteunt.
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische onzekerheid door kwantitatieve, reproduceerbare proteomische profielen van de infectiestatus te leveren voor het beperken van risico's bij target-hypothesen.
Screening & Assayontwikkeling
- Operationele waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen (geïnfecteerde macrofagen) voor op verdere assayontwikkeling met gestandaardiseerde infectiecondities en MOI-optimalisatie.
- Operationele waarde: Genereert kwantitatieve, labelvrije proteomische outputs die geschikt zijn voor assaystandaardisatie en reproduceerbaarheidsbeoordeling in screeningcampagnes.
- Operationele waarde: Ondersteunt schaalbare hergebruik van het platform voor diverse pathogenen dankzij het universele proteomics- en bio-informatica-pipeline-ontwerp.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Identificeert ziekte-relevante gastheerproteïnen die reageren op microbiële invasie, waardoor biomarker-afstemming voor preklinische validatie mogelijk wordt.
- Translationele waarde: Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinisch werk door proteomische verschuivingen in de infectiestatus te koppelen aan pathogene mechanismen.
- Translationele waarde: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door proteïnen te belichten die essentieel zijn voor virulentie en afweermechanismen van de gastheer.
Pipeline- & workflowintegratie
De workflow integreert in de vroege biologische ontdekkingsfase via profilering van gastheer-pathogeeninteracties, ondersteunt de screeningparaatheid via gestandaardiseerde infectiemodellen en maakt translationeel onderzoek mogelijk door proteomische veranderingen te koppelen aan virulentie- en immuunresponmechanismen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door infectie-geïnduceerde veranderingen in zowel het proteoom van de pathogeen als dat van de gastheer te kwantificeren.
- Screening: Levert assay-klare biologische systemen met geoptimaliseerde MOI en tijdspunten, wat zorgt voor reproduceerbare infectiemodellen voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt labelvrije kwantitatieve metingen en statistische output (bijv. t-testen gecorrigeerd via Benjamini-Hochberg) om condities te vergelijken en significant gewijzigde eiwitten te identificeren.
- Translationeel Onderzoek: Koppel proteomische signaturen aan pathogene mechanismen en afweerreacties van de gastheer, ter ondersteuning van biomarker-ontdekking en preklinische continuïteit.
- Herbruikbaarheid op Bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbare proteomics- en bio-informaticapijplijn die toepasbaar is op meerdere pathogenen en immuunsystemen, waardoor redundante methodeontwikkeling wordt verminderd.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door middel van onbevooroordeelde, kwantitatieve proteomische profilering van de infectiestatus.
- Operationele waarde: Verbeterde reproduceerbaarheid en standaardisatie via geoptimaliseerde coculture-, was- en lysisprotocollen met gevalideerde QC-metrieken (PCA, clustering, 95-96% reproduceerbaarheid van replica's).
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door kritieke virulentiefactoren en gastheerresponsnatwerken te onthullen, waardoor biologische risico's in een laat stadium binnen antifungale programma's worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van infectiespecifieke eiwitexpressie en pathway-betrokkenheid.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in zoogdier- en schimmelcelcultuur, monstervoorbereiding voor proteomica en data-analyse van massaspectrometrie.
- Afhankelijk van toegang tot LC-MS/MS-instrumentatie, software voor labelvrije kwantificering en bio-informatica-tools voor PCA, clustering en differentieel expressie-analyse.
- Vereist cross-team standaardisatie van infectieparameters (MOI, tijdspunten) en monsterbehandeling om reproduceerbaarheid tussen studies te waarborgen.
- Omvat aanpassingen voor verschillende pathogeen-gastheersystemen, inclusief optimalisatie van de schimmelcelpreparatie en de confluentie van macrofagen.
- Praktische beperkingen omvatten de technische uitdaging om schimmelproteïnen met een lage abundantie te detecteren te midden van sterke achtergrondsignalen van de gastheer, wat voldoende infectiediepte en sensitiviteit vereist.
